通過單點突變缺失結構中的鹽鍵提高pae酶活的方法
【專利摘要】本發明提供一種通過單點突變缺失結構中的鹽鍵提高PAE酶活的方法。利用定點突變技術，通過缺失催化腔附近的單個鹽鍵，將形成鹽鍵3的Asp201-Arg205中的Asp201定點突變為Ala，構建突變體D201A，提高了PAE的活力。本發明不但對揭示M4家族金屬蛋白酶的結構和功能關系具有重要意義，同時，由于很多M4家族蛋白酶是重要的醫學、工業用酶，因此本發明對該家族蛋白酶的分子改造研究和相關新產品的開發也具有重要指導意義。
【專利說明】通過單點突變缺失結構中的鹽鍵提高PAE酶活的方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及基因工程方法提高酶活力【技術領域】，特別是涉及通過單點突變缺失結構中的鹽鍵提高PAE酶活的方法。
【背景技術】
[0002]蛋白酶(peptidase, proteases, proteinases 或 proteolytic enzymes)是一類可催化蛋白質或肽類肽鍵水解的酶類。
[0003]彈性蛋白(e last in )在動物組織中廣泛存在，如富有彈性的組織、肺、大動脈、某些韌帶、皮膚及耳部軟骨等。彈性蛋白由多條彈性蛋白原(tropoelastin)多肽鏈以共價交聯方式連接而成(Yeo et al.，2011)，具 有非常穩定的結構，而且不含常見蛋白酶識別的氨基酸和酶切位點，使得弾性蛋白只能被弾性蛋白酶分解。能夠水解弾性蛋白的蛋白酶稱為彈性蛋白酶(elastase )。
[0004]按照來源分，弾性蛋白酶可分為微生物弾性蛋白酶和動物弾性蛋白酶。其中，哺乳動物彈性蛋白酶主要存在于動物的胰腺和吞卩遼細胞中(Horwitz et al.，1999; Masonet al., 1986; Bode et al., 1989; Antonicelli et al., 2007)。研究比較多的細菌來源的彈性蛋白酶有金屬蛋白酶M4家族的PAE/pseudolysin (Morihara and Homma, 1985)和 vibriolysin (Lutfullah et al., 2008)、M9 家族的 MAPI peptidase (Dumont et al.,1994)、M12 家族的 myroilysin (Chen et al., 2009a)、M23 家族的 staphylolysin(Kesslerand Ohman, 2004b)和絲氨酸蛋白酶 S8 家族的 Alpl (Behnsen et al., 2010)等。
[0005]弾性蛋白酶在醫學、食品學和日用化學上有著廣泛應用。在醫藥方面主要作為治療藥物:(1)治療高脂血癥，(2)防治動脈粥樣硬化，(3)抑制脂肪肝發展，(4)治療慢性氣管炎及其它結締組織纖維增生性疾病，(5)外用于消除皮膚焦痂、碎屑，用于燒傷患者的治療以及皮膚潰瘍、口腔潰瘍等癥。在食品エ業方面常用于對動物難以處理和食用的韌帶、大動脈血管、筋腱等蛋白質廢料進行加工。日用化學エ業方面，弾性蛋白酶主要用于療效化妝品的生產。
[0006]PAE (Pseudomonas aeruginosa Elastase, pseudolysin)是革蘭氏陰性機會致病菌銅綠假單孢菌(Pseudomonas aeruginosa, PA)分泌的一種胞外彈性蛋白酶，可以降解酪蛋白、血紅蛋白、卵清蛋白、纖維蛋白等。在底物特異性方面，PAE傾向降解Ρ-位為疏水或芳香族氨基酸的肽鍵(Morihara 1995; Morihara et al., 1965)。目前，已經商品化的PA來源的PAE售價昂貴，EPC公司(Elastin Products Company Inc.)