制備流感病毒的多質粒系統的制作方法
【專利摘要】本發明涉及在細胞培養物中生產適于重組流感病毒疫苗制備的流感病毒的載體和方法。本發明還涉及用在多質粒流感病毒表達系統中的雙向表達載體。
【專利說明】制備流感病毒的多質粒系統
[0001]本申請是2003.04.25提交的CN03815195.2，題為“制備流感病毒的多質粒系統”
的分案申請。
[0002]交叉參照相關申請
[0003]本申請要求下列申請的優先權和利益:2002年4月26日提交的美國臨時申請60/375，675 號；2002 年 7 月 9 日提交的 60/394，983 號；200 年 9 月 12 日提交的 60/410，576號；2002年10月18日提交的60/419,802號；2002年10月23日提交的60/420，708號；2003年3月24日提交的60/457，699號(代理人備案號26-000250US)；以及2003年4月10日提交的題為“制備流感病毒的多質粒系統”申請，其代理人備案號是26-000260US，每個申請的說明書都已完整納入本文作為參考。
[0004]發明背景
[0005]流感病毒由含分節的單鏈RNA基因組的內部核糖核蛋白核及外面的脂蛋白包膜組成，其中脂蛋白包膜由基質蛋白連在一起。A型流感病毒和B型流感病毒都含有8節段的負極性單鏈RNA。A型流感病毒基因組至少編碼11個多肽。節段1-3編碼3個多肽，組成病毒RNA依賴的RNA聚合酶。節段I編碼聚合酶復合物蛋白PB2。另外的聚合酶蛋白PBl和PA分別由節段2和節段3編碼。另外，某些A型流感病毒株的節段I還編碼一個小蛋白PB1-F2，是由PBl編碼區內的另一個閱讀框架產生的。節段4編碼血凝素(HA)表面糖蛋白，參與細胞粘附以及使病毒在感染期內進入細胞。節段5編碼核殼體核蛋白(NP)多肽，這是一種與病毒RNA相連的主要結構蛋白。節段6編碼神經酰胺酶(NA)包膜糖蛋白。節段7編碼兩種基質蛋白，被稱為Ml和M2，是由經不同方式剪接的mRNA翻譯的。節段8編碼NSl和NS2 (NEP)，這是兩種非結構蛋白，由經其他方式剪接的mRNA翻譯的。
[0006]B型流感病毒的8個基因組節段編碼11種蛋白。三個最大的基因編碼RNA聚合酶的組分PB1、PB2和PA。節段4編碼HA蛋白。節段5編碼NP。節段6編碼NA蛋白和NB蛋白。NB和NA蛋白都是由雙順反子mRNA的重疊閱讀框架翻譯的。B型流感病毒的節段7也編碼兩種蛋白:M1和BM2。最小的節段編碼兩種產物:NS1是由全長RNA翻譯的，NS2是由剪接的mRNA變體翻譯的。
[0007]制備出能產生特異性抗流感病毒保護性免疫反應的疫苗已經超過50年。這些疫苗包括全病毒疫苗、裂解病毒疫苗、表面抗原疫苗和減毒活疫苗。這些類型的疫苗中任何一種的合適制劑都可以產生系統免疫反應，而減毒活疫苗還可以在呼吸道內刺激局部粘膜免疫。
[0008]FluMist?是一種減毒活疫苗，可保護兒童和成人不患流感(Belshe等，(1998)，“冷適應的三價鼻內減毒活流感疫苗對兒童的效應”(The efficacy of live attenuated,cold-adapted, trivalent,intranasal influenza virus vaccine in children), N EnglJ Med338:1405-12 ;Nichol等，(1999)，“鼻內減毒活流感疫苗對健康的、工作的成年人的效應:隨機對照臨床試驗”(Effectiveness of live, attenuated intranasal influenzavirus vaccine in healthy, working adults: a randomized controlled trial),JAMA282:137-44)。FLUMIST疫苗株含有來源于當前流行的野生型病毒株的HA和NA基因節段及來源于普通主供體病毒(common master donor virus) (MDV)的六個基因節段:PBU PB2、PA、NP、M和NS。FluMist的A型流感病毒株的MDV(MDV-A)是在連續降低溫度的條件下在原代雞腎組織培養物中通過野生型A/Ann Arbor/6/60病毒株(A/AA/6/60)的系列傳代而得到的(Maassab (1967) “流感病毒在25°C時的適應和生長特性”(Adaptationand growth characteristics of influenza virus at25degrees C)Nature213:612-4)。MDV-A可在25 °C時有效復制(ca，冷適應)，但是其生長在38 °C和39 °C時受到抑制(ts，溫敏)。另外，這種病毒在被感染的雪貂肺內不能復制(att，減毒的)。這種溫敏表型相信是限制其在人呼吸道內最冷區域之外的部位復制而導致其毒性減弱的原因。動物模型試驗和臨床試驗表明這種特性是相當穩定的。與通過化學誘變制備的流感病毒株的這種ts表型不同，MDV-A的ts特性通過在感染的倉鼠內傳代或從兒童中分離出的經傳代的分離株的這種特性不會還原(最近的綜述,見Murphy&Coelingh(2002) “冷適應A型和B型流感減毒活疫苗的制備原理及其應用”(Principles underlying the development anduse of live attenuated cold-adapted influenza A and B virus vaccines)ViralImmunol15:295-323)。
[0009] 12株不同的6:2重排列病毒株給予超過20，000名成人和兒童進行臨床試驗，結果發現這些疫苗是減毒的、安全而有效的(Belshe等，(1998) “冷適應三價鼻內減毒活流感疫苗對兒童的效應”(The efficacy of live attenuated, cold-adapted, trivalent,intranasal influenza virus vaccine in children)N Engl J Med338:1405-12 ；Boyce等，(2000) “加佐劑的和未加佐劑的亞單位流感疫苗通過鼻內給藥在健康成年人體內的安全性和免疫原性“(Safety and immunogenicity of adjuvanted and unadjuvantedsubunit influenza vaccines administered intranasally to healthy adults)Vaccinel9:217-26 ；Edwards等，(1994) “冷適應滅活疫苗預防A型流感的隨機對照臨床試驗，，(A randomized controlled trial of cold adapted and inactivated vaccines forthe prevention of influenza A disease)J Infect Disl69:68_76 ;Nichol等，(1999)“鼻內減毒活流感疫苗對健康的、工作的成年人的效應:隨機對照臨床試驗”(Effectivenessof live, attenuated intranasal influenza virus vaccine in healthy, workingadults: a randomized controlled trial) JAMA282:137-44)。攜帶 MDV-A 的 6 個內部基因和野生型病毒的兩個HA和NA基因節段的重排列病毒株(6:2重排列株)能始終保持ca、ts和att表型(Maassab等，(1982) “利用雪紹評價冷重組流感病毒疫苗”(Evaluation of acold-recombinant influenza virus vaccine in ferrets)J Infect Disl46:780-900)。
[0010]到目前為止，美國所有商業化的流感疫苗都能在含胚胎的雞蛋內繁殖。雖然流感病毒在雞蛋內生長良好，但是疫苗的制備就要依賴雞蛋的供應。供應雞蛋必須是有組織的，制備疫苗的病毒株要在下一次流感季節到來前幾個月開始篩選，這就限制了這種方法的靈活性，常常會導致疫苗制備和分發的延遲或短缺。
[0011]最近幾年已經開發出了在細胞培養物中制備流感病毒的系統(見，Furminger.“疫苗制備” (Vaccine Production)，Nicholson 等(編)，《流感教科書》(Textbook ofInfluenza)，324-332頁；Merten等，(1996) “在細胞培養物中生產病毒以制備疫苗，，(Production of influenza virus in cell cultures for vaccine preparation),Cohen&Shafferman (編)，《疫苗設計和制備的新策略》(Novel Strategies in Design andProduction of Vaccines), 141-151頁)。一般來說,這些方法都是利用選定的病毒株感染適宜的永生化宿主細胞。根據已建立的組織培養方法制備疫苗雖然不會出現利用雞蛋制備疫苗時所遇到的許多困難，但是并不是所有的流感致病株都可以良好生長和制備。另外，許多具有期望特性的病毒株，如減毒性、溫度敏感性和冷適應性，利用已建立的方法在組織培養物中無法成功繁殖，而這些特性都是制備減毒活疫苗所需要的。
[0012]利用重組DNA制備流感病毒可顯著提高通過組織培養方法制備流感疫苗的靈活性和實用性。最近，有報道利用插入編碼病毒基因組的cDNA的重組質粒制備病毒(見Neumann等，(1999) “完全利用克隆的cDNA制備A型流感病毒”(Generation of influenzaA virus entirely from cloned cDNAs).Proc Natl Acad Sci USA96:9345-9350 ;Fodo等，(1999) “從重組 NDA 中恢復 A 型流感病毒”(Rescue of influenza A virus fromrecombinant DNA), J.Virol73:9679-9682 ;Hoffmann 等，(2000) “利用 8 種質粒制備 A 型流感病毒的 DNA 轉染系統”(A DNA transfection system for generation of influenzaA virus from eight plasmids)Proc Natl Acad Sci USA97:6108_6113 ;W001/83794)。通過這些系統可制備能表達任何選定病毒株的免疫原性HA和NA蛋白的重組病毒和重排列病毒。但是，與A型流感病毒不同的是，還沒有報道描述利用純質粒系統來制備B型流感病毒。
[0013]另外，現在還沒有一個純質粒系統可用于生產適于制備減毒活疫苗的減毒的、溫度敏感的、冷適應的病毒株。本發明提供了一種8質粒系統用于從克隆的cDNA開始生產B型流感病毒；以及制備適用于疫苗制劑的A型和B型流感減毒活病毒的方法，如鼻內使用活病毒疫苗制劑，閱讀本說明書后其他的許多優點就變得很清楚了。
[0014]發明概述
[0015]本發明涉及在細胞培養物中制備流感病毒的多載體系統以及制備重組流感病毒和重排列病毒的方法，包括適宜作疫苗的減毒的(att)、冷適應的(ca)和/或溫度敏感的(ts)流感病毒，其中包括流感減毒活疫苗，如那些適于以鼻內疫苗制劑的形式使用的疫苗。
[0016]本發明的第一個方面涉及在無輔助病毒的情況下在細胞培養物中制備重組B型流感病毒的載體和方法(即無輔助病毒細胞培養系統)。本發明的方法包括導入一組載體，這些載體中的每一個都可以將一部分B型流感病毒插入到一群能支持病毒復制的宿主細胞內。宿主細胞在適于病毒生長的條件下培養就可以獲得流感病毒。在某些實施方式中，流感病毒是減毒的病毒、冷適應病毒和/或溫度敏感性病毒。例如，在一個實施方式中，載體來源的重組B型流感病毒是減毒的、冷適應的、溫度敏感的病毒，適于制備成減毒活疫苗鼻內制劑使用。在一個典型的實施方式中，病毒是通過導入一群插入B/Ann Arbor/1/66流感病毒基因組的全部或部分，即ca B/Ann Arbor/1/66病毒基因組的載體而制備的。
[0017]例如，在某些實施方式中，B型流感病毒是經過人工改造的流感病毒，其中插入了一個或多個氨基酸取代，從而改變了流感病毒株ca B/Ann ARB0R/1/66的生物學特性。這種流感病毒包含突變，突變導致在位置PB1391、PB1581、PB1661、PB2265和NP34上一個或多個氨基酸改變，如 PBl391 (K391E)、PB1581 (E581G)、PB1661 (A661T)、PB2265 (N265S)和 NP34 (D34G)。任何突變(在一個或多個這種位置上)不論單獨或者聯合在一起都會導致溫度敏感性、冷適應性或減毒性相對于野生 型病毒增強，這些突變都是本發明的適宜突變。
