一種檢測egfr基因外顯子21l858r點突變的試劑盒和方法
【專利摘要】本發明涉及分子生物學領域，具體為一種檢測人表皮生長因子受體基因EGFR外顯子21上L858R點突變的方法及試劑盒；以數字PCR為平臺，在反應體系中加入PCR引物和TaqMan探針，利用兩條標記不同類型熒光的TaqMan探針對野生和突變DNA模板進行檢測；根據熒光類型判斷樣品中DNA模板的類型及其數量及比例。
【專利說明】—種檢測EGFR基因外顯子21L858R點突變的試劑盒和方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及生物學領域和核酸檢測領域，具體為檢測表皮生長因子受體EGFR基因外顯子21上L858R點突變的方法及其試劑盒。
【背景技術】
[0002]隨著個體化醫療觀念的不斷深入，檢測特定基因突變可以給醫生的個體化診療提供靶向用藥的參考。受體酪氨酸激酶抑制劑(TKI)是近年來肺部腫瘤治療的熱點靶向藥物，與傳統放化療藥物相比，可明顯延長腫瘤患者生存期，改善生存質量。[0003]表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor, EGFR)酪氨酸激酶區域發生突變，可使酪氨酸激酶抑制劑治療晚期非小細胞肺癌的有效率達到80%以上。由于EGFR基因突變是一種體細胞遺傳突變，迄今為止的資料證明此類突變僅發生在癌細胞中，正常組織細胞均屬于無突變的野生型。
[0004]EGFR蛋白酪氨酸激酶功能區由EGFR基因外顯子18_24編碼，其中外顯子18_20編碼N-Lobe，外顯子21~24編碼C_Lobe。迄今為止發現的EGFR突變主要位于外顯子19至21 ;非小細胞肺癌EGFR突變90%以上發生為exonl9的缺失突變及exon21的L858R點突變。
[0005]人表皮生長因子受體(EGFR)基因外顯子21L858R發生突變的非小細胞肺癌患者，對該類藥物敏感，即受體酪氨酸激酶抑制劑藥物對這些患者有療效。外顯子21上的L858R點突變通常是替代突變，2573位的T由G取代，導致EGFR第858位框架氨基酸由亮氨酸變為精氨酸(CTG — CGG)。因此EGFR外顯子21L858R點突變的檢測，可以為篩選靶向治療患者提供參考；同時可用于癌癥患者，特別是肺癌患者的高靈敏度早期復發監測，以及用藥期間耐藥性突變監測。
[0006]目前基因變異的檢測技術主要有直接測序法(亦稱Sanger測序法)和ARMS法。現分別簡介于下:
[0007]Sanger測序法，即Sanger(桑格)雙脫氧鏈終止法是Frederick Sanger于1975年發明的。測序過程需要先做一個聚合酶鏈式反應(PCR)。PCR過程中，雙脫氧核糖核苷酸可能隨機的被加入到正在合成中的DNA片段里。由于雙脫氧核糖核苷酸多脫了一個氧原子，一旦它被加入到DNA鏈上，這個DNA鏈就不能繼續增加長度。最終的結果是獲得所有可能獲得的、不同長度的DNA片段。目前最普遍最先進的方法，是將雙脫氧核糖核苷酸進行不同熒光標記。將PCR反應獲得的總DNA通過毛細管電泳分離，跑到最末端的DNA就可以在激光的作用下發出熒光。由于ddATP，ddGTP, ddCTP, ddTTP (4種雙脫氧核糖核苷酸)熒光標記不同，計算機可以自動根據顏色判斷該位置上堿基究竟是A，T，G，C中的哪一個。直接測序法耗時長(一般需2 — 3天)且靈敏度低，僅能檢出突變比例在10%~20%以上的突變。
[0008]ARMS 法也稱擴增阻礙突變系統(Amplification Refractory Mutation System,ARMS)、等位基因特性PCR (Allele Specific PCR，ASPCR)等，即等位基因特異性擴增法(Allele Specific Amplif ication, ASA)建立于 1989 年,是 PCR 技術應用的發展。[0009]ARMS法主要用于對已知突變基因進行檢測。利用PCR引物的3’端末位堿基必須與其模板DNA互補才能有效擴增的原理，首先設計兩個5’端引物，一個與正常DNA互補，一個與突變DNA互補。對于純合性突變，分別加入這兩種引物及下游3’端引物進行兩個平行PCR，只有與突變DNA完互補的引物才可延伸并得到PCR擴增產物。如果錯配位于上游5’端引物的3’端，則引物與模板DNA不配對，導致PCR不能延伸，因此這種方法稱為ARMS，可選擇性地擴增突變型DNA模板。
[0010]上述現有技術存在以下問題:
