一種合歡葉片中的內生菌h6菌株分離方法及其應用的制作方法
【專利摘要】本發明涉及一種合歡葉片中的內生菌H6菌株分離方法及其應用，該分離方法包括：采用75%（體積分數）酒精浸泡2min，再用10%次氯酸鈉溶液浸泡3min，無菌水沖洗2-3次，可達到合歡葉片表面最佳的消毒效果和內生菌H6分離的最適條件。本發明經試驗證明H6菌株、發酵液、無菌株發酵液及其從H6發酵液中分得的活性組分對供試的植物病原菌蘋果腐爛病菌，葡萄黑痘病菌、西瓜枯萎病菌、小麥赤霉病菌等均具有較強的抑制作用。本發明采用液-液萃取法對內生菌H6的代謝液提取，得10個組分，其中活性高的組分1、2和8樣品硅烷化衍生后進行GC-MS檢測，鑒定出其中脂肪酸、芳香酸、環二肽、甾醇類等25種具抗菌活性的物質。
【專利說明】一種合歡葉片中的內生菌H6菌株分離方法及其應用【技術領域】[0001]本發明涉及一種新篩選的合歡內生細菌，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏名H6解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens),保藏號: CGMCC N0.:7990 ;保藏單位地址:北京市朝陽區北辰西路I號院3號，中國科學院微生物研究所；保藏時間:2013年8月13日。該菌及發酵液中的活性成分對可引起植物病害的病原真菌具有顯著的抑菌活性，可制備成生物農藥，用于田間病害的防治。技術背景[0002]合歡內生菌H6 (保藏編號CGMGG N0.:7990)自山東省青島市城陽區青島農業大學校園內種植的合歡(Albizzia julibrissin Durazz.)葉片中篩選出的具有抑菌活性的內生細菌，經過大量室內實驗研究結果表明它對蘋果腐爛病菌、葡萄黑痘病菌、西瓜枯萎病菌、小麥赤霉病菌等植物病原菌具有較高的生物活性，可用于相應田間病害的防治。[0003]長期以來，我國農藥生產以仿制為主，知識產權的保護和市場競爭的形勢迫使我國必須將創制新藥的研究放在重要位置。我國天然藥物資源豐富、經濟基礎相對比較薄弱， 從天然產物中尋找創新藥物適合現階段國情。隨著分離分析技術的進步，許多結構復雜及微量成分獲得純品并確定其化學結構成為可能，極大地豐富了天然藥物的來源。近幾年，藥用植物新資源的尋找集中在其內生菌方面。傳統藥用植物中都存在很多內生菌，其在進化過程中發生了基因重組，獲得了宿主的某些基因，能夠產生與宿主植物相同或更新穎的代謝產物，有研究顯示，51%的從植物內生真菌分離的生物活性物質是以前沒有發現的化合物，其化學結構種類遠遠高于植物本身及土壤微生物。已有報道其代謝產物具有抑菌、抗氧化及抗腫瘤等多種活性，這一特點使藥用植物內生菌成為人們尋找天然藥物和生物活性物質的新方向，同時在保護珍稀瀕危植物方面也具有重要價值。[0004]合歡(Albizzia julibrissin Durazz.)系豆科合歡屬植物,產于我國黃河流域及以南各地，朝鮮、日本、越南、印度等 地也有分布，資源非常豐富。合歡花的干燥花序，是常用中藥。現代研究表明，由于合歡本身含有機酸、留醇及其苷、黃酮類化合物、神經酰胺及神經鞘苷等多種活性物質，具有抗過敏、抗腫瘤、抗炎抗菌、免疫增強、鎮靜安神、抗抑郁、抗氧化等多種藥理活性作用，越來越引起國內外相關學者的關注。趙杰等研究表明合歡葉提取物對黃瓜霜霉病有很好的預防作用。楊秀娟等研究表明，合歡葉提取物在24h內對南方根結線蟲的抑制率在50%以上，且其殺卵率達到81.41%。