[0018]在某些實施方式中，一組載體中插入了一種B型流感病毒株的至少6個內部基因組節段以及另一種流感病毒株的編碼免疫原性流感病毒表面抗原的一個或多個基因組節段，這些載體被導入到一群宿主細胞內。例如，一種選定的減毒的、冷適應和/或溫敏B型流感病毒株，即B/Ann Arbor/1/66的ca、att、ts株,或經人工改造的含有上述位置上一個或多個氨基酸改變的B型流感病毒株的至少6個內部基因組節段與另一種病毒株來源的編碼免疫原性抗原的一個或多個節段一起導入到一群宿主細胞內。免疫原性表面抗原一般是指血凝素(HA)和/或神經酰胺酶(NA)抗原中的一種或兩種。在某些實施方式中只導入一個編碼免疫原性表面抗原的節段，此時選定病毒的其他7個互補片段也導入到宿主細胞內。
[0019]在某些實施方式中，插入B型流感病毒基因組節段的一群質粒被導入到一群宿主細胞內。例如，8個質粒用于將完整的B型流感病毒基因組導入到宿主細胞內，其中每個質粒所包含的基因組節段都不相同。另外，也可以用插入較小基因組序列的更多個質粒。
[0020]—般來說，本發明的質粒載體都是雙向表達載體。本發明的雙向表達載體一般都包含第一啟動子和第二啟動子，其中第一和第二啟動子與同一雙鏈cDNA的其中一條鏈連接，cDNA編碼包含流感病毒基因組節段在內的病毒核酸。另外，雙向表達載體還可以包含多聚腺苷酸信號和/或終止序列。例如，多聚腺苷酸信號和/或終止序列位于兩個啟動子之間的流感病毒基因組節段的兩側。本發明的一個優選多聚腺苷酸信號是SV40多聚腺苷酸信號。本發明的典型質粒載體是PAD3000，如圖1所示。
[0021]載體導入到宿主細胞內，這種宿主細胞能支持流感病毒在載體啟動子控制下的復制。宿主細胞的優選例子包括Vero細胞、Per.C6細胞、BHK細胞、PCK細胞、MDCK細胞、MDBK細胞、293細胞(如293T細胞)和COS細胞。在與本文所描述的pAD3000質粒載體結合使用時，優選Vero細胞、293和COS細胞。在某些實施方式中，至少兩種細胞系的混合物共培養組成了宿主細胞群，如COS和MDCK細胞的混合物或293T和MDCK細胞的混合物。
[0022]包含B型流感病毒載體的宿主細胞在適宜病毒復制和裝配的條件下在培養物中生長。一般來說，包含本發明的B型流感病毒質粒的宿主細胞在37°C以下培養，優選35°C或以下。細胞一般在32°C到35°C之間的溫度下培養。在某些實施方式中，細胞在約32°C到34°C之間的溫度下培養，如在約33°C培養。在培養一段適宜的時間使病毒復制到高滴度后收獲重組的和/或重排列的病毒。收獲的病毒還可以經過滅活。
[0023]本發明還涉及具有很寬適用范圍的在細胞培養物中制備重組流感病毒的方法，所述方法包括將一組插入流感病毒基因組的載體導入到一群能支持流感病毒復制的宿主細胞內，在低于或等于35°C的溫度下培養細胞，然后收獲流感病毒。
[0024]在某些實施方式中，插入流感病毒基因組節段的一群質粒被導入到一群宿主細胞內。在某些特定實施方式中，8個質粒用于將完整的B型流感病毒基因組導入到宿主細胞內，其中每個質粒所包含的基因組節段都不相同。一般來說，本發明的質粒載體都是雙向表達載體。本發明的典型質粒載體是PAD3000，如圖1所示。
[0025]在某些實施方式中，流感病毒是指B型流感病毒。在另外一些實施方式中，流感病毒是指A型流感病毒。在某些特定實施方式中，方法包括收獲重組的和/或重排列的流感病毒，這些病毒給予受試者時，如通過鼻內給藥給予受試者時可激發免疫反應。在某些實施方式中，病毒在給藥前被滅活，在另一些實施方式中，給予的是減毒活病毒。按照本發明的方法制備的重組的和重排列的A型流感病毒和B型流感病毒也是本發明的一個特征。
[0026]在某些實施方式中，病毒包括減毒流感病毒、冷適應流感病毒、溫敏流感病毒、或者具有這幾種特征的任意組合的流感病毒。在一個實施方式中，流感病毒是指B/AnnArbor/1/66流感病毒株，即冷適應的、溫度敏感的減毒株B/Ann Arbor/1/66。在其他的實施方式中，流感病毒是指A/Ann Arbor/6/60流感病毒株，即冷適應、溫度敏感的減毒株A/Ann Arbor/6/60。在另一個實施方式中，病毒是經人工改造的流感病毒，其中有一個或多個影響ca A/Ann Arbor/6/60或ca B/Ann Arbor/1/66病毒生物學特性的氛基酸改變，這種取代的氨基酸優選ca A/Ann Arbor/6/60或ca B/Ann Arbor/1/66的獨特氨基酸，對于 A 型流感病毒株來說有:PB1391(K391E)、PBl581 (E581G)、PBl661 (A661T)、PB2265 (N265S)和 NP34(D34G);對于 B 型流感病毒株來說有:PB2630 (S630R)、PA431 (V431M)、PA497 (Y497H)、NP55 (T55A)、NP114(V114A)、NP41°(P410H)、NP51ci (Α51OT)、M1159(H159Q)和 Ml183 (M183V)。同樣， 這些位置上能產生溫度敏感性、冷適應性和/或減毒特性的其他種類的氨基酸取代也包含在本發明的病毒和方法范圍內。
[0027]另外，重排列病毒還可以通過導入含選定病毒株的6個內部基因和編碼選定致病株的表面抗原(HA和NA)的基因組節段的載體來制備，其中所選定的病毒株具有適于疫苗制備的特性。例如，HA節段優選自致病性的H1、H3或B株，這都可以通過疫苗制備的常規方法實現。同樣，HA節段可以選自顯性致病株如H2株(如H2N2)、H5株(如H5N1)或H7株(如H7N7)。另外，第一株的7個互補基因組節段可以和HA或NA編碼節段一起導入。在某些實施方式中，B/Ann Arbor/1/66或A/Ann Arbor/6/60流感病毒株。
[0028]另外，本發明還涉及制備具有期望特性的新型流感病毒，如溫度敏感性、減毒特性和/或冷適應性，這些特性與疫苗的制備有關，本發明還涉及制備含這些新型流感病毒的流感疫苗的方法。在某些實施方式中，新型流感病毒A株是通過引入突變制備的，這些突變導致在一個或多個特定位置上氨基酸的取代，本文已證實這些取代對于溫敏表型是十分重要的，如 PBl391、PB1581、PBl661、PB2265 和 NP340 例如，在核苷酸位點 PB11195、PB11766、PB12005、PB2821和NP146上的突變，或者其他能導致特定氨基酸位置上發生氨基酸取代的核苷酸突變。任何突變(在一個或多個這種位置上)不論單獨或者聯合在一起都會導致溫度敏感性、冷適應性或減毒性相對于野生型病毒增強，這些突變都是本發明的適宜突變。例如，優選 PB1391(K391E)、PB1581(E581G)、PB1661 (A661T) ,PB2265 (N265S)和 NP34 (D34G)這些突變引入野生型流感病毒A株的基因組中，即PR8，以制備適于作為減毒活疫苗使用的溫度敏感突變株。為了增加期望表型的穩定性，一般要引入一組突變。將所選擇的突變引入到基因組后，突變的流感病毒基因組在適于病毒制備的條件下復制。例如，突變的流感病毒基因組可在雞蛋內復制。另外，流感病毒基因組也可在細胞培養物中復制。在后一種情況下，病毒還可以在雞蛋內進一步擴增以提高病毒的滴度。按照本發明的方法制備的溫度敏感的、減毒的和/或冷適應病毒也是本發明的特征，包含這種病毒的疫苗也是如此。同樣，含有在PB1391、PB1581、PB1661、PB2265和NP34位置上出現一個或多個突變的新型重組病毒核酸，即選自下列的突變 PBl391 (K391E)、PBl581 (E581G)、PBl661 (A661T)、PB2265 (N265S)和 NP34 (D34G)；以及具有這種氨基酸取代的多肽也是本發明的特征。
[0029]而且，本文所描述的方法適用于制備具有溫度敏感性、弱毒性和/或冷適應性的新型流感病毒B株，該方法是將一個或多個特異性突變引入到B型流感病毒基因組中。例如，將一個或多個導致在 PB2630、PA431、PA497、NP55、NP114、NP410、NP510、Ml159 或 Ml183 位置上發生氨基酸取代的突變引入到B型流感病毒株中以制備溫敏B型流感病毒基因組。氨基酸取代的例子包括:PB2630 (S630R)、PA431 (V431M)、PA497 (Y497H)、NP55 (T55A)、NP114 (VI14A)、NP410 (P410H)、NP510 (A510T)、Ml159 (H159Q)和 Ml183 (M183V)。如上所示，包含這種病毒以及插入這些突變和氨基酸取代的核酸和多肽的疫苗都是本發明的特征。
[0030]相應的，不論其制備方法如何，插入本發明的突變的流感病毒都是本發明的特征。這就是說，本發明包含具有本發明的突變的流感病毒株，即在相對于野生型病毒株的下列一個或多個位置上發生氨基酸取代的任何A型流感病毒:PB1391、PB1581、PB1661、PB2265和NP34，或在相對于野生型病毒株的下列一個或多個位置上發生氨基酸取代的任何B型流感病毒:PB263° ；PA431 ；PA497 ；NP55 ；NP114 ；NP410 ；NP510 ；M1159 和 Ml183 ;但是病毒株 ca A/AnnArbor/6/60和B/Ann Arbor/1/66不是本發明的特征。在某些優選的實施方式中,A型流感病毒含有一組突變，其中包括:PBl391 (K391E)、PBl581 (E581G)、PBl661 (A661T)、PB2265 (N265S)和NP34 (D34G) ;B型流感病毒含有一組突變，其中包括PB2630 (S630R)、PA431 (V431M)、PA497 (Y497H)、NP55(T55A)、NP114(VlHA)、NP41c1 (P410H)、NP51CI(A510T)、Ml159 (H159Q)和Ml183 (M183V)。 [0031]在一個實施方式中，一組含有流感病毒基因組的質粒載體被導入到宿主細胞內。例如，流感病毒基因組節段可以插入到至少8種質粒內。在一個優選實施方式中，流感病毒基因組節段被插入到8種質粒內。例如，這8種質粒的每個質粒都插入有不同的流感病毒基因組節段。
[0032]本發明的載體可以是雙向表達載體。本發明的雙向表達載體一般都包含第一啟動子和第二啟動子，其中第一啟動子和第二啟動子可操作連接到含有流感病毒基因組節段的同一雙鏈病毒核酸的兩條鏈上。另外，雙向表達載體還可以包含多聚腺苷酸信號和/或終止序列。例如，多聚腺苷酸信號和/或終止序列位于兩個啟動子之間的流感病毒基因組節段的兩側。本發明的一個優選多聚腺苷酸信號是SV40多聚腺苷酸信號。本發明的典型質粒載體是PAD3000，如圖1所示。
[0033]任何能支持流感病毒在載體啟動子控制下復制的宿主細胞都包括在本發明的范圍之內。宿主細胞的優選例子包括Vero細胞、Per.C6細胞、BHK細胞、PCK細胞、MDCK細胞、MDBK細胞、293細胞(如293T細胞)和COS細胞。在與本文所描述的pAD3000質粒載體結合使用時，優選VeiO細胞、293細胞和COS細胞。在某些實施方式中，至少兩種細胞系的混合物共培養組成了宿主細胞群，如COS和MDCK細胞的混合物或293T和MDCK細胞的混合物。
[0034]本發明的一個特征是含有本發明質粒的宿主細胞在37°C以下培養，優選35°C或以下。細胞一般在32°C到35°C之間的溫度下培養。在某些實施方式中，細胞在約32°C到34°C之間的溫度下培養，如在約33°C培養。
[0035]本發明的另一個方面涉及從培養的Vero細胞內恢復重組的或重排列的A型流感病毒或B型流感病毒(即野生型A型流感病毒或流感病毒及其突變株)的新型方法。一組含流感病毒基因組的載體通過電穿孔導入到一群宿主細胞內。細胞在適于病毒復制的條件下生長，即冷適應的、減毒的、溫度敏感的病毒株，Vero細胞在37 °C以下培養，優選35 °C或以下。細胞一般在32°C到35°C之間的溫度下培養。在某些實施方式中，細胞在約32°C到34°C之間的溫度下培養，如在約33°C培養。另外(如對于疫苗的制備來說)，Vero細胞在無血清無任何動物來源的產物的培養基中生長。
[0036]在上面所描述的方法中，病毒通過培養含流感病毒基因組質粒的宿主細胞而獲得。在某些實施方式中，收獲的病毒是重組病毒。在另外一些實施方式中，收獲的病毒是具有多個親本病毒株基因背景的重排列病毒。另外，收獲的重組病毒或重排列病毒還可以在培養的細胞內或雞蛋內進一步擴增。
[0037]另外，收獲的病毒可以被滅活。在某些實施方式中，收獲的病毒組成了流感疫苗。例如，收獲的流感疫苗可以是具有來源于選定的流感病毒A株或B株的HA和/或NA抗原的重排列流感病毒(即6:2或7:1重排列病毒)。在某些優選的實施方式中，重排列流感病毒具有減毒的表型。另外，重排列病毒可以是冷適應和/或溫敏B型流感病毒，即具有表17中一個或多個氨基酸取代的減毒的、冷適應和/或溫敏B型流感病毒。這種流感病毒可用作減毒活疫苗以激發針對特定致病性流感病毒株的免疫反應。按照本發明的方法制備的流感病毒，如減毒的重排列病毒是本發明的一個特征。