姆0.1 mg PAE 售價 183 美兀(PE961, https://www.elastin.com/storefront/tabid/58/c/Metalloproteinases/CategoryID/19/Default, aspx), Merck 公司姆 0.lmg PAE 售價 4δ00兀人民幣(324676-100UG, http://www.millipore.com/catalogue/item/324676-100ug)。PAE能夠在原核細胞和真核細胞中異源表達并且重組酶有酶活(0gino，H.et al.，2000;Lin et al., 2009)。我們前期研究表明將構建好的含hi基因的表達載體轉化至萬.BL21 (DE3)中，1 L培養物細胞經超聲破碎和柱層析純化后，可獲得純酶4.5 mg,總酶活285984個酶活単位(酶活力定義為60 --C，每分鐘催化酪蛋白水解生成1 yg酪氨酸的酶量為 1 個單位 U) (Xie et al., 2009)。
[0007]作為PA分泌的主要胞外內切蛋白酶以及它本身的降解宿主蛋白的能力，PAE可以用作模式蛋白來生產特殊的蛋白酶抑制劑，用于疾病治療(Jan Potempa and Robert N.Pike, 2009 ；Maciej Sataga et al.，2013)。PAE具有在有機溶劑中仍能保持高活性和熱穩定性的特性使得其在エ業催化方面具有巨大的應用潛力。Ogino通過構建Cys30-Cys58、Cys270-Cys297 ニ硫鍵缺失的PAE突變體證實了 Cys30_Cys58 ニ硫鍵對維持PAE在有機溶劑中的熱穩定性有重要意義(Ogino H.et al.，2001), Lousa, D.利用分子動力學模擬驗證了上述結論(Lousa，D.et al.，2012)。將PAE的114位Tyr突變為Phe使得突變體在有機溶劑環境中催化合成阿巴斯甜前體時具有與thermolysin相同的活力，而將Tyr突變為Ser和Arg后這種活力提高得更明顯(Ogino et al.，2010)。利用定點突變技術研究PAE的活性和穩定性的研究主要集中在上述文獻中。
[0008]Thermolysin與PAE同為金屬蛋白酶M4家族的蛋白酶，兩者不僅序列相似性很高，而且具有幾乎完全一致的三維結構(Holmes and Matthews, 1982; Thayer et al., 1991):N端結構域主要由反向片層構成，C端結構域由α -螺旋組成，兩個結構域之間有ー個催化腔，結合Ζη的殘基與結合底物的殘基都位于催化腔內壁上(圖1)。利用定點突變技術對thermolysin的活性和熱穩定性 進行研究的例子非常多。例如，thermolysin N端結構域G8C/N60C/S65C三個位點的同時突變使得突變體中結合Ca的殘基與Ca的親和カ增強而導致突變體的熱穩定性增強(Kawasaki Y.et al., 2013; Yasukawa K.and Inouye K.,2007)。Thermolysin N端結構域中連接2個反向β -片層的Asnll6_Glyll7轉角中的Asn殘基對穩定thermolysin的β發卡結構至關重要,Asn突變為Asp后導致thermolysin突變體活性提高同時熱穩定性降低(Menach E.et al.，2012)。在前期研究單點突變(L144S，D150E, I168A)提高 thermolysin 的活性和單點突變(S53D, L155A)提高 thermolysin 穩定性的基礎上，Kusano Μ (2010)研究了雙突和三突產生的突變體的活性和穩定性的變化，發現L144S/D150E突變體活性最高，S53D/L155A突變體熱穩定性最好，L144S/D150E/ S53D突變體的活性和熱穩定性都提高了，這些多突變體的效果是單突的疊加(Kusano M.et al.，2010)。通過對thermolysin活性中心附近的幾個結構域,包括N端β片層、2個α -螺旋和C端2個loop上氨基酸殘基的單點突變，Kusano Μ.