劉峰等初步研究了合歡葉提取物對油菜茵核病菌的抑制作用，金玉蘭與賈福麗研究表明，合歡莖葉正丁醇萃取物對油菜菌核、蘋果腐爛病、辣椒炭疽病等病菌均有一定的防治效果，說明合歡莖葉提取物中確實存在抑菌物質，而且具有一定的抑菌譜。對于合歡中內生菌的研究，至今僅見國內有零星報道，繆莉等自合歡樹皮中分離出7株內生菌用于抗腫瘤活性的篩選。楊嘉等從不同地區的合歡組織中分離到268株內生真菌菌株，進行了總抗氧化活性的篩選。鄭志斌從采集到的合歡組織中分離、純化得到5株內生真菌，通過產孢形態進行菌種鑒定。鑒于合歡葉的提取物具有良好的殺菌、抗腫瘤、抗氧化活性，從其中分離出的內生菌也具有多種生物活性，具有進行深入研究的必要，本發明基于前期近三年的自合歡葉中進行具抗菌活性的內生菌分離篩選，經試驗研究發現，合歡內生細菌H6菌體，發酵液、無菌代謝產物、發酵液中活性組分均具有較強的抑菌活性。
【發明內容】
[0005]本發明提供了一株新用途的合歡內生細菌(解淀粉芽孢桿菌)H6菌株，它對多種植物病原真菌的菌絲生長具有明顯的抑制作用。合歡葉片表面消毒的最佳組合為，葉片用75% (體積分數)酒精浸泡2min，再用10%次氯酸鈉溶液浸泡3min左右即可達到合歡葉片表面的徹底消毒。所分得的菌株H6在LB固體培養基和LB液體培養基中的培養溫度為30-32°C， 轉速180rpm/min，培養時間為24_48h，培養24h的種子液，按5%的接種量接種于發酵培養基，發酵液PH為6.8-7.2。該菌株的菌落在LB培養基上類似圓形，有隆起，不透明，干燥，菌落邊緣為鋸齒狀，表面褶皺，正反面顏色一致呈淺黃色。經革蘭氏染色觀察，為G+性，桿狀細菌，長度為1.17-1.43um，形成芽孢，中生。經17項生理生化指標測定，結合16SrRNA序列比對與系統發育樹歸屬，結果表明，其與已知Bacillus amyloliquefaciens序列同源性 ^ 99%，初步鑒定其為是解淀粉芽孢桿菌。[0006]本發明優化了合歡葉片表面消毒和其內生菌H6分離的方法，采用75%(體積分數) 酒精浸泡2min，再用10%次氯酸鈉溶液浸泡3min，無菌水沖洗2_3次，即可達到合歡葉片表面最佳的消毒效果和內生菌H6分離的最適條件。[0007]本發明經試驗證明H6菌株、發酵液、無菌株發酵液及其從H6發酵液中分得的活性組分對供試的植物病原菌蘋果腐爛病菌，葡萄黑痘病菌、西瓜枯萎病菌、小麥赤霉病菌等均具有較強的抑制作用，目的在于從藥用植物合歡中尋找具有生防效果的內生菌，并發現具有抗菌活性的新穎結構物質，為新生物農藥的開發提供模板。[0008]本發明采用液-液萃取法對內生菌H6的代謝液(30L)分別以石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取，將具有抑菌活性的乙酸乙酯層進行柱層析，得10個組分，其中活性高的組分 1、2和8樣品硅烷化衍生后進行GC-MS檢測，經GC-MS聯用儀標準質譜數據庫NIST2005的檢索，鑒定出其中脂肪酸、芳香酸、環二肽、留醇類等25種具抗菌活性的物質。[0009]本發明具有以下特點:[0010]1、H6菌株分離自于藥用植物，在與植物長期共生的條件下，其基因發生變化，可以代謝出藥用植物本身具有的一些獨特的活性成份，為新農藥的創制提供結構新穎的模板。[0011]2、H6菌株為解淀粉芽孢桿菌，其適應性強，易培養，抗菌活性物質產率高。其分離自植物，為內生菌，對作物無致病性，而對靶標病原菌具有良好的生防效果。滿足開發成生物農藥的要求，具有安全、與環境相容性好的特性。[0012]3、內生菌H6菌體本身、發酵液、無菌代謝產物及代謝物中活性組分均具有抑菌作用。經過室內試驗證明，本發明中申請保護的合歡內生細菌H6對蘋果腐爛病、葡萄黑痘病、 西瓜枯萎病、小麥赤霉病等的具有潛在的防治作用，對作物安全、殺菌譜較廣。【專利附圖】