[0011]1.均為定性檢測，也就是說只能給出基因變異是否存在的結論。但無法測定攜帶基因變異的DNA量的比例，也就是說難以進行定量檢測。
[0012]2.均給出模擬圖結果，需要人工進行判讀，判讀方面相對比較主觀。無法直接得到數字化的客觀結果。
[0013]3.靈敏度比較差，目前方法的靈敏最好為1%，無法滿足某些特定的臨床檢測需求。
[0014]目前的檢測一般需要通過有創性組織活檢，且不易重復獲取。研究表明，在血液、胸腔積液、唾液、糞便等樣本中，會有少量混雜于大量野生型基因組DNA中的突變腫瘤細胞DNA。從這些低含量樣本中檢測突變的基因，需要找一種靈敏性高、特異性強、簡便易行、結果判定簡單的突變檢測方法，用于癌癥患者，特別是肺癌患者的靶向用藥指導、高靈敏度早期復發監測，以及用藥期間耐藥性突變監測等。

【發明內容】

[0015]本發明的目的在于提供一種檢測EGFR基因外顯子21L858R點突變的PCR擴增引物、TaqMan探針及試劑盒和檢測方法。
[0016]數字PCR是一種核酸分子絕對定量方法，基于單分子PCR方法來進行計數，主要采用當前分析化學熱門研究領域的微流控或微滴化方法，將大量稀釋后的核酸溶液分散至芯片的微反應器或微滴中，每個反應器的核酸模板數少于或者等于I個。這樣經過PCR循環之后，有一個核酸分子模板的反應器就會給出熒光信號，沒有模板的反應器就沒有熒光信號。根據相對比例和反應器的體積，就可以推算出原始溶液的核酸濃度。
[0017]本發明以數字PCR為平臺，在反應體系中加入PCR引物和TaqMan探針，利用兩條不同的TaqMan探針(標記不同類型熒光)對野生和突變DNA模板進行檢測；根據熒光類型判斷樣品中DNA模板的類型。
[0018]本發明技術方案如下。
[0019]一種檢測EGFR基因外顯子21L858R點突變的PCR引物，為反向引物和正向引物；正向引物含有以下核苷酸序列(SEQ ID N0.1~5)中的一種:
[0020]F1:5，-AAAACACCGCAGCATGTCAA-3，，
[0021] F2:5，-AACACCGCAGCATGTCAAGA-3，，
[0022]F3:5，-CACCGCAGCATGTCAAGATC-3，，
[0023]F4:5 ’ -CCGCAGCATGTCAAGATCAC-3，，
[0024]F5:5，-GCAGCATGTCAAGATCACAG-3，；
[0025]反向引物含有以下核苷酸序列(SEQ ID N0.6~10)中的一種:[0026]Rl:5，-CTTCTGCATGGTATTCTTTCTCTTC-3，，
[0027]R2:5 ’ -TCCTTCTGCATGGTATTCTTTCTCT-3，，
[0028]R3:5，-CCTCCTTCTGCATGGTATTCTTTCT-3，，
[0029]R4:5 ’ -TGCCTCCTTCTGCATGGTATTCTTT-3，，
[0030]R5:5 ’ -TTTGCCTCCTTCTGCATGGTATTCT-3，。
[0031]優選的，正向引物為SEQ ID N0.1~5之一的核苷酸序列；反向引物為SEQ IDN0.6~10之一的核苷酸序列；
[0032]更優選的，PCR引物選自以下各組序列之一: [0033](I)正向 F1:5，-AAAACACCGCAGCATGTCAA-3 ’，
[0034]反向Rl: 5 ’ -CTTCTGCATGGTATTCTTTCTCTTC-3，，或者，
[0035](2 )正向 F2:5，-AACACCGCAGCATGTCAAGA-3 ’，
[0036]反向R2:5，-TCCTTCTGCATGGTATTCTTTCTCT-3，，或者，
[0037](3 )正向 F3:5，-CACCGCAGCATGTCAAGATC-3 ’，
[0038]反向R3:5，-CCTCCTTCTGCATGGTATTCTTTCT-3，，或者，
[0039](4 )正向 F4:5，-CCGCAGCATGTCAAGATCAC-3，，
[0040]反向R4:5，-TGCCTCCTTCTGCATGGTATTCTTT-3，，或者，
[0041 ](5 )正向 F5:5，-GCAGCATGTCAAGATCACAG-3 ’，
[0042]反向R5:5，-TTTGCCTCCTTCTGCATGGTATTCT-3，。
[0043]一種EGFR基因外顯子21L858R點突變的TaqMan探針，包括與突變型DNA模板結合的TaqMan探針(PM)，或者包括與突變型DNA模板結合的TaqMan探針(PM)以及與野生型DNA模板結合的TaqMan探針(PW);兩者均為為連接熒光基團和猝滅基團的核苷酸，且所含的熒光基團的種類不同。
