人細小病毒B19三種基因型的實時熒光定量PCR檢測方法及其通用檢測引物、TaqMan探針 ...的制作方法
【專利摘要】本發明公開了一種對人細小病毒B19三種基因型同時進行定性、定量檢測的實時熒光定量PCR檢測方法及其通用檢測引物、TaqMan探針與試劑盒。本發明通用檢測引物、TaqMan探針可結合實時熒光定量PCR實現準確定性、定量待測樣本中三種基因型B19病毒DNA的目的，基于此形成的針對B19病毒三種基因型的NAT檢測方法明顯優于現有的檢測技術，具有準確度高、低污染、檢測速度快、對儀器設備要求低和成本低廉等優點，除臨床檢測和血液篩查外，還能對科研以及生產中對原料血漿和血液制品中B19病毒的污染狀況進行定性和定量分析，對保障血液制品的病毒安全性具有重要意義。
【專利說明】人細小病毒BI 9三種基因型的實時熒光定量PCR檢測方法及其通用檢測引物、TaqMan探針與試劑盒
【技術領域】
[0001]本發明涉及生物【技術領域】中核酸的分子生物學檢測方法，特別是涉及人細小病毒B19三種基因型的實時熒光定量PCR檢測方法及其通用檢測引物、TaqMan探針與試劑盒。
【背景技術】
[0002]人細小病毒B19 (B19病毒)與輸血安全和血液制品的病毒安全性密切相關。B19病毒是目前確認的唯一可致人類疾病的細小病毒。B19病毒感染后臨床表現多樣。兒童B19病毒感染以傳染性紅斑(EI)多見，又稱“第五病”。成人感染常為隱性感染，或者僅出現輕微發熱、頭痛等類似感冒的癥狀，免疫功能缺陷患者感染可以導致慢性貧血，血液病人感染可以引起短暫性再生障礙危象(TAC)，孕婦感染則可以導致流產、死產和水腫性死胎等。B19病毒感染還可以引發很多并發癥，包括嗜血細胞綜合征、肺炎、腎小球腎炎、神經系統癥狀、肝炎、過敏性紫癜、血管炎、心肌炎、心包炎等。除上述癥狀和疾病外，B19病毒還被認為與多種自身免疫病有關，包括系統性紅斑狼瘡、巨細胞動脈炎、結節性多動脈炎、特發性血小板減少性紫癜等。
[0003]B19病毒急性感染期，患者血液中病毒含量可高達IO11-IO14拷貝/mL。部分病毒感染者經過急性感染期后，病毒不被清除而形成持續感染，血液中病毒含量在IO3-IO7拷貝/mL之間，病毒在體內持續時間可長達幾個月甚至幾年。
[0004]B19病毒傳播途徑除主要經呼吸道傳播 外，也可通過輸血、血液制品傳播，且因為接受輸血和應用血液制品的人群常常有血液病、免疫缺陷或其它疾患存在，病毒感染后更容易導致疾病的發生。因此，血液、血制品感染途徑具有更重要的臨床意義。
[0005]近年來，國際組織及發達國家對于原料血漿及血液制品中B19病毒的污染均采取了一定的監控措施。國際血漿蛋白治療協會(PPTA)是全球血漿采集和治療產業的代表機構。PPTA在2003年制定相關標準:混合血漿中細小病毒B19DNA含量不能超過105IU/mL，并將核酸檢測技術(nucleic acid amplification technology,NAT)作為檢測B19病毒載量的一種在線控制措施執行。美國食品與藥品監督管理局(FDA)于2009年建議混合血漿中B19病毒的含量控制在< 104IU/mL的水平，將NAT方法作為在線控制措施，并且要求使用的NAT技術能檢出B19病毒的全部基因型(即能同時檢出B19病毒的三種基因型)。歐洲藥典對于抗D免疫球蛋白及S/D滅活血漿也做出要求，B19病毒載量低于104IU/mL。
[0006]NAT是一種新興的血液傳染病檢測方法，其敏感性和特異性均很高，可用于B19病毒感染的早期診斷及B19病毒分子流行病學調查。除此之外，還被血液制品生產企業用來進行原料血漿和血液制品生產的質量控制。目前，國內外常用來檢測B19病毒的NAT技術主要為聚合酶鏈反應技術(polymerase chain reaction,簡稱PCR)和實時突光定量PCR技術。