【附圖說明】[0013]圖1H6系統發育樹構建 [0014]圖2、形態學實驗[0015]圖3、革蘭氏染色實驗[0016]圖4乙酸乙酯層對蘋果輪紋病菌抑制作用[0017]圖5乙酸乙酯層對小麥全蝕病菌抑制作用[0018]圖6乙酸乙酯層對棉花枯萎病菌抑制作用[0019]圖7乙酸乙酯層對蘋果腐爛病菌抑制作用[0020]圖8組分F1、F2、F6對蘋果腐爛病菌的抑制作用效果[0021]圖9組分F1、F2、F8對蘋果輪紋病菌的抑制作用效果[0022]圖10組分F2、F3、F8、F9對小麥全蝕病菌病菌的抑制作用效果[0023]圖11組分FI的總離子流圖[0024]圖12組分F2的總離子流圖[0025]圖13組分F8的總離子流圖[0026]圖14組分F1、F2、F8中24種化合物質譜圖與組分F1、F2、F8中25種化合物質譜圖【具體實施方式】[0027]實施例1.合歡內生細菌(Bacillus amyloliquefaciens) H6分離純化方法[0028](I)合歡葉片表面最佳消毒方法與時間的篩選[0029]采用組織印記法對消毒時間進行篩選。具體操作為:選取新鮮無病斑的合歡葉， 用流水沖凈葉片的表面lOmin，然后用無菌水沖洗3-4次，再用75% (體積分數)酒精消毒， 消毒時間設定為2min、3min、5min，再用10%次氯酸鈉溶液再次消毒，消毒時間分別設定為 2min、3min、5min、IOmin,將不同處理時間的組織小塊用無菌水沖洗3_5次,吸取最后一次的無菌水沖洗液100 μ L涂布于培養基表面作為對照I ;另外，將消毒后的葉片表面接觸LB 培養基2-3min后取出作為對照2。用解剖刀將消毒后葉片剪成5mmX 5mm小塊，然后接種在 LB平板培養基(9cm)上，每皿接3塊，每處理3次重復，于30°C恒溫培養箱避光培養2_3d。 若各對照培養皿中沒有菌落出現，并且相對應的消毒葉片有菌落出現，則證明表面消毒方法合適，選取這一組合方法作為最佳消毒方法。經組織印記法檢驗消毒效果，確定較為合適的合歡葉片組織表面消毒方法為:75% (體積分數)酒精浸泡2min，再用10%次氯酸鈉溶液浸泡3min左右即可達到合歡葉片表面的徹底消毒。[0030](2)合歡內生細菌H6的分離純化[0031]采用組織塊法，無菌條件下，取表面消毒處理后的合歡葉片表面接觸LB培養基 2-3min后取出，作為對照。用解剖刀將消毒后葉片剪成5mmX 5mm小塊,然后接種在LB平板培養基上，于30°C恒溫培養箱黑暗培養2-3d，根據菌落形態、顏色等挑取單菌落，采用平板劃線分離培養法純化，直至獲得純培養，命名為H6。[0032]實施例2.H6菌株的`鑒定特征[0033]( I)菌體形態觀察和染色反應[0034]將H6接種于LB培養基上，2_3d后觀察，菌落為圓形，干燥，菌落邊緣為鋸齒狀，菌落扁平，不透明，正反面顏色一致為淡黃色。經革蘭氏染色觀察，為G+性，桿狀細菌，長度為 1.17-1.43um，形成芽孢，中生。[0035](2 ) H6的生理生化特性[0036]觸酶實驗、淀粉水解、卵磷脂酶、V-P測定、檸檬酸鹽的利用、酪朊水解、吲哚、硝酸鹽還原、丙二酸鹽的利用等實驗項目均為陽性，而明膠液化、運動性、甲基紅實驗、脲酶、酪氨酸水解、苯丙氨酸脫氨酶、纖維素分解等實驗項目均顯陰性。[0037]表1H6菌株生理生化特性