[0044]與突變型DNA模板結合的TaqMan探針的核苷酸部分含有以下核苷酸序列(SEQ IDN0.11~15)中的一種:
[0045]PMl:5，-TTGGCCCGCCCAA-3’，
[0046]PM2:5，-TTTGGCCCGCCCA-3，，
[0047]PM3:5，-GTTTGGCCCGCCC-3，，
[0048]PM4:5，-AGTTTGGCCCGCC-3，，
[0049]PM5:5，-TGGCCCGCCCAAA-3’ ；
[0050]優選的，所述與突變型DNA模板結合的TaqMan探針核苷酸部分選自SEQ IDN0.11~15中的一種。
[0051]所述與野生型DNA模板結合的TaqMan探針核苷酸部分含有以下核苷酸序列(SEQID N0.16~20)中的一種:
[0052]PWl:5，-TTGGCCAGCCCAA-3’，
[0053]PW2:5，-TTGGGCTGGCCAA-3，，
[0054]PW3:5，-TTTGGGCTGGCCAAA-3，，
[0055]PW4:5，-TGGGCTGGCCAAA-3，，
[0056]PW5:5，-GGGCTGGCCAAACTG-3 ’。
[0057]優選的，所述與野生型DNA模板結合的TaqMan探針核苷酸部分選自SEQ IDN0.16~20中的一種。
[0058]TaqMan探針上的熒光基團選自FAM (6_羧基熒光素)、HEX (六氯_6_羧基熒光素)、Cy5 (美國 Life Technologies)、Cy3 (美國 Life Technologies)、VIC (美國 LifeTechnologies)，熒光猝滅基團選自TAMARA (6-羧基四甲基若丹明)、BHQl (美國LifeTechnologies)、BHQ2 (美國 Life Technologies)或 MGB (美國 Life Technologies)。
[0059]上述的TaqMan探針和PCR引物可以用于制備試劑盒，基于數字PCR平臺用來檢測EGFR外顯子21上L858R點突變，為靶向治療篩選患者提供參考，也可用于癌癥患者，特別是肺癌患者的高靈敏度早期復發監測，以及用藥期間耐藥性突變監測。
[0060]一種檢測EGFR基因外顯子21L858R點突變的試劑盒，含有以下物質中的至少一種:
[0061](I)前述的PCR引物;
[0062](2 )前述的 TaqMan 探針。
[0063]上述引物和探針是針對EGFR外顯子21上L58R點突變設計優化的，這種試劑盒可基于數字PCR平臺來檢測EGFR外顯子21上L858R點突變。
[0064]本發明檢測EGFR外顯子21上L858R點突變的方法，步驟包括:
[0065]1.將待測樣品DNA模板、PCR引物、TaqMan探針以及PCR預混液混合，制備得到數字PCR混合液；其中，所含的DNA模板、PCR引物及TaqMan探針的含量如下:
[0066]a.DNA 模板,含量為 0.25 ~Ing/ μ L,優選為 0.5ng/ μ L ；
[0067]b.PCR引物，包括正向弓丨物和反向引物，含量分別為500~700nM，優選為600nM ；
[0068]c.TaqMan探針，包括與突變型DNA模板結合的TaqMan探針，含量為200~400nM，優選為300nM ;或者，包括與突變型DNA模板結合的TaqMan探針以及與野生型DNA模板結合的TaqMan探針，含量分別為200~400nM，優選為300nM。
[0069]其中PCR引物包括正向引物和反向引物，正向引物含有以下核苷酸序列(SEQ IDN0.1 ~5)之一:
[0070]Fl: 5，-AAAACACCGCAGCATGTCAA-3，，
[0071 ] F2:5，-AACACCGCAGCATGTCAAGA-3，，
[0072]F3:5，-CACCGCAGCATGTCAAGATC-3，，
[0073]F4:5，-CCGCAGCATGTCAAGATCAC-3，，
[0074]F5:5，-GCAGCATGTCAAGATCACAG-3，。
[0075]反向PCR引物含有以下核苷酸序列(SEQ ID N0.5~10)之一:
[0076]Rl:5 ’ -CTTCTGCATGGTATTCTTTCTCTTC-3，，
[0077]R2:5 ’ -TCCTTCTGCATGGTATTCTTTCTCT-3，，
[0078]R3:5，-CCTCCTTCTGCATGGTATTCTTTCT-3，，
[0079]R4:5 ’ -TGCCTCCTTCTGCATGGTATTCTTT-3，，