[0007]PCR是一種利用DNA變性和復性原理在體外進行特定的DNA片段高效擴增的技術，可檢出微量靶序列。在模板DNA、弓丨物和四種脫氧核糖核苷酸存在的條件下依賴于DNA聚合酶的酶促合成反應。僅需用極少量模板，在一對引物介導下，可擴增至100萬-200萬份拷貝。PCR反應分三步:變性、退火及延伸。以上三步為一循環，每一循環的產物作為下一個的模板，這樣經過多個循環，可得到大量復制的特異性DNA片段。
[0008]實時熒光定量PCR技術于1996年由美國Applied Biosystems公司推出，由于該技術不僅實現了 PCR從定性到定量的飛躍，而且與常規PCR相比，它具有特異性更強、自動化程度更高、可有效解決PCR污染問題等特點，目前已得到廣泛應用。所謂實時熒光定量PCR技術，是指在PCR反應體系中加入熒光基團，利用熒光信號積累實時監測整個PCR進程，最后通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法。TaqMan熒光探針:PCR擴增時在加入一對引物的同時加入一個特異性的熒光探針，該探針為一寡核苷酸，兩端分別標記一個報告熒光基團和一個淬滅熒光基團。探針完整時，報告基團發射的熒光信號被淬滅基團吸收；PCR擴增時，Taq酶的5’ 一 3’外切酶活性將探針酶切降解，使報告熒光基團和淬滅熒光基團分離，從而熒光監測系統可接收到熒光信號，即每擴增一條DNA鏈，就有一個熒光分子形成，實現了熒光信號的累積與PCR產物形成完全同步。
[0009]為制備高特異性、高敏感性、重復性好的B19病毒熒光定量PCR檢測試劑盒，其關鍵在于獲得針對B19病毒各種基因型及分離株的特異、敏感的通用引物及通用探針。目前，常用的檢測技術只針對B19病毒的I型，無法實現對B19病毒全部基因型的檢測。

【發明內容】

[0010]本發明的目的是提供一種特異性和靈敏度較高、省時省力的人細小病毒B19三種基因型同時進行定性、定量檢測的實時熒光定量PCR檢測方法及其通用檢測引物、TaqMan探針與試劑盒。
[0011]本發明所提供的一對用于對人細小病毒B19 (B19病毒)三種基因型進行實時熒光定量PCR檢測的通用型引物，其上游引物的核苷酸序列如序列表中SED ID NO:1所示，下游引物的核苷酸序列如序列表中SEQ ID N0:2所示。
`[0012]將上游引物命名為P(NSl-1)，序列表中的SEQ ID NO:1由20個堿基組成，該序列位于B19病毒NSl基因自5’端第1638-1657位堿基；將下游引物命名為P (NS1-2)，SEQ IDNO:2由23個堿基組成，該序列為B19病毒NSl基因自5’端第1736-1758位堿基的反向互補序列。
[0013]由上述引物衍生的引物序列也屬于本發明的保護范圍。所述衍生序列是指在SEQID N0:1和/或SEQ ID NO:2的基礎上經過一至十個堿基的取代、缺失或添加得到的引物序列。
[0014]上述引物既適用于B19病毒三種基因型的實時熒光定量PCR檢測中，也可用于該病毒的常規PCR檢測技術中，其檢測對象是B19病毒的NSl基因。若以待測樣品中提取的DNA為模板，在上述弓丨物的引導下進行PCR擴增，擴增產物中若有12Ibp大小的條帶，則樣品中含有B19病毒。
[0015]本發明還提供了用于對B19病毒三種基因型同時進行實時熒光定量PCR檢測的通用型TaqMan探針。
[0016]本發明所提供的TaqMan探針，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:3所示；所述探針為經過熒光標記的，其5’端標記有報告熒光基團，3’端標記有淬滅熒光基團。[0017]所述報告熒光基團可為HEX、FAM等，優選為HEX ;所述熒光淬滅基團可為ECLIPSE、TAMRA 等，優選為 ECLIPSE。