等掲示了 Ν端β片層和2個α-螺旋對thermolysin的催化至關重要,而C端2個loop負責了酶對底物的識別(Kusano M.etal., 2009)。通過將thermolysin中的Ser殘基突變為Asp來向thermolysin引入負電荷，研究發現在高鹽條件下大多數突變體的催化效率kcat/km提高了，在10 mM CaCl2條件下兩個突變體S53D和S6?的熱穩定性也有所提高(Takita T.et al.，2008)。將thermolysin的一個自溶位點Glyl54-Leul55中的Leul55分別突變為Ala/Ser/Phe/Gly后，各突變體的熱穩定性都有所提高，但同時產生了新的自溶位點(Matsumiya Y.et al., 2004)。
[0009]前期生化實驗、分子動力學模擬和計算分析表明，鹽鍵的差異很可能是PAE與同源酶之間熱穩定性差異的主要原因(Xie et al., 2009)。但結合文獻發現，目前對PAE的活性和熱穩定性的研究很少，對M4家族中研究更深入的模式蛋白酶thermolysin的活性和熱穩定性的研究也并未把鹽鍵的作用深入分析。
【發明內容】

[0010]針對上述PAE的研究現狀，本發明提供了通過單點突變缺失結構中的鹽鍵提高PAE酶活的方法。利用定點突變技術，通過缺失催化腔附近的單個鹽鍵，本發明提高了 PAE的活力，對形成鹽鍵3(Asp201 — Arg205)的Asp201定點突變為Ala，構建突變體D201A，在E.coli中異源表達并測得D201A仍具有蛋白酶活力。將D201A利用DEAE-S印harose FastFlow離子交換層析分離純化，獲得了電泳純的重組酶。Folin-酚法測定D201A和PAE水解酪蛋白的酶活，在45-75--C實驗溫度條件下，D201A的比活力均比PAE高7.1-32.3%不等；在最適酶活溫度65--C時D201A的比活力比PAE提高了 14%。本發明不但對掲示M4家族金屬蛋白酶的結構和功能關系具有重要意義，同吋，由于很多M4家族蛋白酶是重要的醫學、エ業用酶，因此本發明對該家族蛋白酶的分子改造研究和相關新產品的開發也具有重要指導意義。
[0011]本發明的通過單點突變缺失結構中的鹽鍵提高PAE酶活的方法技術方案為，通過缺失催化腔附近的單個鹽鍵，提高PAE的比活力。
[0012]如說明書附圖圖1所示，PAE中含有6個鹽鍵(殘基正負電荷間距離小于4 --，不考慮His形成的鹽鍵)。將PAE與同源蛋白進行序列比對分析表明，鹽鍵1、2和6是保守存在的，說明這些鹽鍵對維持PAE的活性起重要作用。PAE中的6個鹽鍵分屬兩個區域，鹽鍵1-3位于催化腔附近，鹽鍵4-6位于C端結構域的C末端。催化腔附近的3個鹽鍵都位于穩定性很差的loop區或相鄰區域。
[0013]形成鹽鍵1-3的氨基酸在PAE—維序列中的位置(鹽鍵1:D168_R198 ;鹽鍵2:R179-D189 ;鹽鍵 3:D201-R205)如下:
【權利要求】
1.一種通過單點突變缺失結構中的鹽鍵提高PAE酶活的方法，其特征在于，PAE中殘基正負電荷間距離小于4 --，不考慮His形成的鹽鍵之外含有6個鹽鍵，鹽鍵1-3位于催化腔附近，鹽鍵4-6位于C端結構域的C末端，將形成鹽鍵3的Asp201-Arg205中的Asp201進行定點突變，提高PAE比活力。
2.根據權利要求1所述的通過單點突變缺失結構中的鹽鍵提高PAE酶活的方法，其特征在于，將形成鹽鍵3的Asp201-Arg205中的Asp201定點突變為Ala，構建突變體D201A。
3.根據權利要求2所述的通過單點突變缺失結構中的鹽鍵提高PAE酶活的方法，其特征在于，突變體D201A的引物: 兩端引物: 正向引物:GCTTGGACCATATGAAGAAGGTTTCTACGCTTGACC，劃橫線部分表示Nde I酶切位點； 反向引物:CGCGCTCGAGTTACAACGCGCTCGGGCAG,劃檑線部分表示Xho I酶切位點； D201A中間引物: 3 ’ 端引物:GCGCTGCGCTACATGGCGCAGCCCAGCCGCGAC