[0038]在另一方面，本發明涉及制備重組流感病毒疫苗的方法，所述方法包括將一群含流感病毒基因組的載體導入到一群能支持流感病毒復制的宿主細胞內，在低于或等于35°C的溫度下培養宿主細胞，以及收獲能在給予受試者后激發免疫反應的流感病毒。本發明的疫苗可以是A型流感病毒株，也可以是B型流感病毒株。在某些實施方式中，流感疫苗病毒包括減毒的流感病毒、冷適應流感病毒或溫敏流感病毒。在某些實施方式中，病毒具有這些特性的組合。在一個實施方式中，流感病毒包含A/Ann Arbor/6/60流感病毒株。在另一個實施方式中，流感病毒包含B/Ann Arbor/1/66流感病毒株。另外，疫苗還包括人工改造的A型流感病毒或B型流感病毒，其中含有至少一個取代的氨基酸，這些取代的氨基酸能影響ca A/Ann Arbor/6/60或ca/B/Ann Arbor/1/66的生物學特性,如這些病毒株的獨特氨基酸。例如，本發明所包含的疫苗包括人工改造的重組的和重排列的A型流感病毒，這些病毒至少有一個位置發生突變，導致下列位置上發生氨基酸取代:PB1391、PB1581、PB1661、PB2265和NP34 ;以及人工改造的重組的和重排列的B型流感病毒，這些病毒至少有一個位置發生突變，導致下列位置上發生氨基酸取代:PB263° ；PA431 ；PA497 ；NP55 ；NP114 ；NP410 ；NP510 ；M1159和Ml183。
[0039]在某些實施方式 中，病毒包括重排列流感病毒(即6:2或7:1重排列株)，這些病毒含有來源于多個流感病毒株的基因組節段。例如，優選的重排列流感病毒疫苗包含來源于選定的流感病毒A株或B株的HA和/或NA表面抗原以及來源于具有與疫苗制備有關的期望特性的病毒株的內部基因組節段。通常情況下在預測致病株(如上面所描述的)在局部或世界范圍內流行的基礎上優選HA和/或NA編碼節段來源的流感病毒株。在某些情況下，含有內部基因組節段的病毒株是減毒的、冷適應和/或溫敏流感病毒株，如A/AnnArbor/6/60、B/Ann Arbor/1/66或具有一個或多個取代的氨基酸從而具有所期望的表型的人工改造的流感病毒株，如包含至少一個突變從而導致在下列位置上發生氨基酸取代的A型流感病毒:PB1391、PB1581、PB1661、PB2265和NP34 ;以及包含至少一個突變從而導致在下列位置上發生氨基酸取代的B型流感病毒:PB263° ；PA431 ；PA497 ；NP55 ；NP114 ；NP410 ；NP510 ；M1159和Ml183。例如，優選的重排列病毒包含具有下列一個或多個氨基酸取代的人工改造的A型流感病毒:PBl391 (K391E)、PBl581 (E581G)、PBl661 (A661T)、PB2265 (N265S)和 NP34(D34G);以及包含具有下列一個或多個氨基酸取代的人工改造的B型流感病毒:PB263°(S630R)、PA431(V431M)、PA497 (Y497H)、NP55(T55A)、NP114(VlHA)、NP41ci (P410H)、NP51CI(A510T)、Ml159 (H159Q)和Ml183 (M183V)。[0040]如果需要，流感病毒可以在收獲后被滅活。
[0041]通過本發明的方法制備的流感病毒疫苗，包括減毒活疫苗也是本發明的特征，在某些優選的實施方式中，流感病毒疫苗是重排列病毒疫苗。
[0042]本發明的另一個方面涉及雙向表達質粒載體。本發明的雙向表達載體含有位于第二啟動子和多聚腺苷酸位點即SV40多聚腺苷酸位點之間的第一啟動子。在一個實施方式中，第一啟動子和第二啟動子的方向相反，位于至少一個克隆位點的兩側。本發明的典型載體是質粒PAD3000,如圖1所示。
[0043]在某些實施方式中，流感病毒基因組至少一個節段被插入到克隆位點上，形成雙鏈核酸。例如，本發明的載體包括一種質粒，該質粒中的第一啟動子位于第二啟動子和SV40多聚腺苷酸位點之間，其中第一啟動子和第二啟動子方向相反，位于至少一個流感病毒基因組節段的兩側。
[0044]包含本發明的一個或多個表達載體的試劑盒也是本發明的一個特征。一般來說，試劑盒還包含一個或多個能支持流感病毒復制的細胞系，緩沖液、細胞培養基、說明書、包裝材料和容器。在某些實施方式中，試劑盒含有一組表達載體，每種表達載體至少含有流感病毒基因組的一個節段。例如，試劑盒包含一組表達載體，每種表達載體含有一種選定病毒株的一個內部基因組節段，所選擇的病毒株具有與疫苗制備或使用有關的特性，這也是本發明的特征。例如，選定的病毒株可以是減毒的、冷適應的和/或溫度敏感的病毒株，如A/Ann Arbor/6/60、B/Ann Arbor/1/66或具有期望特征的其他病毒株，如具有本文表17中所描述的一個或多個氨基酸取代的人工改造的病毒株。在一個實施方式中，試劑盒包含的表達載體含有編碼突變的HA和/或NA抗原的核酸文庫的成員。
[0045]能在低于或等于35°C的溫度下增殖性生長的細胞培養物也是本發明的特征，這些細胞培養物至少包括一種細胞，該細胞包含一組含有流感病毒基因組的載體。組合物還可以包括細胞培養基。在某些實施方式中，一組載體包括雙向表達載體，即含有插入到第二啟動子和SV40多聚腺苷酸位 點之間的第一啟動子。例如，第一啟動子和第二啟動子方向相反，位于流感病毒至少一個節段的兩側。本發明的細胞培養物可在低于或等于35°C的溫度下培養，如約32°C到35°C之間，一般來說是在約32°C到34°C之間，如約33°C。
[0046]本發明還涉及細胞培養系統，該系統包括上述能增殖性生長的至少包含一種細胞的細胞培養物，其中細胞包含一組含有流感病毒基因組的載體；以及維持細胞培養物在低于或等于35°C下生長的調節劑。例如，調節劑優選能維持細胞在約32°C到35°C之間生長，一般來說是在約32°C到34°C之間，如約33°C。
[0047]本發明的另一個特征是人工改造的的重組流感病毒或重排列病毒，該病毒含有一個或多個能影響溫敏流感病毒、冷適應性和/或減毒特性的取代的氨基酸。例如，在如下位置上出現氨基酸取代的人工改造的A型流感病毒:PB1391、PB1581、PB1661、PB2265和NP34 ；以及在下列位置上發生氨基酸取代的人工改造的B型流感病毒:PB263° ；PA431 ；PA497 ；NP55 ；NP114 ；NP410 ；NP510 ;M1159和Ml183都是本發明的優選實施方式。典型的實施方式包括具有下列一個或多個如下取代的氨基酸的A型流感病毒:PB1391 (K391E)、PBl581 (E581G)、PB1661(A661T)、PB2265 (N265S)和NP34(D34G);以及具有下列一個或多個氨基酸取代的B型流感病毒:PB2630 (S630R)、PA431(V431M)、PA497 (Y497H) ,NP55 (T55A)、NP114 (V114A)、NP41。(P410H)、NP510 (A510T)、Ml159 (H159Q)和Ml183 (M183V)。在某些實施方式中，病毒包含一組突變，如在上述位置上的1、2、3、4、5、6、7、8或9個取代的氨基酸。相應的，在上述所有5個位置上，即 PBl391 (K391E)、PB1581(E581G)、PBl661 (A661T)、PB2265 (N265S)和 NP34(D34G)發生氨基酸取代的人工改造的A型流感病毒；以及在上述8個或所有9個位置上，即PB263°(S630R)、PA431(V431M)、PA497 (Y497H)、NP55(T55A)、NP114(VlHA)、NP41CI(P410H)、NP51CI(A510T)、M1159(H159Q)和M1183(M183V)發生氨基酸取代的人工改造的B型流感病毒也都包括在本發明的范圍之內。另外，病毒也可以含有上面未提到的一個或多個其他類型的取代的氨基酸。
[0048]在某些實施方式中，人工改造的流感病毒是溫敏流感病毒、冷適應的和/或減毒的流感病毒。例如，與野生型的流感病毒相比，本發明的溫敏流感病毒在39°C生長時一般會降低約2.0到5.0log100例如，與野生型的流感病毒相比，在39°C時，溫敏流感病毒病毒的生長至少約降低2.0log10、約3.0log10、4.0log10或4.51og10。一般來說，但也不一定,溫敏流感病毒在33°C時保持最旺盛的生長特性。通過雪貂減毒試驗發現，與野生型的流感病毒相比，本發明的減毒流感病毒一般會降低約2.0到5.0log100例如，通過雪貂減毒試驗證明，與野生型的流感病毒相比，本發明的減毒流感病毒的生長至少約降低2.0logltl、通常降低約3.0logltl,優選降低約4.0log10。
[0049]附圖簡述
[0050]圖1:pAD3000質粒的說明
[0051]圖2:感染細胞的顯微圖片
[0052]圖3:通過質粒轉染所得到的rMDV-A和6:2H1N1重排列病毒的基因型分析
[0053]圖4:制備B型流感病毒的8質粒系統的說明
[0054]圖5: A和B.RT-PCR分析重組MDV-B病毒的特征；C和D.RT-PCR分析重組B/Yamanashi/166/98 的特征
[0055]圖6: GeneBank 形式的 pAD3000 序列
[0056]圖7: MDV-B和8種質粒的序列比對
[0057]圖8:同時擴增B型流感病毒的HA和NA節段所得到的RT-PCR產物
[0058]圖9:柱形圖說明重組病毒和重排列病毒的相對滴度
[0059]圖10:柱形圖說明重排列病毒在允許溫度和限制溫度下的相對滴度(溫敏流感病毒)
[0060]圖11:圖表說明插入與溫敏流感病毒有關的特異性突變(敲入)的重排列病毒(左圖)以及在允許溫度和限制溫度下的相對滴度(溫敏流感病毒)(右圖)。
[0061]圖12:利用微基因組分析確定ts突變。A.HEp-2細胞轉染PB1、PB2、PA、NP以及pFlu-CAT，在33°C或39°C孵育18小時，細胞提取物用于分析CAT報告基因的表達。B.利用引物延伸試驗分析CAT mRNA的表達
[0062]圖13:【專利附圖】

【附圖說明】PA、NP和Ml蛋白上具有野生型殘基的三基因重組病毒
[0063]圖14:表格說明單基因和雙基因重組病毒的生長情況
[0064]圖15:表格說明非ts表型相應的核蛋白的氨基酸殘基
[0065]圖16:重組PR8突變株的簡圖。黑點表示PBl和/或PB2基因上引入的突變
[0066]圖17:柱形圖說明在33°C和39°C時的相對滴度
[0067]圖18:PR8突變株在各種溫度下噬菌斑形態的顯微照片。MDCK細胞如所示的那樣轉染病毒并分別在33°C、37°C和39°C孵育3天。通過免疫染色觀察噬菌斑并拍照。[0068]圖19:允許溫度及非允許溫度下的蛋白合成。MDCK細胞如所示的那樣轉染病毒并分別在33°C或39°C孵育過夜。SDS-PAGE電泳分離放射性同位素標記的多肽并進行放射自顯影。圖中指示的是病毒蛋白HA、NP、M1和NS。
[0069]圖20: A.線圖說明MDA-V和MDV-B在Per.C6細胞內與在MDCK細胞內復制的區別。B.線圖說明MDV-A單基因重排列病毒在Per.C6細胞內的不同復制情況。
[0070]詳細描述
[0071]許多致病性流感病毒在組織培養物中的生長狀態很差，適于制備減毒活疫苗(即溫敏流感病毒、冷適應的和/或減毒的流感病毒)的病毒株還無法在培養的細胞內成功生長以制備商業用途的產品。本發明提供了一種多質粒系統，該系統可使那些在標準細胞培養條件下不能生長的流感病毒株生長和恢復。
[0072]在第一個方面，本發明的方法涉及在細胞培養物中完全由克隆的病毒DNA來制備重組B型流感病毒的載體和方法。在另一個方面，本發明的方法部分基于組織培養條件的改善，這種條件能夠支持具有疫苗制備相關特性(即減弱的致病性、冷適應性、溫敏流感病毒等)的病毒株(流感病毒A株和B株)在體外培養的細胞內生長。流感病毒可通過將一組攜帶克隆的病毒基因組節段的載體導入到宿主細胞內并在不超過35°C的溫度下培養而制備。當轉染含流感病毒基因組的載體時，適于作為疫苗的重組病毒可通過標準的純化方法制備。利用本發明的載體 系統和方法，可快速高效地在組織培養物中制備插入有6個具有期望特性的病毒株的內部基因節段和選定致病株的免疫原性HA和NA節段的重排列病毒。因此，本文所描述的系統和方法可用于在細胞培養物中快速制備重組的和重排列的A型流感病毒和B型流感病毒，包括適于作為疫苗的病毒，包括減毒活疫苗，如適于鼻內使用的疫苗。