[0018]為防止PCR擴增時被延伸，所述探針的3’端還需經磷酸化處理。
[0019]將序列表中SEQ ID NO:3所示的TaqMan探針命名為TaqManProbe (NSl)，序列表中的SEQ ID NO:3由26個堿基組成，該序列為B19病毒NSl基因自5’端第1655-1680位喊基。
[0020]由上述TaqMan探針序列的衍生序列也屬于本發明的保護范圍。所述衍生序列是指在SEQ ID NO:3的基礎上，在序列的5’端和/或3’端再添加、減少一個或多個堿基得到的序列。
[0021]本發明所提供的同時檢測B19病毒三種基因型的實時熒光定量PCR檢測試劑盒，包含上述用于對人細小病毒B19 (B19病毒)三種基因型進行實時熒光定量PCR檢測的通用型引物和TaqMan探針。
[0022]具體的，該試劑盒可為將用于對人細小病毒B19 (B19病毒)三種基因型進行實時熒光定量PCR檢測 的引物、TaqMan探針混合液120 μ L (含P (NSl-1) 48 μ L，P (NS1-2) 48 μ L, TaqManProbe (NSl) 24 μ L)、定量 PCR 反應 Mix 液(Platinum QuantitativePCR SuperMix-UDG) 480 μ L、B19_pUC19 標準品(I X 104、I X 103、I X 102、I X IO1 拷貝 / μ L4個梯度，每個梯度各30 μ L)、和陰性對照(B19病毒核酸陰性的血漿)150 μ L共同包裝，得到可同時對人細小病毒Β19 (Β19病毒)三種基因型進行定性、定量檢測的實時熒光定量PCR檢測試劑盒。
[0023]本發明還提供了一種針對原料血漿或血液制品用上述實時熒光定量PCR檢測試劑盒同時對Β19病毒三種基因型進行檢測的方法，可包括以下步驟:
[0024]I)標準曲線的建立:用攜帶121bp B19病毒NSl基因保守區的質粒作為標準品，梯度稀釋成 I X ?ο10、I X IO9、I X 108、I X 107、I X IO6、I X 105、I X IO4、I X 103、I X IO2 拷貝 / μ L，將質粒作為模板，在試劑盒中通用型引物和TaqMan探針的引導下進行Β19病毒NSl基因的實時熒光定量PCR檢測，檢測結束后，以各標準品的濃度Log值對其相應Ct值作圖，繪制標準曲線；
[0025]2)以原料血漿或血液制品為待測樣本，提取待測樣本的DNA，以提取的DNA為模板，在試劑盒中通用型引物和TaqMan探針的引導下進行B19病毒NSl基因的實時熒光定量PCR檢測；
[0026]3)根據待測樣本的熒光信號的變化及強度，對待測樣本中的B19病毒NSl基因進行定性、定量檢測，出現熒光擴增曲線表明樣本中含有B19病毒NSl基因，未出現熒光擴增曲線表明樣本中不含有B19病毒NSl基因，再根據樣本的熒光信號強度和步驟I)中的標準曲線，得到樣本中B19病毒NSl基因的含量。
[0027]在上述檢測方法中，所述步驟I)和步驟2)中的20 μ L實時熒光定量PCR反應體系可包括:1 XPlatinum Quantitative PCR SuperMix-UDG, 500nM P(NS1-1)，500nMP (NS1-2)，250nM TaqManProbe (NSl)，模板 3 μ L，加 ddH20 M 20 μ L0
[0028]所述步驟I)和步驟2)中的實時熒光定量PCR反應條件可為:先50°C 2min,95°C 2min ;然后95°C 9s,60°C 30s，共40個循環。在每個循環的延伸結束時進行熒光信號檢測。[0029]從技術上，上述使用實時熒光定量PCR檢測試劑盒同時對B19病毒三種基因型進行檢測的方法同樣適用于臨床樣本或面向獻血人群的血液篩查樣本。但本發明聲明放棄與此應用相關的權利，因此，所述檢測方法偏向應用于對于原料血漿及血液制品中B19病毒污染的監控，以對從原料到成品的生產環節進行B19病毒檢測。