[0080]R5:5 ’ -TTTGCCTCCTTCTGCATGGTATTCT-3，。
[0081]優選的，正向引物選自SEQ ID N0.1~5之一的核苷酸序列，反向引物選自SEQ IDN0.5~10之一的核苷酸序列；
[0082]更優選的，PCR引物選自以下各組序列之一:
[0083](I)正向 F1:5，-AAAACACCGCAGCATGTCAA-3 ’，[0084]反向Rl: 5 ’ -CTTCTGCATGGTATTCTTTCTCTTC-3 ’，或者，
[0085](2 )正向 F2:5，-AACACCGCAGCATGTCAAGA-3 ’，
[0086]反向R2:5，-TCCTTCTGCATGGTATTCTTTCTCT-3，，或者，
[0087](3 )正向 F3:5，-CACCGCAGCATGTCAAGATC-3 ’，
[0088]反向R3:5，-CCTCCTTCTGCATGGTATTCTTTCT-3，，或者，
[0089](4 )正向 F4:5，-CCGCAGCATGTCAAGATCAC-3，，
[0090]反向R4:5 ’ -TGCCTCCTTCTGCATGGTATTCTTT-3，，或者，
[0091](5 )正向 F5:5，-GCAGCATGTCAAGATCACAG-3 ’，
[0092]反向R5:5，-TTTGCCTCCTTCTGCATGGTATTCT-3，。
[0093]Taqman探針包括與突變型DNA模板結合的TaqMan探針(PM)，或者包括與突變型DNA模板結合的TaqMan探針(PM)以及與野生型DNA模板結合的TaqMan探針(PW);兩者均為連接熒光基團和猝滅基團的核苷酸，而且所含熒光基團的類型不同。
[0094]與突變型DNA模板結合的Taqman探針核苷酸部分含有以下核苷酸序列(SEQ IDN0.11 ~15)之一:
[0095]PMl:5，-TTGGCCCGCCCAA-3’，
[0096]PM2:5，-TTTGGCCCGCCCA-3，，
[0097]PM3:5，-GTTTGGCCCGCCC-3，，
[0098]PM4:5，-AGTTTGGCCCGCC-3，，
[0099]PM5:5，-TGGCCCGCCCAAA-3’。
[0100]其中與野生型DNA模板結合的Taqman探針的核苷酸部分含有以下核苷酸序列(SEQ ID N0.16 ~20)之一:
[0101]PWl: 5，-TTGGCCAGCCCAA-3 ’，
[0102]PW2:5 ’ -TTGGGCTGGCCAA-3，，
[0103]PW3:5，-TTTGGGCTGGCCAAA-3，，
[0104]PW4:5，-TGGGCTGGCCAAA-3，，
[0105]PW5:5，-GGGCTGGCCAAACTG-3 ’。
[0106]TaqMan探針上的熒光基團選自FAM (6_羧基熒光素)、HEX (六氯_6_羧基熒光素)、Cy5 (美國 Life Technologies)、Cy3 (美國 Life Technologies)、VIC (美國 LifeTechnologies)，熒光猝滅基團選自TAMARA (6-羧基四甲基若丹明)、BHQl (美國LifeTechnologies)、BHQ2 (美國 Life Technologies)或 MGB (美國 Life Technologies)。
[0107]優選的，與突變型DNA模板結合的TaqMan探針核苷酸部分選自SEQ ID N0.11~15中的一種，與野生型DNA模板結合的TaqMan探針核苷酸部分選自SEQ ID N0.16~20中的一種。
[0108]2.數字PCR混合液制作PCR微反應液滴，再進行PCR擴增反應，條件為:93~97°C預變性3~15分鐘；93~97°C變性5~50秒，65~75°C退火5~50秒，55~65°C延伸10~65秒，共進行20~60個循環，2~10°C終止反應；
[0109]優選的PCR擴增條件為，93.5~95°C預變性3~6分鐘；93.5~95°C變性8~15秒，64.5~66°C 退火8~15秒，55~57°C延伸40~50秒，共進行30~35個循環，6~10°C終止反應。[0110]更優選的PCR擴增條件為，94°C預變性5分鐘；94°C變性10秒，65°C退火10秒，56°C延伸45秒，共進行32個循環，10°C終止反應。
[0111]優選的，數字PCR混合液制作PCR微反應液滴的方法為，將數字PCR混合液加入微滴發生器，生成10000~20000個微反應液滴。