[0073]一般來說，每個A亞型和B亞型選擇一個主供體病毒(MDV)株。對于減毒活疫苗來說，主供體病毒一般根據其優良的特性來選擇，如與疫苗制備有關的溫敏流感病毒、冷適應性和/或減毒特性。例如，典型的主供體病毒分別包括A/Ann Arbor/6/60和B/AnnArbor/1/66的這種溫度敏感株、減毒株和冷適應株。本發明在下面說明了導致這些病毒株產生ca、ts和att表型的突變，并且提供了制備適于作為供體株制備重組疫苗和重排列疫苗的新型流感病毒株的方法。
[0074]例如，一個選定的主供體A型病毒(MDV-A)或主供體B型病毒(MDV-B)可從一組含病毒基因組的克隆的病毒cDNA開始制備。在一個典型的實施方式中，重組病毒是從8個克隆的病毒cDNA開始制備的。8個病毒cDNA代表選定的MDV-A的或MDV-B的PB2、PBUPA、NP、HA、NA、M和NS序列，這些cDNA被克隆到雙向表達載體如質粒(如pAD3000)內，這樣病毒基因組RNA就可以在RNA聚合酶Ι(ρ01 I)啟動子的控制下從一條鏈上轉錄出來，病毒mRNA在RNA聚合酶ΙΙ(ρ01 II)啟動子的控制下從另一條鏈上合成出來。另外，任何基因節段都可以經過修飾，其中包括HA節段(如去除多堿基裂解位點)。
[0075]然后將攜帶8個病毒cDNA的質粒轉染到合適的宿主細胞，如VeiO細胞、共培養的MDCK/293T或MDCK/C0S7細胞內，隨后就可以收獲感染性重組MDV-A或MDV-B病毒。利用本文所描述的質粒和方法，本發明可通過共轉染選定病毒(如MDV-A、MDV-B)的6個內部基因(PB1、PB2、PA、NP、M和NS)和不同的相應類型流感病毒(A或B)來源的HA和NA用于制備6:2重排列流感病毒疫苗。例如，HA節段最好是選自致病性的Hl、H3或B病毒株，這些在疫苗制備中都是常規的。同樣，HA節段也可以選自與致病株有關聯的病毒株，如H2株(H2N2)、H5株(H5N1)或H7株(H7N7)。含有MDV的7個基因組節段和選定病毒株的HA或NA基因的重排列病毒株(7:1重排列病毒)也可以制備。另外，該系統還可以用于確定表型特征的分子基礎，如與疫苗制備相關的減毒特性(att)、冷適應性(ca)以及溫敏(ts)流感病毒。[0076]定義
[0077]除非另外給出定義，所有的科學和技術術語都被理解為與其所用領域內的常用含義相同。為了本發明的目的特地對下列術語作出定義。
[0078]術語“核酸”、“多核苷酸”、“多核苷酸序列”以及“核酸序列”是指單鏈或雙鏈脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸多聚物，或其嵌合體或類似物。如本文所描述，該術語還可以包括具有天然核苷酸基本屬性的天然核苷酸類似物的多聚物，該多聚物可以天然核苷酸相同的方式與單鏈核酸雜交。除非特別說明，本發明的特定核酸序列除了包含明確指出的序列外還包含互補序列。
[0079]術語“基因”是一個被廣泛使用的概念，是指有生物功能的任何核酸序列。因此，基因包括編碼序列和/或其表達所需要的調節序列。術語“基因”適用于特殊的基因組序列，也適用于基因組序列所編碼的cDNA或mRNA。
[0080]基因也包括非表達的核酸節段，如形成其他蛋白的識別序列。非表達調節序列包括“啟動子”和“增強子”，調節蛋白如轉錄因子可與之結合，導致臨近或附近序列的轉錄。“組織特異性”的啟動子或增強子是指可在特定類型的組織或細胞內調節轉錄的啟動子或增強子。
[0081]術語“載體”是指可用于在微生物、細胞或細胞組分之間繁殖和/或轉移核酸的工具。載體包括質粒、病毒、噬菌體、原病毒、噬菌粒、轉座子和人工染色體等，載體可自主復制或整合到宿主細胞的染色體內復制。載體還可以是裸RNA、裸DNA、位于同一條鏈內的由DNA和RNA組成的多核苷酸、多聚賴氨酸結合的DNA或RNA、肽連接的DNA或RNA、脂質體連接的DNA等，這些載體不能自主復制。本發明最常用的載體是質粒。
[0082]“表達載體”是能啟動表達以及能使其攜帶的核酸復制的載體，如質粒。一般來說，被表達的核酸連接有啟動子和/或增強子，核酸的轉錄被啟動子和/或增強子控制。
[0083]“雙向表達載體”一般具有方向相反的兩個啟動子，核酸位于兩個啟動子之間，表達可在任一方向起始轉錄出RNA的正義鏈(+ )或反義鏈(_)。另外，雙向表達載體還可以是雙義載體，病毒mRNA和病毒基因組RNA (作為cRNA)從同一條鏈上表達。
[0084]根據本發明，術語“游離的”是指不含在天然環境中與其伴隨或相互作用的組分的生物材料，如核酸或蛋白質。游離的材料還可以包含天然環境中不存在的材料，如細胞。例如，如果材料存在于天然環境中，如細胞，但是該材料在細胞內所存在的位置(如基因組或基因元件)與天然環境中所處的位置是不同的。例如，天然核酸(如編碼序列、啟動子、增強子等)如果以非天然的方式被引入到基因組(即載體，如質粒或病毒載體，或者復制子)內該核酸所處的天然位點不同的位點上，則該核酸就成為游離的核酸。這種核酸也被稱為“異源核酸”。
[0085]術語“重組子”是指經人工改造或人工合成的材料(如核酸或蛋白)。這種改變可在其天然環境或狀態中進行，也可從其天然環境或狀態中去除。當這個術語指病毒，如流感病毒時，病毒是重組病毒是指該病毒是通過重組核酸的表達而制備的。
[0086]術語“重排列的”指病毒時說明病毒包含來源于多個親本病毒株或資源的基因元件和/或多肽元件。例如，7:1重排列病毒包括第一親本病毒來源的7個基因組節段(或基因節段)和第二親本病毒來源的一個互補病毒基因組節段，如編碼血凝素或神經酰胺酶的基因組節段。6:2重排列病毒包括第一親本病毒來源的6個基因組節段，最常用的是6個內部基因；以及另一個親本病毒來源的兩個互補片段，即血凝素和神經酰胺酶。
[0087]術語“導入的”用于異源或游離核酸時是指核酸摻入到真核細胞或原核細胞內，其中核酸插入到細胞的基因組(如染色體、座機里、質體或線粒體DNA)內，轉化形成自主復制子或瞬時表達(如轉染的mRAN)。該術語包括方法如“感染”、“轉染”、“轉化”和“轉導”。在本發明中，各種方法都可以用于將核酸導入到原核細胞內，如電穿孔、鈣磷酸鹽沉淀、脂質介導的轉染(脂轉染)等。
[0088]術語“宿主細胞”是指含有異源核酸，如載體，并支持核酸復制和/或表達的細胞，該細胞還可以產生一種或多種編碼查努，包括多肽和/或病毒。宿主細胞可以是原核細胞如大腸桿菌，也可以是真核細胞如酵母、昆蟲細胞、兩棲類動物細胞、鳥類細胞或哺乳動物細胞，其中包括人源細胞。本發明所用的典型宿主細胞包括Vero細胞(非洲綠猴腎細胞)、Per.C6細胞(人胚胎視黃醛細胞)、BHK細胞(幼倉鼠腎細胞)、原代雞腎細胞(PCK)、Madin-Darby 狗腎(MDCK)細胞、Madin-Darby 牛腎(MDBK)細胞、293 細胞(如 293T 細胞)和COS細胞(如C0S1、C0S7細胞)。術語宿主細胞包含細胞的混合物，如不同類型的細胞或細胞系的混合培養物。
[0089]術語“溫度敏感的”、“冷適應”和“減毒的”是本領域所熟知的。例如，術語“溫度敏感的”(“ts”)用于A型流感病毒株說明該病毒在39°C時的滴度相對于33°C來說下降100倍或更多，用于B型流感病毒株說明該病毒在37°C時的滴度相對于33°C來說下降100倍或更多。例如，術語“冷適應”(“ca”)是指病毒在25°C時的生長在其33°C時的生長的100倍以內。例如，術語“ 減毒的”(“att”)是指病毒可在雪貂的上呼吸道內復制但是在肺組織內檢測不到，也不能引起動物出現感冒樣的疾病。也可以理解為病毒具有中間表型，即病毒在39°C (對于A株病毒來說)或37°C (對于B株病毒來說)時滴度降低小于100倍，在25°C時的生長比其在33°C的生長高100倍以上(如200倍、500倍、1000倍、10000倍以內)，和/或其在雪貂肺內的生長弱于其在上呼吸道內的生長(即毒性部分降低)和/或在動物體內引起的感冒樣疾病較輕，具有本文所描述的一個或多個氨基酸取代的病毒也是本發明所包括的有用病毒。生長是指病毒量的增加，通過測定滴度、噬菌斑大小或形態、顆粒密度或本領域技術人員所熟知的其他方法。
[0090]術語“人工改造的的”用于本文是指病毒、病毒核酸或病毒編碼產物如多肽、疫苗含有至少一個通過重組方法引入的突變，如定向誘變、PCR突變等。術語“人工改造的的”用于含有一個或多個核苷酸突變和/或氨基酸取代的病毒(或病毒成分或產物)時是指編碼病毒(或病毒成分或產物)的病毒基因組或基因組節段不是來源于天然資源，如天然產生的或通過非重組方法(如在25°C下累進傳代)制備的以前已經存在的實驗室病毒株，即野生型的或冷適應A/Ann Arbor/6/60或B/Ann Arbor/l/66S流感病毒株。
[0091]流感病毒
[0092]流感病毒的基因組由線性㈠核糖核酸(RNA)鏈的8個節段組成，分別編碼免疫原性的血凝素(HA)和神經酰胺酶(NA)蛋白；以及6個內部核心多肽:核外殼核蛋白(NP)、基質蛋白(M)、非結構蛋白(NS)、以及3個RNA多聚酶(PA、PB1、PB2)蛋白。在復制期間，基因組病毒RNA在宿主細胞的核內轉錄成(+ )鏈信使RNA和㈠鏈基因組cRNA。8個基因組節段都包裝到核糖核蛋白復合體內，該復合體內除了 RNA外還含有NP和多聚酶復合體(PB1、PB2 和 PA)。
[0093]在本發明中，8個節段中的每一個相應的病毒基因組RNA被插入到重組載體中進行操作和制備流感病毒。各種載體，包括病毒載體、質粒、粘粒、噬菌體以及人工染色體都可以用于本發明中。為了便于操作，病毒基因組節段一般插入到質粒載體內，載體中含有一個或多個能在細菌和真核細胞內發揮功能的復制起點，還可以含有篩選標記基因以便于篩選轉染質粒序列的細胞。典型的載體是圖1所示的PAD3000。
[0094]本發明最常用的質粒載體是雙向表達載體，該載體可使插入的病毒基因組節段在任何一個方向上起始轉錄，合成出(+ )鏈RNA和㈠鏈RNA。為了提高雙向轉錄的效率，每個病毒基因組節段都插入到含有至少兩個獨立啟動子的載體內，這樣病毒基因組RNA的拷貝可被第一 RNA聚合酶啟動子(即Pol I)從一條鏈上轉錄出來，而病毒mRNA被第二 RNA聚合酶啟動子(即Pol II)合成。相應的，兩個啟動子以相反方向排列，位于至少一個克隆位點(即限制性內切酶識別序列)的兩側，優選獨特的克隆位點來插入病毒基因組RNA片段。另外，“雙義”載體也可以使用，其中(+ )鏈mRNA和㈠病毒RNA (作為cRNA)從同一條鏈上表達。
[0095]表達載體
[0096]需要表達的流感病毒基因組節段被連接到控制mRNA合成的適當轉錄控制序列(啟動子)上。各種啟動子都適用于流感病毒基因組節段在表達載體內的轉錄調節。在某些實施方式中，載體是質粒PAD3000，，所用的啟動子為巨細胞病毒(CMV)DNA依賴的RNA聚合酶II(Pol II)啟動子。如果需要，例如為了調節條件表達的需要，也可以用其他的啟動子替換以誘導RNA在特定的條件下轉錄，或者在特定的組織或細胞內轉錄。許多病毒的啟動子或哺乳動物如人的啟動子都可以使用，可根據特定的用途來分離。例如，動物和人病毒基因組來源的啟動子包括腺病毒(如腺病毒2)、乳頭狀瘤病毒、乙型肝炎賓度故、多瘤病毒和猿病毒40(SV40)來源的啟動子以及各種逆轉錄病毒啟動子。哺乳動物啟動子包括肌動蛋白啟動子、免疫球蛋白啟動子、熱休克啟動子等。另外，噬菌體啟動子也可以和同源的RNA聚合酶聯合使用，如17啟動子。
[0097]轉錄還可以通過加入增強子序列來增強。增強子一般較短，約10_500bp，是一種順式作用DNA元件，可與啟動子一起增強轉錄。許多增強子序列已被從哺乳動物基因(血紅蛋白、彈性蛋白酶、白蛋白、甲胎蛋白和胰島素)和真核細胞病毒中分離出來。增強子可被連接到載體內的異源編碼序列的5’或3’位置，但是一般都插入到啟動子的5’端。一般來說，所選擇的啟動子以及附加的轉錄增強序列能優化異源DNA在其所導入的宿主細胞內的表達(Scharf等，(1994) “熱應激啟動子和轉錄因子”(Heat stress promoters andtranscription factors)Results Probl Cell Differ20:125-62 ;Kriegler等，(1990)“增強子、啟動子和剪接位點的裝配以控制轉移基因的表達”(Assembly of enhancers,promoters,and splice signals to control expression of transferred genes)Methodsin Enzymoll85:512-27)。另外,擴增子還可以含有核糖體結合位點或內部核糖體進入位點(IRES)以便于翻譯的起始。
[0098]本發明的載體還優選包含轉錄終止以及穩定mRNA所需要的序列，如多聚腺苷酸位點或終止子序列。這種序列通常置于真核或病毒DNA或cDNA的5’非翻譯區,有時也置于3’非翻譯區。在一個實施方式中，即包含質粒PAD3000的實施方式中，多聚腺苷酸信號是由SV40多聚腺苷酸序列提供的。