[0030]本發明提供了人細小病毒B19三種基因型同時進行定性、定量檢測的實時熒光定量PCR檢測方法及其通用檢測引物、TaqMan探針與試劑盒。該方法是通過提取待測樣品的DNA，再結合通用檢測引物、TaqMan探針和實時熒光定量PCR檢測技術，可達到準確定性、定量待測樣本中三種基因型B19病毒DNA的目的。該方法是以待檢樣品中的核酸為檢測對象，準確度、靈敏度及穩定性均較好。本發明具有以下優點:
[0031]1、首次建立了人細小病毒B19三種基因型的實時熒光定量PCR檢測方法，利用此檢測方法可以對原料血漿及相關生物制品進行批量檢測。
[0032]2、本檢測方法與人細小病毒B19三種基因型的其它常規檢測方法如病毒的分離培養鑒定、B19病毒抗體ELISA法和Nest-PCR相比，靈敏度較高，取樣便捷，檢測效率得到了大幅提高，并且有效地防止了操作過程中的實驗污染。
[0033]3、本檢測方法與人細小病毒B19三種基因型的其它常規檢測方法，如病毒的分離培養鑒定、B19病毒抗體ELISA法和Nest-PCR相比，具有操作程序簡單易用的特點，并可進一步制成檢測試劑盒，操作程序化，適合推廣和應用。
[0034]4、本檢測方法不僅能夠評價人細小病毒B19三種基因型的感染狀況，同時也為人細小病毒B19三種基因型的流行病學、致病機理等相關領域的研究提供了依據。
[0035]綜上所述，本發明可實現對人細小病毒B19三種基因型同時進行定性、定量檢測，是因為本發明對比了 GenBank中B19病毒三種基因型代表株(GenBankN0.:prototype:M13178 ；Lali:AY044266 ；V9:NC-004295)的基因序列，設計了針對 NSl 基因保守區的可同時檢測B1 9病毒三種基因型的引物與探針。通過提取待測樣品的DNA，再結合PCR技術或實時熒光定量PCR檢測技術，可達到準確定性或定量檢測樣本中B19病毒DNA的目的。本發明B19病毒三種基因型的NAT檢測方法明顯優于現有的檢測技術，具有準確度高、低污染、檢測速度快、對儀器設備要求低和成本低廉等優點，適合推廣和應用。本發明設計了能同時檢測B19病毒全部三種基因型的通用引物和探針，除了可用于臨床檢測及獻血/漿人群進行血液篩查外，還可用于科研以及生產中對原料血漿和血液制品中B19病毒的污染狀況進行定性和定量分析，對保障我國血液制品的病毒安全性具有重要意義。
[0036]下面結合具體實施例對本發明做進一步詳細說明。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0037]圖1為PCR擴增三種基因型的人細小病毒B19NS1基因保守區的2%瓊脂糖凝膠電泳檢測結果
[0038]圖2為以標準品質粒為模板進行實時熒光定量PCR的擴增曲線
[0039]圖3為以標準品質粒為模板進行實時熒光定量PCR的標準曲線
[0040]圖4為以樣品為模板進行實時熒光定量PCR的擴增曲線
[0041]圖5為B19病毒實時熒光定量PCR檢測方法特異性檢測的擴增結果
[0042]圖6為B19病毒實時熒光定量PCR檢測方法準確性和穩定性檢測的擴增結果[0043]圖7為B19病毒實時熒光定量PCR檢測方法靈敏度檢測的擴增結果【具體實施方式】
[0044]下述實施例中所用方法如無特別說明均為常規方法，具體步驟可參見:((Molecular Cloning:A Laboratory Manual))(Sambrook, J.,Russell,David ff.,MolecularCloning:A Laboratory Manual, 3rd edition, 2001, NY, Cold Spring Harbor)。