5 ’ 端引物:GCGGCTGGGCTGCGCCATGTAGCGCAGCGCACCG。
4.根據權利要求3所述的通過單點突變缺失結構中的鹽鍵提高PAE酶活的方法，其特征在于，突變體的原核表達為: ①以含NdeI酶切位點的正向引物和突變體中間引物的3’引物為兩端引物，以ム質粒為模板，擴增產物標為I ;以含Xho I酶切位點的反向引物和突變體中間引物的5’引物為兩端引物，以leisB質粒為模板，擴增產物標為II ； ②回收I和II，通過PCR反應程序，將I基因和II基因相互融合； ③最后再加入兩側正、反向引物通過PCR反應程序，得到突變體基因。
5.根據權利要求4所述的通過單點突變缺失結構中的鹽鍵提高PAE酶活的方法，其特征在于，有酶活突變體的篩選: ①利用瓊脂糖凝膠電泳分離PCR產物，EB染色，切取目的片段大小的DNA，回收DNA; ②DNA用限制性內切酶NdeI和Xho I酶切，連接同樣酶切過的pET_22b表達載體； ③連接產物轉化萬.coliDH5a ； ④從轉化平板上挑取轉化子至液體LB培養基中培養，利用提質粒酶切驗證的方法篩選攜帶目的基因的轉化子； ⑤將測序正確的含目的基因的質粒轉化^:coli BL21 (DE3)； ⑥從平板上挑取轉化子單菌落到試管中，37--C過夜培養后按1%接種量轉接到三角瓶中，37--C培養至0D_ =1.0左右加入終濃度1 mM的IPTG繼續培養過夜； ⑦發酵液離心收集菌體，菌體用三蒸水洗滌3遍以上后用50mM, pH 8.0的Tris_HCl緩沖液重懸，超聲破碎至菌液澄清，超聲完畢后離心，上清在30--C保溫2 h ； ⑧用Folin—酚法測粗酶液酶活。
6.根據權利要求5所述的通過單點突變缺失結構中的鹽鍵提高PAE酶活的方法，其特征在于，步驟⑦發酵液離心收集菌體，超聲破碎條件為:功率300 w，超聲5 s，間隔10 s，超聲10次。
7.根據權利要求6所述的通過單點突變缺失結構中的鹽鍵提高PAE酶活的方法，其特征在于，重組酶分離純化: ①按1%接種量擴大培養含各突變體質粒的E.coli BL21 (DE3)，當菌濃0D6(I(I=1.0吋，添加終濃度 1 mM IPTG，在 37--C，160-180 rpm 誘導 12 h ； ②發酵液離心收集菌體，用50mM, pH 8.0的Tris_HCl緩沖液重溶菌體，超聲破碎；超聲完畢后離心，上清在30--C保溫2 h后用60%硫酸氨沉淀過夜； ③沉淀的蛋白用Tris-HCl緩沖液重溶、透析,進行DEAE-SepharoseFast Flow離子交換層析分離； ④測各收集管中樣品的酶活，酶活高的組分進行SDS-PAGE分析，收集電泳純的酶組分混合，裝在透析袋里用pH 8.0，50 mM的Tris-HCl緩沖液透析后分裝。
8.根據權利要求7所述的通過單點突變缺失結構中的鹽鍵提高PAE酶活的方法，其特征在于，步驟②發酵液離心收集菌體，超聲破碎條件為:功率300 w，超聲5 s，間隔10 s，每100 ml菌體超聲30次。
9.根據權利要求7所述的通過單點突變缺失結構中的鹽鍵提高PAE酶活的方法，其特征在于，步驟③DEAE-Sepharose Fast Flow離子交換層析柱層析分離前,先用50 mM, pH9.5的Tris-HCl緩沖液平衡；洗脫時仍采用相同的緩沖系統，梯度洗脫時NaCl濃度范圍為 0-0.5 M。
【文檔編號】C12N9/66GK103451173SQ201310368569
【公開日】2013年12月18日 申請日期:2013年8月21日 優先權日:2013年8月21日
【發明者】邊斐, 畢玉平, 彭振英, 楊連群, 于金慧, 宣寧, 張燕 申請人:山東省農業科學院生物技術研究中心