【權利要求】
1.一種合歡內生菌H6，分離自山東省青島市城陽區種植的合歡葉片中，由中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏名H6解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens),保藏號:CGMCC N0.:7990。
2.根據權利要求1所述的一種合歡內生菌H6，其特征在于，H6在LB固體培養基和LB 液體培養基中培養，培養條件:溫度30-32，培養時間24-48h，該菌的鑒定特征為:H6為桿狀細菌，G+性，芽孢中生。
3.一種合歡內生菌H6的制備方法，其特征在于包含以下步驟:(1)選取新鮮無病斑的合歡葉，用流水沖凈葉片的表面，然后用無菌水沖洗3-4次，再用75% (體積分數)酒精消毒，消毒時間為2min，再用10%次氯酸鈉溶液再次消毒，消毒時間為3min左右，即可達到合歡葉片表面的徹底消毒；(2)采用組織塊法，無菌條件下，取表面消毒處理后的合歡葉片表面接觸LB培養基 2-3min后取出，作為對照,用解剖刀將消毒后葉片剪成5 mmX5 mm小塊,然后接種在LB平板培養基上，于30°C恒溫培養箱黑暗培養2-3d，根據菌落形態、顏色等挑取單菌落，采用平板劃線分離培養法純化，直至獲得純培養，命名為H6。
4.一種合歡內生菌H6的抑菌用途，其特征在于:內生菌H6菌體本身、發酵液、無菌代謝產物及代謝物中活性組分均具有抑菌作用。
5.根據權利要求4所述的抑菌用途，其特征在于:所屬的菌為蘋果腐爛病菌，葡萄黑痘病菌，西瓜枯萎病菌，小麥赤霉病菌，辣椒炭疽病菌，辣椒炭疽病菌。
6.根據權利要求5所述的抑菌用途，其特征在于:合歡內生細菌H6對蘋果腐爛病、葡萄黑痘病、西瓜枯萎病、小麥赤霉病，辣椒炭疽病，辣椒炭疽病的具有潛在的防治作用。
7.一種合歡內生菌H6抑菌活性組分的分離和檢測方法，其特征在于:在GC-MS中無法檢測，進行各組分的衍生化，方法如下:甲氧胺鹽酸鹽以20mg/mL的含量溶解于吡啶溶液，超聲幫助溶解，吸取100μ I溶劑加入已離心干燥好的樣品管中，封口，超聲15min，渦旋 Imin，幫助溶解，稍微離心，30°C培養2h，加入100 μ L BSTFA至樣品管中，封口，超聲20min 溶解，稍微離心，37°C培養6h，離心15min，轉速12000r/min，吸取160 μ L至GC樣品玻璃管中。GC-MS檢測條件:HP-5MS毛細管柱(30mX0.25mmX0.25 μ m)。進樣口溫度為65°C，進樣體積IyL,流速lmL/min,柱箱程序:初始溫度65?保持2min ;以5? /min升至185? ； 以1°C /min升溫至200°C;再以15°C升溫至280°C，保持5min，氦氣為載氣，恒壓模式，進樣口壓力58.7kPa，離子源和傳輸線溫度分別為230和280°C，電子能量70eV，全掃描掃描范圍 m/z20~650，溶劑延遲時間5.5min，檢測的樣品中，環(PHE-PRO)具有抗菌活性，其保留時0間為19.91min。該化合物的結構式為
【文檔編號】C12R1/07GK103555607SQ201310365784
【公開日】2014年2月5日 申請日期:2013年8月21日 優先權日:2013年8月21日
【發明者】曲田麗, 金玉蘭, 肖 琳, 李秀嵐 申請人:青島農業大學