[0045]所述百分比濃度如無特別說明均為質量/體積(W/V)百分比濃度或體積/體積(V/V)百分比濃度。
[0046]實施例中描述到的各種生物材料的取得途徑僅是提供一種實驗獲取的途徑以達到具體公開的目的，不應成為對本發明生物材料來源的限制。事實上，所用到的生物材料的來源是廣泛的，任何不違反法律和道德倫理能夠獲取的生物材料都可以按照實施例中的提示替換使用。
[0047]所用引 物和TaqMan探針均由大連寶生物公司合成,標準品質粒由中美泰和生物技術(北京)有限公司合成。
[0048]實施例在以本發明技術方案為前提下進行實施，給出了詳細的實施方式和具體的操作過程，實施例將有助于理解本發明，但是本發明的保護范圍不限于下述的實施例。
[0049]實施例1、用于可同時對人細小病毒B19 (B19病毒)三種基因型進行定性、定量檢測的實時熒光定量PCR檢測引物及TaqMan探針的設計
[0050]根據GenBank 中 B19 病毒三種基因型代表株(GenBank N0.!prototype:Ml3178 ；Lali:AY044266 ；V9:NC-004295)的基因序列，利用DNA Man軟件進行比對后，根據引物、TaqMan探針設計原則，選取121bp的NSl基因保守區域序列(如序列表中SEQ ID NO:4所示)作為檢測序列，設計同時檢測B19病毒三種基因型的實時熒光定量PCR檢測引物及TaqMan探針，得到序列如下:
[0051]上游引物P(NSl-1):5’-CGGGACCAGTTCAGGAGAAT-3’(序列表中 SEQ ID NO:l),Tm值為 57.40C ；
[0052]下游引物P(NSl-2):5’-CCCAACTAACAGTTCACGAAACT-3’(序列表中 SEQ ID NO:2),Tm 值為 56.6°C ；
[0053]TaqManProbe(NSl):5’HEX-AATCATTTGTCGGAAGCCCAGTTTCC-ECLIPSE3’(序列表中SEQ ID NO:3)，Tm 值為 60.9°C。
[0054]將上游引物命名為P(NSl-1)，序列表中的SEQ ID NO:1由20個堿基組成，該序列位于B19病毒NSl基因自5’端第1638-1657位堿基；將下游引物命名為P (NS1-2)，SEQ IDNO:2由23個堿基組成，該序列為B19病毒NSl基因自5’端第1736-1758位堿基的反向互補序列。
[0055]將TaqMan探針命名為TaqManProbe (NSl)，序列表中的SEQ ID NO:3由26個堿基組成，該序列為B19病毒NSl基因自5’端第1655-1680位堿基。
[0056]將上述TaqMan探針的5’端標記報告熒光基團HEX，3’端標記淬滅熒光基團ECLIPSE，并將探針的3’端進行磷酸化處理。
[0057]實施例2、用本發明的引物對人細小病毒B19三種基因型進行常規PCR檢測
[0058]1、提取B19病毒的DNA[0059]將分別包含三種基因型的B19病毒國際標準品血漿(NIBSC code:09/110)作為待測樣品(三個樣品)，用High Pure Viral Nucleic Acid Kit (Roche)并參照試劑盒說明書提取B19病毒DNA。
[0060]2、常規PCR檢測