[0112]3.PCR擴增反應后的產物進行信號收集，根據熒光類型判斷待測樣品中是否含有EGFR基因外顯子21L858R點突變的DNA模板，還可確定其中EGFR基因外顯子21L858R點突變的DNA模板的數量和含量。
[0113]可用QuantaSoft (Biorad)軟件進行數據分析,計算樣品中發生突變的拷貝數和含量，確定突變DNA樣本的比例。
[0114]通過上述方法，可以檢測位于c.2573的EGFR外顯子21上L858R點突變。
[0115]與現有技術比較，本發明的優點在于:
[0116]1.結果判讀方式:以前的技術方法結果的判讀需要人工參與，肉眼依據相關圖形作出最后的判斷，這種判讀的方式嚴重依賴經驗，速度慢且很容易產生假陽性和假陰性的判讀結果。我們的技術方式給出的是數據信息，可以借助軟件完全自動化的進行結果判讀，從而加快了數據分析的速度，也減少了產生假陰性和假陽性判讀的可能。
[0117]2.結果描述的方式:以前的技術方式對基因變異的描述是定性的方式，也就是說，只是描述某個特異的基因變異是否存在于檢測樣本。本技術方法對基因變異的描述是絕對定量的方式，可以給出樣本所攜帶某種特異基因變異DNA的絕對數量和比例。而且準確率高，即使在突變樣本含量極低的情況下，定量分析的誤差也很小。
[0118]3.檢測靈敏度(數值越小靈敏度越好):以前技術方法的靈敏度一般在1%— 50%之間，而我們提出的技術方法對基因變異的檢測靈敏度提升非常明顯，能達到1/2500。可以在非常高背景的野生DNA中檢測出極其微量的攜帶基因變異的DNA。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0119]圖1為實施例1中，不同含量突變樣本的熒光檢測結果。
【具體實施方式】
[0120]以下實施例是對本發明的更詳細說明，而不是對本發明范圍的限定。
[0121]所用基因序列的來源為NCBI (美國國立生物技術信息中心):
[0122](I)準備樣品:含有野生型EGFR基因的DNA、EGFR外顯子21上L858R點突變的突變陽性DNA與野生型DNA混合樣本(其中突變DNA的與野生型DNA的含量比分別為1/1、1/100、1/1000、1/2500)。DNA來源可以是血清、血漿、外周血、口腔黏膜、胸腔積液、體液或者組織等。其中，突變DNA模板來源于攜帶EGFR外顯子21上L858R點替換突變的細胞系(經PCR測序鑒定)，其中突變的位點在EGFR外顯子21上c.2573位(T變為G)。
[0123](2)室溫融解PCR引物及對應TaqMan探針。
[0124]正向和反向PCR引物的序列為:
[0125]Fl: 5，-AAAACACCGCAGCATGTCAA-3，
[0126]Rl:5 ’ -CTTCTGCATGGTATTCTTTCTCTTC-3，
[0127]TaqMan探針的序列為:[0128]與野生型DNA結合的TaqMan探針PWl上連接的熒光基團和猝滅基團為VIC和MGB，其核苷酸部分序列為:5’ -TTGGCCAGCCCAA-3’。
[0129]與突變型DNA結合的TaqMan探針PMl上連接的熒光基團和猝滅基團為FAM和MGB，其核苷酸部分序列為:PM15’ -TTGGCCCGCCCAA-3’。
[0130](3)按照以下配比制備PCR反應液:2X數字PCR預混液(Biorad，#186-3022)與正向及反向PCR引物、與野生型DNA模板結合的TaqMan探針、與突變型DNA模板結合的TaqMan探針及與待檢測DNA (IOng)混合，用蒸餾水補足至終體積為20 μ L，配制成數字PCR混合液。其中正向及反向PCR引物含量分別為600ηΜ，與野生型DNA模板結合的TaqMan探針以及與突變型DNA模板結合的TaqMan探針分別為300ηΜ。
[0131](4)配制好的20 μ L數字PCR混合液加入到8_道的液滴制作板內，然后加入60 μ L液滴制作油到制作板用于制備PCR微反應液滴(QX200微滴發生器)。
[0132](5)將制備好的PCR微反應液滴轉移至96孔反應板，并用封板膜進行熱封，生成的微反應液滴數量為10000~20000個。
[0133](6)將96孔PCR板放入PCR儀按照下面條件進行擴增反應: [0134]94°C預變性5分鐘；94°C變性10秒，65°C退火10秒，56°C延伸45秒，共進行32個循環，10°C終止反應。
[0135](7)PCR擴增反應后將PCR反應板放置于PCR微反應液滴信號讀取儀(QX200微滴熒光信號收集系統)中進行信號收集，檢測FAM和VIC的熒光信號。用QuantaSoft(Biorad)軟件進行數據分析結果如圖1。可進行定量分析，得出樣本中突變DNA的絕對含量以及相對總DNA的比例。