[0099]另外，如上面所描述，表達載體還可以包含一個或多個篩選標記基因以提供篩選轉化細胞所需要的表型性狀，處理前面所列的基因外，標記物如二氫葉酸還原酶或新霉素耐藥性都適于篩選真核細胞培養物。
[0100]含上述合適DNA序列以及合適啟動子或控制序列的載體可用于轉化允許蛋白表達的宿主細胞。雖然本發明的載體可在細菌中復制，但是大多數情況下這些載體是需要導入到哺乳動物細胞，如Vero細胞、BHK細胞、MDCK細胞、293細胞、COS細胞內以獲得表達。
[0101]其他的表達元件
[0102]在大對數情況下，編碼流感病毒蛋白的基因組節段包括其表達，包括翻譯成功能性病毒蛋白所需的任何附加序列，在其他情況下，編碼病毒蛋白如HA或NA蛋白的小基因或其他人工構建體也可以使用。在這種情況下，通常需要包含特異性的起始信號以幫助異源編碼序列有效翻譯。這些信號包括ATG起始密碼子及其臨近的序列。為了確保整個插入片段的翻譯，起始密碼子應插入到與病毒蛋白有關的正確閱讀框架內。外援轉錄元件和起始密碼子可以是各種來源的，可以是天然的，也可以是合成的。表達效率可以通過添加適于細胞系統的增強子來增強。
[0103]如果需要，編碼附加表達元件如信號序列、分泌或局域化序列等的多核苷酸序列可以插入到載體內，通常與目的多核苷酸序列處于同一框架內以使表達的多肽靶向性地定位到期望的細胞腔隙、膜或細胞器內，或者分泌到細胞培養基中。這些序列是本領域技術人員所熟知的，包括分泌前導肽、細胞器靶向性序列(如細胞核定位序列、內質網滯留信號、線粒體轉運虛禮)、膜定位/錨定序列(如停止運送序列、GPI錨定序列)等。
[0104]流感病毒疫苗
[0105]流感病毒疫苗以前都是根據經驗預測將要流行的病毒株，然后選擇病毒株在含胚胎的雞蛋內制備。最近，重排列病毒株已經被制備出來，這些病毒含有選定的血凝素和神經酰胺酶抗原，是已經被認可的減毒的、溫敏流感病毒主病毒株。經過在雞蛋內多次傳代培養以后收獲流感病毒，還可以選擇利用甲醛和/或丙內酯滅活。但是，以這種方式制備流感疫苗有幾個明顯的缺點。從雞蛋內剩余的污染物是具有高抗原活性的，是由于高熱所產生的，常常會在使用后產生明顯的副作用。更重要的是，設計需要制備的病毒株必需在下一個流行季節到來前幾個月開始篩選和分配以便于有足夠的時間來制備和滅活流感疫苗。在細胞培養物中制備重組和重排列疫苗的企圖也受到了被批準可以制備疫苗的病毒株都不能在標準細胞培養條件下生長這一問題的阻礙。
[0106]本發明提供了在細胞培養物中制備重組和重排列病毒的載體系統和方法，這使根據一個或多個選定的抗原性病毒株來快速制備疫苗成為可能。特別是本發明提供的條件和病毒株可使病毒在細胞培養物中從多質粒系統中有效制備出來。另外，如果需要，病毒還可以在雞蛋內進一步擴增。
[0107]例如，利用標準的細胞培養條件如在37°C使流感病毒B主病毒株B/AnnArbor/1/66生長是不可能的。在本發明的方法中，多質粒系統中的每一個質粒都含有一個流感病毒基因組的節段，這個系統被導入到適宜的細胞內，然后在低于或等于35°C的溫度下培養細胞。一般來說，細胞培養物可在約32°C到35°C之間的溫度下培養，優選約32°C到34°C之間，如約33。。。
[0108]通常細胞培養物都是在一個系統內培養，如細胞培養箱，控制濕度和CO2含量,利用溫度調節裝置是溫度保持在一個恒定的范圍內，如恒溫器以確保溫度不超過35°C。
[0109]重排列病毒可以通過導入一組載體很容易地獲得，這些載體含有主流感病毒的基因組節段和來源于目的病毒株(即感興趣的抗原性病毒株)的互補節段。一般來說，主病毒株的選擇是基于其是否具有與疫苗使用有關的特性。例如，對于疫苗制備，即減毒活疫苗的制備來說，選擇的主供體病毒要有減毒表型、冷適應性和/或溫敏流感病毒。因此，流感病毒A株ca A/Ann Arbor/6/60 ;流感病毒B株ca B/Ann Arbor/1/66 ;或其他具有期望表型特性即減毒特性、冷適應性和/或溫敏流感病毒病毒株，如實施例4所描述的人工改造的流感病毒A株；或者表17所列的一個或多個取代的氨基酸的人工改造的流感病毒B株都優選為主供體病毒株。[0110]在一個實施方式中，含有主流感病毒株6個內部基因(即PB1、PB2、PA、NP、Ml、NSl和NS2)和抗原性病毒株，即經預測可能引起明顯的局部或全球流感的病毒株來源的血凝素和神經酰胺酶片段的質粒被轉染到合適的宿主細胞內。重排列病毒在適于有效生長的溫度，即低于或等于35°C，如在約32°C到35°C之間，例如在約32°C到34°C之間，或約33°C下在細胞培養物中復制，然后收獲重排列病毒。另外，收獲的病毒還可以用變性劑如甲醛或β -丙內酯滅活。
[0111]減毒的、溫度敏感的和冷適應的流感病毒疫苗
[0112]在一個方面，本發明是基于確定導致優選的主供體病毒株產生ts表型的突變。為了確定單個核苷酸改變對于MDV病毒株基因組的功能重要性，分析了 A/AA/6/60病毒系內高度相關的病毒株來源的重排列病毒的溫敏流感病毒。兩個親本病毒的同基因特性可以使單核苷酸改變對ts表型的影響得以評價。相應的，MDV-A的ts表型在核苷酸水平上的基因基礎被映射到PB1、PB2和NP內的特異性氨基酸上。
[0113]以前有研究人員試圖利用共感染/重排列技術繪制ca A/AA/6/60的ts表型的基因基礎以制備出A/AA/6/60和不相關的野生型病毒株之間的單基因和多基因重排列病毒。這些研究表明PB2和PBl與ts表型都有關系(Kendal等，(1978) “重組病毒在亞理想溫度下的生化特性:有跡象表明ts損傷存在于RNA節段I和3，RNAl編碼病毒原轉錄酶，，(Biochemical characteristics of recombinant viruses derived at sub-optimaltemperatures:evidence that ts lesions are present in RNA segmentsland3，andthat RNAlcodes for the virion transcriptase enzyme)，734-743 頁，B.W.J.Mahy 和R.D.Barry (編)，Negative Strand Viruses, Academic Press ；Kendal 等，(1977) “野生型和冷突變(溫敏流感病毒)流感病毒的比較研究:重組的冷適應病毒H3N2的基質蛋白(M)和非結構蛋白(NS)的系譜學”(Comparative studies of wild-type and coldmutant (temperature sensitive)influenza viruses: genealogy of the matrix (M) andthe non-structural (NS)proteins in recombinant cold-adapted H3N2viruses)，J GenVirol37:145-159 ；Kendal等，(1979) “野生型和冷突變(溫敏流感病毒)流感病毒的比較研究:在突變型A/Ann Arbor/6/60與野生型H3N2病毒株重組的過程中病毒復制的溫敏流感病毒與病毒原轉錄酶活性的溫敏流感病毒是相互獨立的”(Comparative studies ofwild-type and cold-mutant(temperature sensitive)influenza viruses:1ndependentsegregation of temperature-sensitivity of virus replication fromtemperature-sensitivity of virion transcriptase activity during recombinationof mutant A/Ann Arbor/6/60with wild-tyoe H3N2strains),T Gen Virol,44:443-4560:Snyder等，(1988) “4個病毒基因對活流感A/Ann Arbor/6/60 (H2N2)冷適應重排列病毒疫苗的減毒活性的貢獻是獨立的” (Four viral genes independently contribute toattenuation of live influenza A/Ann Arbor/6/60(H2N2)cold-adapted reassortantvirus vaccines), T Virol62:488-95) ?但是這些研究的結果被兩株不同流感病毒A株來源的混合基因節段所導致的相互影響效應所混淆。通過A/AA/6/60和野生型基因節段而不是具有A/AA/6/60基因背景的表達ts表型的其他病毒株之間的改變可使相互作用減弱。相互影響效應也顯示出可混淆M基因組節段與att表型之間相互關系的解釋(Subbarao等，(1992)“流感病毒A/Ann Arbor/6/60冷適應病毒(H2N2) M基因所賦予的A/Korea/82 (H3N3)重排列病毒的減毒表型來自于基因相互影響效應”(The attenuation phenotypeconferred by M gene of the influenza A/Ann Arbor/6/60cold-adapted virus(H2N2)onthe A/Korea/82(H3N2)reassortant virus results from a gen constellation effect),Virus Res,25:37-50)。 [0114]在本發明中，導致氨基酸在PB1391、PB1581、PB1661、PB2265和NP34位置上發生取代的突變已被確定對于MDV-A株病毒的溫敏表型是具有功能意義的。正如本領域技術人員所理解的，在PB11195、PBl1766, PBl2005, PB2821和NP146位置上發生的核苷酸突變可分別導致在PB1391、PB1581、PB1661、PB2265和NP34位置上發生氨基酸取代。因此，任何能導致在這些位置上發生氨基酸取代的核苷酸改變都是本發明的特征。典型的突變包括單個突變PBl391 (K391E)、PBl581 (E581G) ,PBl661 (A661T)、PB2265 (N265S)和 NP34 (D34G)，優選的是聯合突變，結果導致病毒產生溫敏表型。同樣這些突變恢復到野生型ts表型就會消失，而將這些突變引入具有野生型基因背景的病毒中就可以使其具有ts表型。和病毒傳代期間這些表型的穩定性一致的是，單個變化不能使病毒的溫敏流感病毒回復到野生型病毒的水平。而且這些改變是在一起協調作用來完全表達ts表型的。這個發現可以使我們將其他溫敏流感病毒A株改造成適于制備減毒活流感疫苗的主供體病毒。
[0115]同樣，主供體病毒B株上每個氨基酸的改變都是與表17中所列的ts表型相關的。因此，本文所描述的方法適于通過在流感病毒B株基因組內引入一個或多個特異性突變來制備具有溫敏表型、還可以具有減毒表型和/或冷適應表型的新型流感病毒B株。例如，將一個或多個能導致在下列位置上發生氨基酸取代的突變引入到流感病毒B株基因組中制備溫敏 B 型流感病毒:PB263° ；PA431 ；PA497 ；NP55 ；NP114 ；NP410 ；NP510 ；M1159 和 Ml183。典型的氨基酸取代包括:PB2630 (S630R)、PA431(V431M)、PA497 (Y497H)、NP55 (T55A)、NP114(V114A)、NP41CI(P410H)、NP51CI(A510T)、M1159(H159Q)和 Ml183 (M183V)。
[0116]無論其制備方法如何，含有本發明的突變的流感病毒都是本發明的特征。也就是說本發明包括含有本發明的突變的流感病毒株，即在一個或多個下列位置上出現相對于野生型的氨基酸取代的任何A型流感病毒:PB1391、PB1581、PB1661、PB2265和NP34，或者在一個或多個下列位置上出現相對于野生型的氨基酸取代的任何B型流感病毒:PB263° ；PA431 ；PA497 ；NP55 ；NP114 ；NP410 ；NP510 ；M1159 和 Ml183，但是病毒株 ca A/Ann Arbor/6/60 和 B/AnnArbor/1/66不是本發明的特征。在某些優選的實施方式中，A型流感病毒含有一組(即2 個、3 個、4 個、5 個或更多個)如下突變:PB1391(K391E)、PBl581 (E581G)、PBl661 (A661T)、PB2265 (N265S)和 NP34(D34G) ;B 型流感病毒含有如下一組突變:PB263°(S630R)、PA431(V431M)、PA497 (Y497H)、NP55(T55A)、NP114(VlHA)、NP41CI(P410H)、NP51CI(A510T)、M1159(H159Q)和M1183(M183V)。例如，除了提供具有與疫苗制備有關的表型的病毒以外，含有一組突變，如1、2、3、4或5個選擇的突變，的病毒還可用于研究其他突變對病毒表型的影響。在某些實施方式中，流感病毒含有至少一個其他的非野生型核苷酸(可能導致其他的氨基酸改變)，這個核苷酸還可能賦予病毒期望的表型或對已有的期望表型進一步作出貢獻。[0117]細胞培養