[0061]分別以步驟I提取的不同基因型的B19病毒核酸為模板，在本發明引物P(NSl-1)和P(NSl-2)的引導下PCR擴增121bp的NSl基因保守區，25 μ L PCR反應體系為:10XPCR緩沖液(配方:Tris.HCl (ρΗ8.3)100mM,KC1500mM,MgCl215mM)2.5 μ L, dNTPs (2.5mM each)2μ L,400nM P (NS1-1)，400nM P (NS1-2)，DNA 模板 5 μ L，5U Taq 酶(TaKaRa)，加 ddH20 至25 μ L。PCR 反應條件為:先 94°C 5min ;然后 94°C 30s, 60°C 30s, 72°C lmin，共 35 個循環；最后72°C 10min，4°C終止反應。反應結束后，將PCR擴增產物進行2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(100V電泳40min)，檢測結果如圖1所示(泳道M:Marker DL500，泳道A:B19病毒I型，泳道B:B19病毒2型，泳道C:B19病毒3型，泳道D:陰性對照)，結果分別加有B19病毒三種基因型的樣品經PCR擴增均得到了 121bp的目的條帶，與預期結果相符，表明本發明的引物可用于人細小病毒B19三種基因型的常規PCR (定性)檢測。
[0062]實施例3、用本發明的引物及TaqMan探針進行B19病毒的實時熒光定量PCR檢測
[0063]1、B19病毒DNA的提取
[0064]取兩份原料血衆和一份血液制品作為待測樣品，使用High Pure Viral NucleicAcid Kit (Roche)并參照試劑盒說明書提取樣品DNA。
[0065]2、實時熒光定量PCR標準品的制備
[0066]本發明構建陽性標準品質粒`的目的基因片段為121bp的B19病毒NSl基因保守區，克隆載體為PUC19載體，載體大小為2686bp，Amp+抗性，將B19病毒NSl基因保守區連接入pUC19載體多克隆位點的Sal I和BamH I酶切位點之間，將攜帶有B19病毒NSl基因保守區的重組質粒命名為B19-pUC19。利用Primer Premier5.0軟件對此序列進行評價,在符合實時熒光定量PCR實驗對TaqMan探針及引物的要求的情況下，送與中美泰和生物技術(北京)有限公司合成B19-pUC19全基因，全基因序列如序列表中SEQ ID NO:5所示。
[0067]對全基因合成的陽性質粒進行擴大培養，轉化大腸桿菌DH5CI感受態細胞，經Amp+抗性篩選，挑取單菌落小量制備質粒DNA，即得到陽性標準品。用紫外分光光度計準確定量后，根據以下公式計算出其拷貝數，進行10倍梯度稀釋，濃度依次為ΙΧΙΟ'ΙΧΙΟ9、I X 108、1X 107、1X 106、1X 105、1X 104、1X 103、1X IO2 拷貝 / μ L，作為標準品保存于-200C備用。
【權利要求】
1.用于對人細小病毒B19(B19病毒)三種基因型進行實時熒光定量PCR檢測的通用型引物，其上游引物(命名為P(NSl-1))的核苷酸序列如序列表中SED ID NO:1所示，下游引物(命名為P(NSl-2))的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:2所示；或， 由SEQ ID NO:1和/或SEQ ID NO:2經過一至十個堿基的取代、缺失或添加得到的衍生序列表示的引物。
2.用于對B19病毒三種基因型同時進行實時熒光定量PCR檢測的TaqMan探針，命名為TaqManProbe (NSl)，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:3所示。
3.根據權利要求2所述的TaqMan探針，其特征在于:所述探針為經過熒光標記的，其5’端標記有報告突光基團,3’端標記有淬滅突光基團；所述報告突光基團可為HEX、FAM,優選為HEX ;所述熒光淬滅基團可為ECLIPSE、TAMRA，優選為ECLIPSE。