[0136]突變體與野生型的含量不同的樣品檢測結果中，突變陽性信號數(FAM)與總信號數(FAM和VIC)如下:
[0137]1/1 樣品:5570/11274，計算值突變 / 野生=0.976/1，誤差 2.4%
[0138]1/100 樣品 87/9012，計算值突變 / 野生=0.00975/1，誤差 2.5%
[0139]1/1000 樣品:22/19782，計算值突變/野生=0.0011/1，誤差 10%
[0140]1/2500 樣品:5/12582，計算值突變 / 野生=0.000397/1，誤差 0.1%。
[0141]以上述方法，可以檢測位于c.2573的EGFR外顯子21上L858R點突變，檢出限達到1/2500。定量分析的結果顯示，誤差一般在0.1%~3%，不超過10%。
[0142]使用以下各組之一的PCR引物時，按照上述步驟檢測，結果相同，在突變樣本含量1/2500的情況下也能檢出，而且突變型DNA模板與野生型DNA模板比例為1/1~1/100時，定量檢測誤差一般低于5%:
[0143](I)正向 F2:5，-AACACCGCAGCATGTCAAGA-3 ’，
[0144]反向R2:5 ’ -TCCTTCTGCATGGTATTCTTTCTCT-3，，或者，
[0145](2 )正向 F3:5，-CACCGCAGCATGTCAAGATC-3，，
[0146]反向R3:5，-CCTCCTTCTGCATGGTATTCTTTCT-3，，或者，
[0147](3 )正向 F4:5 ’ -CCGCAGCATGTCAAGATCAC-3，，
[0148]反向R4:5 ’ -TGCCTCCTTCTGCATGGTATTCTTT-3，，或者，
[0149](4 )正向 F5:5，-GCAGCATGTCAAGATCACAG-3，，
[0150]反向R5:5，-TTTGCCTCCTTCTGCATGGTATTCT-3，。[0151]使用的TaqMan探針核苷酸部分改為以下各組序列之一時，按照上述步驟檢測，結果相同，在突變樣本含量1/2500的情況下也能檢出，并且突變型DNA模板與野生型DNA模板比例為1/1~1/100時，定量分析的誤差一般在0.1%~5%。
[0152](I) PW2:5，-TTGGGCTGGCCAA-3，，
[0153]PM2:5，-TTTGGCCCGCCCA-3，，或者，
[0154](2 ) PW3:5，-TTTGGGCTGGCCAAA-3，，
[0155]PM3:5，-GTTTGGCCCGCCC-3，，或者，
[0156](3 ) PW4:5，-TGGGCTGGCCAAA-3，，
[0157]PM4:5 ’ -AGTTTGGCCCGCC-3，，或者，
[0158](4 ) PW5:5，-GGGCTGGCCAAACTG-3 ’，
[0159]PM5:5，-TGGCCCGCCCAAA-3，。
[0160]對照例
[0161]—、使用不同的使用PCR引物、TaqMan探針序列
[0162]1、按照實施例1的方法，區別在于使用不同的PCR引物，是按照熒光定量PCR技術設計的正反向引物。·
[0163]正向和反向PCR引物的序列為:
[0164]F1，:5， -AGCCAGGAACGTACTGGTGA-3’
[0165]Rl:’ 5 ’ -CTTACTTTGCCTCCTTCTGCATG-3，
[0166]在突變樣本含量為1/100時有檢出結果，突變樣本含量為1/1000時，約三分之一樣本有檢出結果；突變樣本含量為1/2500時不能檢出。
[0167]2、使用不同的TaqMan探針(按熒光定量PCR技術設計)。
[0168]TaqMan探針的核苷酸部分序列為:
[0169]與野生型DNA 模板結合的 PW1’: 5 ’ -CCCAGCAGTTTGGCCAG-3 ’
[0170]與突變型DNA 模板結合的 PM1’: 5’ -CCCAGCAGTTTGGCCCG-3’
[0171]在突變樣本含量為1/100時有檢出結果，突變樣本含量為1/1000時，約三分之一樣本有檢出結果；突變樣本含量為1/2500時不能檢出。突變樣本含量為1/100的樣品進行定量檢測，誤差為15%以上。
[0172]二、使用不同濃度的PCR引物和探針
[0173]1、按照實施例1的方法，區別在于，數字PCR混合液中PCR正向和反向引物的濃度分別為60nM。此時僅當突變含量為1/100時可檢出突變，突變樣本含量為1/1000和1/2500時均無法檢出突變。