[0118]病毒的增殖一般都是在培養宿主細胞的培養基中。適于流感病毒復制的宿主細胞包括Vero細胞、Per.C6細胞、BHK細胞、MDCK cells細胞和COS細胞，比如293T細胞、C0S7細胞。通常用上述兩種細胞系的共培養物，如MDCK細胞與293T細胞或COS細胞以1:1的比例共培養以提高復制的效率。細胞一般在標準的商用培養基中培養，如添加血清(如10%胎牛血清)的Dulbecco改進的Eagle培養基，或無血清培養基，控制濕度和CO2的濃度以維持適宜的中性緩沖pH(即pH在7.0到7.2之間)。另外，培養基中還可以加入抗生素以防止細菌生長，如青霉素、鏈霉素等，還可以加入營養物質如L-谷氨酰胺、丙酮酸鈉、非必須氨基酸、以及使細胞達到最佳生長狀態的添加劑，如胰蛋白酶、β -巰基乙醇等。
[0119]培養哺乳動物細胞的方法已有很多報道，都是本領域技術人員所熟知的。通用的培養過程見下列文獻的描述=Freshney(1983)動物細胞的培養:基本技術方法“(Culture of Animal Cells: Manual of Basic Technique), Alan R.Liss, New York ；Paul (1975)《細胞與組織培養》(Cell and Tissue Culture),第五版，Livingston,Edinburgh ；Adams (1980)《生物化學與分子生物學實驗室技術一生物化學家適用的細胞培養〉〉(Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Cell Culturefor Biochemists), Work 和 Burdon (編)，Elsevier, Amsterdam。有關在體外制備流感病毒的特殊組織培養方法的其他細節描述見Merten等，(1996) “在細胞培養物中制備流感病毒用于疫苗的制備” (Production of influenza virus in cell cultures for vaccinepreparation), Cohen 和 Shafferman (編)，《設計和制備疫苗的新策略》(Novel Strategiesin Design and Production of Vaccines),本文都已完整納入作為參考。另外，對這些方法進行改動以適用于本發明也是很容易通過常規試驗達到的。
[0120]用于制備流感病毒的細胞可在含血清的或無血清的培養基中培養。在某些情況下，如在制備純化的病毒時，希望宿主細胞在無血清培養基中生長。細胞可以小規模培養，如在含25ml以下培養基的培養皿或培養瓶中培養，也可以在大培養瓶中，如在回旋瓶中振蕩培養，或者在微載體微球(如DEAE-Dextran微載體微球,如Dormacel1、Pfeifer&Langen ；Superbead, Flow Laboratories ;苯乙烯共聚物-三-甲胺微球，如 Hillex, Solohill, AnnArbor)表面利用培養瓶或反應器培養。微載體微球是一種微小的球(直徑在100-200微米范圍內)，為單位體積細胞培養物中的粘附細胞的生長提供了一個較大的表面積。例如，I升培養基可包含2千萬以上的微載體微球,提供的生長表面超過8000mm2。對于商業用途的病毒制備，如疫苗制備來說，通常在生物反應器或發酵罐內培養細胞。生物反應器的體積小到I升以下，大到100升以上，如Cyto3生物反應器(Osmonics, Minnetonka,MN) ;NBS 生物反應器(New Brunswick Scientific, Edison, N.J.);來自 B.Braun BiotechInternational (B.Braun Biotech, Melsungen, Germany)的實驗室和商用規模的生物反應器。
[0121]在本發明中不論培養體積的大小，培養溫度維持在35°C或以下是十分重要的，這樣可以確保利用本文所描述的多質粒系統有效收獲重組病毒和/或重排列病毒。例如，細胞在約32°C到35°C之間的溫度下培養，一般在約32°C到34°C之間，最常用的是約33°C。 [0122]通常情況下用調節器如恒溫器或其他能探測及維持細胞培養系統溫度裝置來確保在病毒復制期間溫度不超過35°C。
[0123]載體導入宿主細胞
[0124]攜帶流感病毒基因組節段的載體按照本領域熟知的方法被導入(如轉染)到宿主細胞內從而將異源核酸引入真核細胞內，這些方法包括鈣磷酸鹽共沉淀法、電穿孔、微注射、脂質體介導以及利用多胺轉染試劑轉染。例如，載體如質粒可以利用多胺轉染試劑TransIT-LTl (Mirus)按照廠家的說明書導入到宿主細胞內，如COS細胞、293T細胞或者COS或293T細胞與MDCK細胞的混合物。約I μ g載體導入到宿主細胞群內需要約2 μ ITransIT-LTl，稀釋到160 μ I培養基中，優選無血清培養基，總體積為200 μ I。DNA:轉染試劑混合物在室溫下孵育45分鐘，然后加入800 μ I培養基。將轉染混合物加入宿主細胞，然后按照上述方法培養。照此來計算，在細胞培養物中制備重組病毒或重排列病毒時，含有8個基因組節段(PB1、PB2、PA、NP、M、NS、HA和NA)的載體與約20 μ I TransIT-LTl混合并轉染宿主細胞。另外，在轉染前可用無血清培養基，如Opt1-MEM I替換含血清的培養基，然后孵育4-6小時。
[0125]另外，也可以用電穿孔方法將含流感病毒基因組節段的載體導入到宿主細胞內。例如，含A型流感病毒或B型流感病毒的質粒載體優選利用電穿孔方法導入到Vero細胞內，過程如下:收獲5Χ106在添加10%胎牛血清(FBS)的改進的Eagle培養基(MEM)中生長的Vero細胞，重懸于0.4ml OptiMEM中，然后將細胞加入到電穿孔杯內。20 μ g DNA混合到25μ 1，然后加到含細胞的杯內，通過輕叩溫和混勻。按照廠家的說明書(BioRad GenePulser II with Capacitance Extender Plus connected)進行電穿孔，參數為 300伏、950微法，持續時間28-33秒。通過溫和敲打再混合細胞，電穿孔后約1-2分鐘將0.7ml含10%FBS的MEM直接加入到小杯內。然后將細胞轉移到標準6孔組織培養板的2個孔內，孔內含2ml MEM+ 10%FBS或無血清的OPT1-MEM。洗滌小杯以回收剩余的細胞，洗滌懸液分成兩孔。終體積約為3.5。然后再適合病毒生長的條件下孵育細胞，即冷適應株在約33°C培養。
[0126]病毒一般從培養基中回收，感染(或轉染)的細胞在培養基中生長。在濃縮流感病毒前一般要將粗分離的培養基澄清。常用的方法包括過濾、超濾、硫酸鋇吸附和洗脫以及離心。例如，感染培養物中粗分離的培養基首先在1000-2000Xg離心足夠時間進行澄清以去掉細胞碎片和其他的大顆粒物質，如離心10到30分鐘。另外，培養基還可以用0.8 μ m的醋酸纖維素濾器過濾以去除完整的細胞和其他大顆粒物質。另外，經澄清的培養基上清液還可以再離心以沉淀流感病毒，如15，000Xg離心約3-5小時。將病毒團重懸浮到合適的緩沖液，如 STE (0.01M Tris-HCl ；0.15M NACI ；0.0001M EDTA)或 ρΗ7.4 的磷酸鹽緩沖液(PBS)中后，利用蔗糖(60%-12%)或酒石酸鉀(50%-10%)密度梯度離心濃縮病毒。持續離心或分步驟離心都可以，如12%到60%之間的蔗糖梯度用4個12%步驟。梯度離心時要有足夠的轉速和時間以使病毒濃縮成可見的條帶以便于回收病毒。另外，對于最大規模的商業用途來說，不用密度梯度離心而用持續模式的帶狀離心轉子。下面文獻中所描述的其他細節足以指導本領域的技術人員在組織培養物中制備流感病毒:Furminger, “疫苗制備” (Vaccine Production), Nicholson 等(編)，《流感病毒教科書》(Textbook ofInfluenza) 324-332頁；Merten等，(1996) “在細胞培養物中制備流感病毒用于疫苗的制備，，(Production of influenza virus in cell cultures for vaccine preparation),Cohen和Shafferman(編)，《設計和制備疫苗的新策略》(Novel Strategies in Design andProduction of Vaccines)，141-151頁；以及美國專利5，690，937號。如果需要，回收的病毒還可以用蔗糖-磷酸鹽-谷氨酸鹽(SPG)作為穩定劑置于-80°C保存。
[0127]預防用疫苗的使用方法和組合物
[0128] 本發明的重組和重排列病毒可以混合在合適的載體或賦形劑內預防使用以刺激一個或多個流感病毒株特異性的免疫反應。載體或賦形劑通常都是藥用載體或賦形劑，如無菌水、鹽溶液、緩沖鹽溶液、葡萄糖溶液、甘油水溶液、乙醇、未感染的雞蛋的尿囊液(即正常的尿囊液"NAF")或溶液的混合物。這種溶液要按照本領域已知的方法制備以確保無菌、合適的pH、等滲性及穩定性。載體或賦形劑一般選擇能使變態反應或其他不良反應最小的,并且適合特定的給藥途徑,如皮下注射、肌肉注射、鼻內給藥等。
[0129]本發明的流感病毒一般都要給予足夠的量以刺激一個或多個流感病毒株特異性的免疫反應。流感病毒的使用最好能激發保護性的免疫反應。激發抗一種或多種流感病毒株保護性免疫反應的劑量和方法是本領域技術人員所熟知的。例如，滅活的流感病毒的給藥劑量約為1-1OOOHID5ci (人感染劑量)，即每個劑量內約含105_108pfu (噬菌斑形成單位)。另外，約10-50 μ g，如約15 μ g HA不添加佐劑給藥，或者以更小的劑量添加佐劑給藥。一般來說劑量在這個范圍內可以根據年齡、身體狀況、體重、性別、飲食、給藥時間以及其他臨床因素作出調整。預防性疫苗制劑可以用針頭和注射器，或者無針注射裝置皮下注射或肌肉注射系統給藥。另外，疫苗制劑還可以利用滴劑、大顆粒氣溶膠(大于10微米)鼻內給藥，或者通過噴霧噴入上呼吸道。雖然上述給藥途徑都可以激發保護性的全身免疫反應，但是鼻內給藥還有另外的優點，即可以在流感病毒進入部位激發粘膜免疫。對于鼻內給藥來說，減毒活病毒疫苗通常是優選的，即減毒的、冷適應的和/或溫敏流感病毒重組或重排列流感病毒。雖然利用單次劑量來刺激保護性免疫反應是優選的，但是通過相同的或不同的給藥途徑給予附加的劑量也可以達到預期的保護效果。
[0130]另外，通過體外或體內樹突狀細胞靶向性地與流感病毒相互作用也可以激發免疫反應。例如，增殖性的樹突狀細胞以足夠的劑量和足夠的時間與病毒接觸可以使樹突狀細胞捕獲流感病毒抗原。然后將細胞通過標準的靜脈移植方法轉移到被免疫的受試者內。
[0131]另外，保護性流感病毒或其亞單位的制劑還可以包含一種或多種佐劑以增強抗流感病毒抗原的免疫反應。適宜的佐劑包括:皂甙、礦物膠如氫氧化鋁、表面活性物質如溶血卵磷脂、普盧蘭尼克多元醇、聚陰離子、肽、油或烴乳劑、桿菌卡介苗(BCG)、小棒狀桿菌以及合成的佐劑QS-21和MF59。[0132]如果需要，預防性流感病毒疫苗還可以和一種或多種免疫刺激分子一同使用。免疫刺激分子包括各種細胞因子、淋巴因子和趨化因子，這些因子具有免疫刺激活性、免疫增強活性和原炎癥因子活性，如白細胞機介素(如IL-1，IL-2，IL-3，IL_4，IL-12，IL-13);生長因子(如粒細胞-巨噬細胞(GM)-集落刺激因子(CSF));以及其他免疫刺激分子，如巨噬細胞炎癥因子、Flt3配基、B7.1、B7.2等。免疫刺激分子可以和流感病毒在同一種制劑內，也可以和流感病毒分別給藥。蛋白質或編碼蛋白質的表達載體可以使用以產出免疫刺激效應。
[0133]在另一個實施方式種，本發明的含流感病毒基因組節段的載體可用于將異源核酸導入到宿主菌或宿主細胞內，如哺乳動物細胞，其中包括來源于人的細胞，并且與上述合適的藥用載體或賦形劑聯合使用。異源核酸通常被插入到基因或基因節段，如節段7的M基因的非必需區。異源多核苷酸序列編碼多肽或肽，或者RNA，如反義RNA或核酶。然后通過制備攜帶異源核酸的重組病毒將異源核酸引入宿主或宿主細胞內，病毒按照上面所描述的方法使用。