4.根據權利要求2或3所述的TaqMan探針，其特征在于:所述探針的3’端還需經磷酸化處理。
5.根據權利要求2或3或4所述的TaqMan探針,其特征在于:由上述TaqMan探針序列的衍生序列表不；所述衍生序列是指在SEQ ID NO:3的基礎上，在序列的5’端和/或3’端再添加、減少一個或多個堿基得到的序列。
6.一種同時檢測 B19病毒三種基因型的實時熒光定量PCR檢測試劑盒，包含有權利要求I所述的通用型引物和權利要求2-5任一所述的TaqMan探針。
7.根據權利要求6所述的試劑盒，其特征在于:為將用于對人細小病毒B19(B19病毒)三種基因型進行實時熒光定量PCR檢測的引物、TaqMan探針混合液120yL (含P (NSl-1) 48 μ L，P (NS1-2) 48 μ L, TaqManProbe (NSl) 24 μ L)、定量PCR 反應Mix 液(PlatinumQuantitative PCR SuperMix-UDG) 480 μ L、B19_pUC19 標準品(I X 104、I X 103、I X 102、IXlO1拷貝/ μ L4個梯度，每個梯度各30 μ L)、和陰性對照(Β19病毒核酸陰性的血漿)150 μ L共同包裝，得到可同時對人細小病毒Β19 (Β19病毒)三種基因型進行定性、定量檢測的實時熒光定量PCR檢測試劑盒。
8.—種針對原料血漿和血液制品用權利要求6或7所述實時熒光定量PCR檢測試劑盒同時對Β19病毒三種基因型進行檢測的方法，包括以下步驟: 1)標準曲線的建立:用攜帶121bpB19病毒NSl基因保守區的質粒作為標準品，梯度稀釋成 I X 1010、I X IO9、I X 108、I X 107、I X IO6、I X 105、I X IO4、I X 103、I X IO2 拷貝 / μ L，將質粒作為模板，在試劑盒中通用型引物和TaqMan探針的引導下進行Β19病毒NSl基因的實時熒光定量PCR檢測，檢測結束后，以標準品濃度為橫坐標、以熒光信號強度為縱坐標繪制標準曲線； 2)以原料血漿或血液制品為檢測樣本，提取檢測樣本的DNA，以提取的DNA為模板，在試劑盒中通用型引物和TaqMan探針的引導下進行Β19病毒NSl基因的實時熒光定量PCR檢測； 3)根據檢測樣本的熒光信號的變化及強度，對樣本中的Β19病毒NSl基因進行定性、定量檢測，出現突光擴增曲線表明樣本中含有Β19病毒NS I基因,未出現突光擴增曲線表明樣本中不含有含有Β19病毒NSl基因，再根據樣本的熒光信號強度和步驟I)中的標準曲線，得到樣本中Β19病毒NSl基因的含量。
9.根據權利要求8所述的檢測方法，其特征在于:所述步驟I)和步驟2)中的20μ L實時突光定量PCR反應體系可包括:1 XPlatinum Quantitative PCR SuperMix-UDGlO μ L,500nM P (NSl-1) I μ L, 500ηΜ P (NS1-2) I μ L, 250nMTaqManProbe (NSl) 0.5 μ L,模板 3 μ L，加ddH20 至 20μ L。
10.根據權利要求8或9所述的檢測方法，其特征在于:所述步驟I)和步驟2)中的實時熒光定量PCR反應條件可為:先50°C 2min，95°C 2min ;然后95°C 9s,60°C 30s，共40個循環。在每個循環 的延伸結束時進行熒光信號檢測。
【文檔編號】C12Q1/68GK103451320SQ201310378628
【公開日】2013年12月18日 申請日期:2013年8月27日 優先權日:2013年8月9日
【發明者】馬玉媛, 章金剛, 賈俊婷, 趙雄, 郭逸, 呂茂民, 尹惠瓊 申請人:中國人民解放軍軍事醫學科學院野戰輸血研究所