[0174]2、按照實施例1的方法，區別在于，數字PCR混合液中PCR正向和反向引物的濃度分別為60nM，兩種TaqMan探針的濃度分別為60nM，僅當突變含量為1/100時可檢出突變，突變樣本含量為1/1000和1/2500時均無法檢出突變。
[0175]三、使用熒光定量PCR的方法檢測，檢出限為1/100，而且在突變樣本含量大于1%的情況下，定量分析的誤差大于10%。
【權利要求】
1.一種檢測EGFR基因外顯子21L858R點突變的PCR引物，其特征在于，為反向引物和正向引物； 正向引物含有以下核苷酸序列之一:
Fl: 5，-AAAACACCGCAGCATGTCAA-3，，
F2:5 ’ -AACACCGCAGCATGTCAAGA-3，，
F3:5 ’ -CACCGCAGCATGTCAAGATC-3，，
F4:5 ’ -CCGCAGCATGTCAAGATCAC-3，， F5:5，-GCAGCATGTCAAGATCACAG-3，； 反向引物含有以下核苷酸序列之一:
Rl: 5’ -CTTCTGCATGGTATTCTTTCTCTTC-3’，
R2:5 ’ -TCCTTCTGCATGGTATTCTTTCTCT-3，，
R3:5 ’ -CCTCCTTCTGCATGGTATTCTTTCT-3，，
R4:5 ’ -TGCCTCCTTCTGCATGGTATTCTTT-3，，
R5:5 ’ -TTTGCCTCCTTCTGCATGGTATTCT-3，。
2.權利要求1所述檢測EGFR基因外顯子21L858R點突變的PCR引物，其特征在于，正向引物選自以下核苷酸序列中的一種:
Fl: 5，-AAAACACCGCAGCATGTCAA-3，，
F2:5 ’ -AACACCGCAGCATGTCAAGA-3，，
F3:5 ’ -CACCGCAGCATGTCAAGATC-3，，
F4:5 ’ -CCGCAGCATGTCAAGATCAC-3，， F5:5，-GCAGCATGTCAAGATCACAG-3，； 反向引物選自以下核苷酸序列中的一種:
Rl: 5’ -CTTCTGCATGGTATTCTTTCTCTTC-3’，
R2:5 ’ -TCCTTCTGCATGGTATTCTTTCTCT-3，，
R3:5 ’ -CCTCCTTCTGCATGGTATTCTTTCT-3，，
R4:5 ’ -TGCCTCCTTCTGCATGGTATTCTTT-3，，
R5:5 ’ -TTTGCCTCCTTCTGCATGGTATTCT-3，。
3.權利要求1所述檢測EGFR基因外顯子21L858R點突變的PCR引物，其特征在于，正向和反向引物選自以下各組核苷酸序列之一: (I)正向 Fl: 5，-AAAACACCGCAGCATGTCAA-3，， 反向 Rl: 5’ -CTTCTGCATGGTATTCTTTCTCTTC-3’，或者，
(2 )正向 F2:5 ’ -AACACCGCAGCATGTCAAGA-3，， 反向 R2:5’ -TCCTTCTGCATGGTATTCTTTCTCT-3’，或者，
(3 )正向 F3:5 ’ -CACCGCAGCATGTCAAGATC-3，， 反向 R3:5’ -CCTCCTTCTGCATGGTATTCTTTCT-3’，或者， (4 )正向 F4:5，-CCGCAGCATGTCAAGATCAC-3，， 反向 R4:5 ’ -TGCCTCCTTCTGCATGGTATTCTTT-3，，或者，
(5 )正向 F5:5 ’ -GCAGCATGTCAAGATCACAG-3，， 反向 R5:5，-TTTGCCTCCTTCTGCATGGTATTCT-3，。
4.檢測EGFR基因外顯子21L858R點突變的TaqMan探針，其特征在于，包括與突變型DNA模板結合的TaqMan探針，或者包括與突變型DNA模板結合的TaqMan探針以及與野生型DNA模板結合的TaqMan探針； 所述與突變型DNA模板結合的TaqMan探針以及與野生型DNA模板結合的TaqMan探針為連接熒光基團和猝滅基團的核苷酸，且兩者所含的熒光基團不同； 與突變型DNA模板結合的TaqMan探針的核苷酸部分含有以下核苷酸序列中的一種: PMl:5 ’ -TTGGCCCGCCCAA-3，，
PM2:5 ’ -TTTGGCCCGCCCA-3，，
PM3:5 ’ -GTTTGGCCCGCCC-3，，
PM4:5，-AGTTTGGCCCGCC-3，，
PM5:5，-TGGCCCGCCCAAA-3，； 所述與野生型DNA模板結合的TaqMan探針的核苷酸部分含有以下核苷酸序列中的一種:
PWl:5 ’ -TTGGCCAGCCCAA-3，,
PW2:5 ’ -TTGGGCTGGCCAA-3，，
PW3:5 ’ -TTTGGGCTGGCCAAA-3，，
PW4:5> -TGGGCTGGCCAAA-3，,
PW5:5 ’ -GGGCTGGCCAAACTG-3，。
5.權利要求4所述檢測EGFR基因外顯子21L858R點突變的TaqMan探針，其特征在于，熒光基團選自6-羧基熒光素、六氯-6-羧基熒光素、Cy5、Cy3或VIC，猝滅基團選自6-羧基四甲基若丹明、BHQl、BHQ2或MGB。
6.權利要求4所述檢測EGFR基因外顯子21L858R點突變的TaqMan探針，其特征在于，所述與突變型野生型DNA模板結合的TaqMan探針的核苷酸部分選自以下核苷酸序列中的一種:
PMl:5 ’ -TTGGCCCGCCCAA-3，，
PM2:5 ’ -TTTGGCCCGCCCA-3，，
PM3:5 ’ -GTTTGGCCCGCCC-3，，
PM4:5，-AGTTTGGCCCGCC-3，，
PM5:5，-TGGCCCGCCCAAA-3，； 所述與野生型DNA模板結合的TaqMan探針的核苷酸部分選自以下核苷酸序列中的一種:
PWl:5 ’ -TTGGCCAGCCCAA-3，,
PW2:5 ’ -TTGGGCTGGCCAA-3，，
PW3:5 ’ -TTTGGGCTGGCCAAA-3，，
PW4:5> -TGGGCTGGCCAAA-3，,
PW5:5 ’ -GGGCTGGCCAAACTG-3，。
7.一種檢測EGFR基因外顯子21L858R點突變的試劑盒，其特征在于，含有以下物質中的至少一種: (I)權利要求1、2或3任一項所述的PCR引物；(2)權利要求4、5或6任一項所述的TaqMan探針。
8.一種檢測EGFR基因外顯子21L858R點突變的方法，其特征在于，包括如下步驟: (1)數字PCR混合液制備:將待測的DNA模板、權利要求1~3任一項所述PCR引物、權利要求4~6任一項的TaqMan探針以及PCR預混液混合，制備得到數字PCR混合液；其中的DNA模板、PCR引物及TaqMan探針的含量如下: a.DNA模板,含量為0.25~Ing/ μ L ； b.PCR引物，包括正向引物和反向引物，含量分別為500~700nM; c.TaqMan探針，包括與突變型DNA模板結合的TaqMan探針，含量為200~400nM ;或者，包括與突變型DNA模板結合的TaqMan探針以及與野生型DNA模板結合的TaqMan探針，含量分別為200~400nM ； (2)用數字PCR混合液制作PCR微反應液滴，再進行PCR擴增反應； PCR擴增條件為:93~97°C預變性3~15分鐘；93~97°C變性5~50秒，65~75°C退火5~50秒，55~65°C延伸10~65秒，共進行20~60個循環，2~10°C終止反應； (3)信號收集與結果判斷:對PCR擴增反應后的產物進行信號收集，根據熒光信號的類型判斷待測樣品中是否含有EG FR基因外顯子21L858R點突變的DNA模板及其數量和含量。
9.權利要求8所述檢測EGFR基因外顯子21L858R點突變的方法，其特征在于，數字PCR混合液中所含的DNA模板、PCR引物及TaqMan探針的含量如下: a.DNA模板,含量為0.5ng/ μ L ； b.PCR引物，包括正向引物和反向引物，含量分別為600nM ； c.TaqMan探針，包括與突變型DNA模板結合的TaqMan探針，含量為300nM ;或者，包括與突變型DNA模板結合的TaqMan探針以及與野生型DNA模板結合的TaqMan探針，含量分別為300nM。
10.權利要求8所述檢測EGFR基因外顯子21L858R點突變的方法，其特征在于，PCR擴增條件為:93.5~95°C預變性3~6分鐘；93.5~95°C變性8~15秒，64.5~66°C退火8~15秒，55~57°C延伸40~50秒，共進行30~35個循環，6~10°C終止反應。
11.權利要求8所述檢測EGFR基因外顯子21L858R點突變的方法，其特征在于，PCR擴增條件為:94°C預變性5分鐘；94°C變性10秒，65°C退火10秒，56°C延伸45秒，共進行32個循環，10°C終止反應。
【文檔編號】C12Q1/68GK103740843SQ201410040845
【公開日】2014年4月23日 申請日期:2014年1月27日 優先權日:2014年1月27日
【發明者】王貽锘 申請人:上海涌泰生物醫藥科技有限公司