[0134]另外，本發明的含異源核酸的載體可通過共轉染的方式導入到感染流感病毒的細胞內并在宿主細胞內表達。然后還可以將細胞回輸到受體內，一般是回輸到細胞的來源部位。在某些應用方面，細胞可通過已有的細胞轉移或移植方法移植到感興趣的組織、器官或系統位點(如上所述)上。例如，造血細胞系的干細胞，如骨髓、臍帶血或外周血來源的造血干細胞可通過標準轉移或輸注技術轉移到受體內。
[0135]另外，含異源核酸的病毒也可以轉移到受體體內的細胞內。這種方法一般包括將載體顆粒注射給靶細胞群(血細胞、皮膚細胞、肝細胞、神經(包括腦)細胞、腎細胞、子宮細胞、肌肉細胞、腸細胞、頸細胞、陰道細胞、前列腺細胞等；以及各種細胞、組織、器官來源的腫瘤細胞)。可通過靜脈注射病毒顆粒系統給藥，也可以通過各種方法，如注射(利用針頭或注射器)、無針疫苗轉移、局部給藥或推入組織、器官或皮膚部位將病毒顆粒直接轉移到目的部位。例如，病毒載體顆粒可通過吸入、口服、靜脈注射、皮下注射、真皮下注射、真皮內注射、肌肉注射、腹腔注 射、氣管內注射、陰道或直腸注射，或者通過在手術過程中將病毒顆粒置于身體的腔隙或其他部位轉移。
[0136]上述方法可通過將本發明的含異源多核苷酸的載體引入體外或體內的靶細胞群用于治療性和/或預防性治療疾病或失調，其中異源多核苷酸編碼治療性或預防性多肽(或肽)或RNA (入反義RNA或核酶)。編碼目的多肽(或肽)或RNA的多核苷酸一般都連接有上面“表達載體”部分和“其他表達元件”部分所描述的適當調節序列。另外，一個載體或病毒可以插入多個異源編碼序列。例如，除了編碼治療性或預防性活性多肽或RNA外，載體還可以含有其他治療性或預防性多肽，如抗原、共刺激分子、細胞因子、抗生素等，和/或篩選標記等。
[0137]本發明的方法和載體可用于預防或治療多種疾病，包括遺傳疾病和獲得性疾病，如以疫苗的形式預防或治療由病毒、細菌等引起的疾病。
[0138]試劑盒
[0139]為了便于使用本發明的載體和載體系統，任何載體，如含有流感病毒共有序列的質粒、含有突變的流感病毒多肽的質粒、流感病毒多肽文庫質粒等，和用于包裝和感染實驗性或治療性流感病毒的其他組分，如緩沖液、細胞、培養基都可以包裝成試劑盒的形式。一般來說，除了上述組分外，試劑盒還包含其他材料，如使用本發明方法的說明書、包裝材料以及容器。
[0140]病毒核酸和蛋白質的操作
[0141]在本發明的范圍內，流感病毒核酸和/或蛋白質可按照已知的分子生物學技術操作。許多這種方法，包括擴增、克隆、突變、轉化等的詳細過程見下列文獻的描述=Ausubel等，《當前的分子生物學操作技術》(2000年增補)(Current Protocols in MolecularBiology(supplemented through2000)) John ffiley&Sons, New York ("Ausubel")；Sambrook 等，《分子克隆一實驗室手冊》(Molecular Cloning-A Laboratory Manual)
(第二版)，1_3 卷，Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York,1989 ("Sambrook")；以及Berger和Kimmel《分子克隆技術指導，酶學方法》，152卷，Academic Press, Inc., San Diego,CA(〃Berger〃)。
[0142]除了上述文獻外，其他可用于擴增本發明的cDNA探針的體外擴增技術操作方法，如多聚酶鏈式反應(PCR)、連接酶鏈式反應(LCR)、Qi3 -復制酶擴增以及其他RNA聚合酶介導的技術OnNASBA)可見于下列文獻的描述=Mullis等，(1987)美國專利4，683，202號；《PCR 技術一方法和應用指導》(PCR Protocols A Guide to Methods and Applications)(Innis 等編)，Academic Press Inc.San Diego, CA(1990)(〃Innis〃)；Arnheim 和Levinson(1990)C&EN36 ；The Journal Of NIH Research(1991)3:81 ;Kwoh 等，(1989)ProcNatl Acad Sci USA86,1173 ;Guatelli等，(1990)Proc Natl Acad Sci USA87:1874 ；Lomell等，(1989)J Clin Chem35:1826 ;Landegren等,(1988)Science241:1077 ；Van Brunt(1990)Biotechnology8:291 ;Wu 和 Wallace (1989)Gene4:560 !Barringer 等，(1990)Gene89:117以及Sooknanan和Malek, (1995) Biotechnology 13:563。其他可用于克隆本發明的核酸的方法見于Wallace等，5，426，039號。通過PCR擴增大片段核酸的改進方法見綜述Cheng等，(1994)Nature369:684及其參考文獻。
[0143]本發明的某些多核苷酸，如寡核苷酸可利用各種固相技術合成，其中包括單核苷酸-和/或三核苷酸亞磷酰胺耦合化學。例如，核酸序列可通過將活化的單體或三體順序添加到延伸的多核苷酸鏈上來合成，見Caruthers, M.H.等，(1992)Meth Enzymol 211:3。
[0144]除了合成所需要的序列以外，還可以從各個商家訂購基本的核酸序列，如 Midland Certified Reagent Company(mcrcioligos.com), The Great AmericanGene Company(www.genc0.com), ExpressGen, Inc.(www.expressgen.com), OperonTechnologies, Inc.(www.0peron.com)等。
[0145]另外，取代病毒多肽上的指定氨基酸可通過位點特異性突變來實現。例如，含有在功能上與表型特征，如減毒表型、冷適應性、溫敏流感病毒相關的取代的氨基酸的病毒多肽可通過將特異性的突變引入編碼多肽的病毒核酸片段上來制備。位點特異性突變的方法是本領域熟知的，見上述Ausubel、Sambrook和Berger的描述。許多位點特異性突變試劑盒都可以買到，如Chameleon定點誘變試劑盒(Stratagene,La Jolla),可按照廠家的操作說明書進行操作，將表6或 表17中所描述的一個或多個氨基酸取代引入到編碼流感病毒A或B多肽的基因組節段中。
實施例[0146]實施例l:pAD3000的構建
[0147]質粒pHW2000 (Hoffmann等，(2000) “用于從8個質粒開始制備流感病毒A的DNA轉染系統，，(A DNA transfection system for generation of influenza A virus fromeight plasmids) Proc Natl Acad Sci USA97:6108-6113)經過改造,用猿病毒 40 (SV40)來源的多聚腺苷酸信號序列代替牛生長激素(BGH)多聚腺苷酸信號。
[0148]SV40來源的序列用下列寡核苷酸通過Taq MasterMix (Qiagen)擴增，方向為5’到3’:
[0149]polyA.1:AACAATTGAGATCTCGGTCACCTCAGACATGATAAGATACATTGATGAGT(SEQ IDNO:1)
[0150]polyA.2:TATAACTGCAGACTAGTGATATCCTTGTTTATTGCAGCTTATAATGGTTA(SEQ IDNO: 2)
[0151]用質粒pSV2His作為模板。按照廠家的說明書用Topo TA cloningvector (Invitrogen)擴增出一個與預測一致的175bp產物,然后克隆到pcDNA3.1中。用EcoRV和BstEII將所需要的含SV40多聚腺苷酸信號的138bp的片段從所得到的質粒上切下，瓊脂糖凝膠電泳分離，然后利用常規方法(見Ausubel, Berger, Sambrook)克隆到pHW2000的獨特PvuII和BstEII位點上。所得到的質粒pAD3000 (圖1)經測序發現含有SV40多聚腺苷酸位點并且方向正確。pAD3000上的核苷酸295-423相對于SV40株777(AF332562)上的核苷酸 2466-2594。
[0152]實施例2:制備MDV-A的8質粒系統
[0153]通常用冷適應性 的A型流感病毒突變株A/AA/6/60作為主供體病毒制備鼻內給藥的A型流感疫苗。這個病毒株在本發明中是典型的主供體病毒(MDV)。為了簡化，本文將這個A/AA/6/60突變株命名為MDV-A。MDV-A病毒RNA用RNeasy迷你試劑盒(Qiagen)提取，8個相應的cDNA片段用表1所列引物通過RT-PCR擴增。
[0154]表1.用于克隆MDV-A8個節段的引物序列
[0155]
【權利要求】
1.一種雙向表達載體，該載體含有: 攜帶第一啟動子的質粒，其中第一啟動子位于第二啟動子和雙向多聚腺苷酸位點之間。
2.如權利要求1所述的載體，其中，所述第一和第二啟動子方向相反，位于至少一個克隆位點兩側。
3.如權利要求1所述的載體，其中，所述雙向多聚腺苷酸位點包括SV40多聚腺苷酸位點。
4.如權利要求1所述的載體,包括pAD3000 。
5.如權利要求1所述的載體,該載體還含有一個雙鏈核酸,該核酸包含至少一個插入到克隆位點內的流感病毒基因組節段。
6.如權利要求1所述的載體，其中，所述第一啟動子和第二啟動子可操作連接到同一雙鏈病毒核酸的兩條鏈上，該病毒核酸含有流感病毒基因組節段。
7.如權利要求1所述的雙向表達載體，該載體包含: 攜帶位于第二啟動子和SV40多聚腺苷酸位點之間的第一啟動子的質粒， 其中，所述第一和第二啟動子方向相反，位于至少一個流感病毒基因組節段兩側。
8.一種試劑盒，所述試劑盒含有權利要求1所述的一種或多種表達載體，以及一種或多種下列組分:細胞、緩沖液、細胞培養基、說明書、包裝材料和容器。
9.如權利要求8所述的試劑盒，所述試劑盒包含一組表達載體,其中每個表達載體含有至少一個流感病毒基因組節段。
10.如權利要求9所述的試劑盒，所述試劑盒包含攜帶第一流感病毒株至少6個內部基因組節段的一組表達載體，所述流感病毒株至少具有下列一種表型特征:溫度敏感性、冷適應性及減毒特性。
11.如權利要求9所述的試劑盒，其中，所述表達載體含有編碼突變的HA和/或NA抗原的核酸文庫。
12.—種組合物,所述組合物包括: 含有至少一種細胞的能在低于或等于35°C的溫度下增殖性生長的細胞培養物，其中至少有一種細胞含有一組載體，該組載體含有流感病毒基因組。
13.如權利要求12所述的組合物，該組合物還含有細胞培養基。
14.如權利要求12所述的組合物，其中，該組載體包括雙向表達載體。
15.如權利要求14所述的組合物，所述雙向表達載體攜帶位于第二啟動子和SV40多聚腺苷酸位點之間的第一啟動子的質粒； 其中，所述第一和第二啟動子方向相反，位于至少一個流感病毒節段兩側。
16.—種細胞培養系統,該系統包括: 含有至少一種細胞的增殖性生長的細胞培養物，其中至少有一種細胞含有一組載體，該組載體含有流感病毒基因組；以及 能在低于或等于35°C的溫度下培養細胞培養物的調節劑。
17.如權利要求16所述的細胞培養系統，該系統還包括細胞培養基。
18.如權利要求16所述的細胞培養系統,其中,這組載體包括雙向表達載體。
19.如權利要求16所述的細胞培養系統，所述雙向表達載體攜帶位于第二啟動子和SV40多聚腺苷酸位點之間的第一啟動子的質粒； 其中第一和第二啟動子方向相反，位于至少一個流感病毒基因組節段兩側。
20.人工改造的重組或重排列流感病毒，該病毒包含在選自PB1391、PB1581、PB1661、PB2265和NP34的位置上有一個或多個氨基酸取代的A型流感病毒株；或在選自PB263°、PA431、PA497、NP55、NP114、NP410、NP509、Ml159和Ml183的位置上有一個或多個氨基酸取代的B型流感病毒株。
21.如權利要求20所述的流感病毒，其中，所述A型流感病毒含有一個或多個選自PB1391(K391E)、PBl581 (E581G)、PBl661 (A661T)、PB2265 (N265S)和 NP34 (D34G)的氨基酸取代；或其中所述B型流感病毒含有一個或多個選自PB263°(S630R)、PA431 (V431M)、PA497 (Y497H)、NP55 (T55A)、NP114 (VI14A)、NP410 (P410H)、NP509 (A509T)、Ml159 (H159Q)和 Ml183 (M183V)的氨基酸取代。
22.如權利要求20所述的A型流感病毒，該病毒包含一組選自PB1391(K391E)、PBl581 (E581G)、PBl661 (A661T)、PB2265 (N265S)和 NP34 (D34G)的氨基酸取代。
23.如權利要求20所述的A型流感病毒，該病毒包含一組由PBl391(K391E)、PBl581 (E581G)、PBl661 (A661T)、PB2265 (N265S)和 NP34 (D34G)構成的氨基酸取代。
24.如權利要求20所述的B型流感病毒，該病毒包含一組選自PB263°(S630R)、PA431(V431M)、PA497 (Y497H)、NP55(T55A)、NP114(VlHA)、NP41CI(P410H)、NP509 (A509T)、M1159(H159Q)和 M1183(M183V)的氨基酸取代。
25.如權利要求20所述的B型流感病毒，該病毒包含一組由PB263°(S630R)、PA431(V431M)、PA497 (Y497H)、NP55(T55A)、NP114(VlHA)、NP41CI(P410H)、NP509 (A509T)、M1159(H159Q)和M1183(M183V)構成的氨基酸取代。
26.如權利要求20所述的A型流感病毒，該病毒包含A型流感病毒株PR8。
27.如權利要求20所述的流感病毒，其中，所述流感病毒具有下列一種或多種表型特征:溫度敏感性、冷適應性及減毒特性。
28.如權利要求20所述的流感病毒，該病毒還含有至少一種其他非野生型氨基酸。
29.如權利要求20所述的流感病毒，其中，所述流感病毒在雪貂減毒試驗中復制至少下降 3.0 個 log5(l。
30.如權利要求20所述的流感病毒，其中，所述流感病毒在雪貂減毒試驗中無法檢測到其復制。
31.一種制備溫敏(ts)流感病毒的方法，所述方法包括: (a)在A型流感病毒基因組中引入至少一個能在選自:PB1391、PB1581、PB1661、PB2265和NP34的位置上導致氨基酸取代的突變，或在B型流感病毒基因組中引入至少一個能在選自:PB263°、PA431、PA497、NP55、NP114、NP41°、NP5°9、M1159 和 Ml183 的位置上導致氨基酸取代的突變；以及 (b)在能制造病毒的條件下復制突變的流感病毒基因組。
32.如權利要求31所述的方法，其中，所述A型流感病毒基因組包含PR8基因組。
33.如權利要求31所述的方法，所述方法包括引入至少一個編碼下列取代的氨基酸的突變到 A 型流感病毒基因組中:PB1391 (K391E)、PB1581 (E581G)、PB1661 (A661T)、PB2265 (N265S)和NP34(D34G);或者引入至少一個編碼下列取代的氨基酸的突變到B型流感病毒基因組中:PB2630 (S630R)、PA431 (V431M)、PA497 (Y497H)、NP55(T55A)、NP114(V114A)、NP41CI(P410H)、NP509 (A509T)、Ml159 (H159Q)和 Ml183 (M183V)。
34.如權利要求31所述的方法，所述方法包括引入一組編碼下列取代的氨基酸的突變到 A 型流感病毒基因組中:PB1391(K391E)、PBl581 (E581G)、PBl661 (A661T)、PB2265 (N265S)和NP34(D34G);或者引入一組編碼下列取代的氨基酸的突變到B型流感病毒基因組中:PB2630 (S630R)、PA431 (V431M)、PA497 (Y497H)、NP55(T55A)、NP114(VlHA)、NP41CI(P410H)、NP509 (A509T)、Ml159 (H159Q)和 Ml183 (M183V)。
35.如權利要求31所述的方法，所述方法包括引入能導致下列一組氨基酸取代的突變到 A 型流感病毒基因組中:PB1391(K391E)、PBl581 (E581G)、PBl661 (A661T)、PB2265 (N265S)和NP34(D34G);或者引入能導致下列一組氨基酸取代的突變到B型流感病毒基因組中:PB2630 (S630R)、PA431 (V431M)、PA497 (Y497H)、NP55(T55A)、NP114(VlHA)、NP41CI(P410H)、NP509 (A509T)、Ml159 (H159Q)和 Ml183 (M183V)。
36.如權利要求31所述的方法，所述方法包括在雞蛋內復制突變的流感病毒基因組。
37.如權利要求31所述的方法，所述方法包括在細胞培養物內復制突變的A型流感病毒基因組。
38.如權利要求37所述的方法，該方法還包括在雞蛋內擴增病毒。
39.如權利要求37所述的方法，所述方法包括在低于或等于35°C的溫度下培養細胞。
40.如權利要求37所述的方法，其中，所述細胞培養物含有Vero細胞、MDCK細胞、293T細胞和COS細胞中的一種或多種。
41.一種制備流感病毒減毒活疫苗的方法，所述方法包括: (a)引入至少一個能導致下列氨基酸取代的突變到A型流感病毒基因組中:PB1391、PB1581、PB1661、PB2265和NP34 ;或者引入至少一個能導致下列氨基酸取代的突變到B型流感病毒基因組中:PB2630、PA431、PA497、NP55、NP114、NP41。、NP5。9、Ml159 和 Ml183 ； (b)在能制造病毒的條件下復制突變的流感病毒基因組；以及 (c)回收流感病毒。
42.如權利要求41所述的方法，其中，所述流感病毒含有編碼至少來源于第二病毒株的HA和NA抗原的基因組節段。
43.如權利要求42所述的方法，其中，所述HA和NA抗原能激發抗至少一種流感病毒株的保護性免疫反應。
44.一種人工改造的重組或重排列的溫敏(ts)A型流感病毒，該病毒含有至少一個選自PB1391、PBl581、PBl661、PB2265和NP34的引入的氨基酸取代。
45.如權利要求44所述的溫敏A型流感病毒，該病毒含有至少一個選自PBl391(K391E)、PBl581 (E581G)、PBl661 (A661T)、PB2265 (N265S)和 NP34 (D34G)的引入的氨基酸取代。
46.如權利要求44所述的溫敏A型流感病毒，該病毒含有一組選自PBl391(K391E)、PBl581 (E581G)、PBl661 (A661T)、PB2265 (N265S)和 NP34 (D34G)的引入的氨基酸取代。
47.如權利要求44所述的溫敏A型流感病毒，該病毒含有一組由PBI391 (K391E)、PBl581 (E581G)、PBl661 (A661T)、PB2265 (N265S)和 NP34 (D34G)構成的引入的氨基酸取代。
48.如權利要求44所述的溫敏A型流感病毒，其中，所述溫敏A型流感病毒與野生型A型流感病毒相比在39°C時其生長下降約在2.0到5.0log10之間。
49.如權利要求48所述的溫敏A型流感病毒，其中，所述溫敏A型流感病毒與野生型A型流感病毒相比在39°C時其生長分別下降:至少約2.0logltl，至少約3.0logltl，至少約4.0log10 以及至少約 4.51og10。
50.如權利要求44所述的溫敏A型流感病毒，其中，所述A型流感病毒與野生型A型流感病毒相比在雪貂減毒試驗中其生長下降約在2.0到5.0log10之間。
51.如權利要求50所述的溫敏A型流感病毒，其中，所述A型流感病毒在雪貂減毒試驗中其生長分別下降:至少約2.0log10,至少約3.0log10以及至少約4.0log10O
52.如權利要求44所述的重排列的溫敏A型流感病毒，該病毒含有一個或多個編碼至少一個來源于第二 A型流感病毒株的HA或NA抗原的基因組節段。
53.一種重組或重排列的A型流感病毒疫苗，該疫苗含有包含一組選自PB1391、PB1581、PB1661、PB2265和NP34的引入的氨基酸取代的A型流感病毒或A型流感病毒蛋白。
54.一種重組或分離的核酸，其含有編碼A型流感病毒多肽的多核苷酸序列，所述A型流感病毒多肽在選自PB1391、PBl581、PBl661、PB2265和NP34的位置上有一個或多個弓丨入的氨基酸取代。
55.一種重組或分離的A型流感病毒多肽，其在選自PB1391、PBl581、PBl661、PB2265和NP34的位置上包含一個或多個氨基酸取代。
56. 一種人工改造的重組或重排列的溫敏(ts)B型流感病毒，該病毒含有至少一個選自 PB263Q (S630R)、PA431 (V431M)、PA497 (Y497H)、NP55 (T55A)、NP114(V114A)、NP41CI(P410H)、NP509 (A509T),M1159 (H159Q)和 Ml183 (M183V)的引入的氨基酸取代。
57.如權利要求56所述的溫敏B型流感病毒，該病毒含有至少一個選自PB263°(S630R)、PA431(V431M)、PA497 (Y497H)、NP55(T55A)、NP114(VlHA)、NP41CI(P410H)、NP509 (A509T)、M1159(H159Q)和M1183(M183V)的引入的氨基酸取代。
58.如權利要求56所述的溫敏B型流感病毒，該病毒含有一組選自PB263°(S630R)、PA431(V431M)、PA497 (Y497H)、NP55(T55A)、NP114(VlHA)、NP41CI(P410H)、NP509 (A509T)、M1159(H159Q)和M1183(M183V)的引入的氨基酸取代。
59.如權利要求56所述的溫敏B型流感病毒，該病毒含有一組由PB263°(S630R)、PA431(V431M)、PA497 (Y497H)、NP55(T55A)、NP114(VlHA)、NP41CI(P410H)、NP509 (A509T)、M1159(H159Q)和M1183(M183V)構成的引入的氨基酸取代。
60.如權利要求56所述的溫敏B型流感病毒，其中，所述溫敏A型流感病毒與野生型B型流感病毒相比在39°C時其生長下降約在2.0到5.0log10之間。
61.如權利要求60所述的溫敏B型流感病毒，其中，所述溫敏B型流感病毒在39°C時其生長分別下降:至少約2.0logltl,至少約3.0logltl,至少約4.0log10以及至少約4.51og10。
62.如權利要求56所述的溫敏B型流感病毒，其中，所述B型流感病毒與野生型B型流感病毒相比在雪貂減毒試驗中其生長下降約在2.0到5.0log10之間。
63.如權利要求62所述的溫敏B型流感病毒，其中，所述B型流感病毒在雪貂減毒試驗中其生長分別下降:至少約2.0logltl,至少約3.0log10以及至少約4.0log10O
64.如權利要求56所述的重排列的溫敏B型流感病毒，該病毒含有一個或多個編碼至少一個來源于第二 B型流感病毒株的HA或NA抗原的基因組節段。
65.一種重組或重排列的B型流感病毒疫苗，該疫苗含有包含一組選自PB263°、PA431、PA497、NP55、NP114、NP410、NP509、Ml159和Ml183的引入的氨基酸取代的B型流感病毒或B型流感病毒蛋白。
66.一種重組或分離的核酸，其含有編碼B型流感病毒多肽的多核苷酸序列，所述B型流感病毒多肽在選自 PB263°、PA431、PA497、NP55、NP114、NP410、NP509、Ml159 和 Ml183 的位置上含有一個或多個引入的氨基酸取代。
67.一種重組或分離的B型流感病毒多肽，其含有一個或多個選自PB263°、PA431、PA497、NP55、NP114、NP410、NP509、Ml159 和 Ml183 的引入的氨基酸取代。
68.—種在細胞培養物中制備B型流感病毒的方法，所述方法包括: i)將一組含B型流感病毒基因組的載體導入到一群宿主細胞內，該宿主細胞群能夠支持流感病毒的復制； ?)在允許病毒復制的條件下培養該群宿主細胞；以及 iii)回收一組B型流感病毒。
69.如權利要求68所述的方法，所述方法包括在細胞培養物中制備B型流感病毒的無輔助病毒方法，該方法為在無輔助病毒存在的條件下將一組含B型流感病毒基因組的載體導入到一群宿主細胞內。
70.如權利要求68所述的方法，所述方法包括在低于或等于35°C的溫度下培養宿主細胞群。
71.如權利要求68所述的方法，所述方法包括在32°C到35°C之間的溫度下培養宿主細胞群。
72.如權利要求68所述的方法，所述方法包括在32°C到34°C之間的溫度下培養宿主細胞群。
73.如權利要求68所述的方法，所述方法包括在約33°C培養宿主細胞群。
74.如權利要求68所述的方法，所述方法包括回收重組流感病毒。
75.如權利要求68所述的方法，所述方法包括回收重排列流感病毒。
76.用權利要求68所述方法制備的流感病毒。
【文檔編號】C12N15/87GK103540613SQ201310365550
【公開日】2014年1月29日 申請日期:2003年4月25日 優先權日:2002年4月26日
【發明者】E·霍夫曼, H·金, B·盧, G·杜克, G·W·坎寶 申請人:米迪繆尼有限公司