賴氨酸、纖維素酶的發酵及包被飼料的制作方法
【專利摘要】本發明涉及賴氨酸、纖維素酶的發酵及包被飼料，提供了發酵制備L-賴氨酸制品的方法，其包括發酵產生L-賴氨酸發酵液，可以與可發酵獲得的耐高溫脫水的纖維素酶混合，高溫干燥后用脂肪包被。另外，本發明還提供了所述方法生產的產品以及耐高溫脫水的纖維素酶等。
【專利說明】賴氨酸、纖維素酶的發酵及包被飼料
【技術領域】
[0001]本發明屬于氨基酸的發酵領域，具體而言，本發明涉及發酵制備L-賴氨酸制品的方法，其包括發酵產生L-賴氨酸發酵液，該發酵液可以與可發酵獲得的耐高溫脫水的纖維素酶混合，高溫干燥后用脂肪包被。另外，本發明還提供了所述方法生產的產品以及耐高溫脫水的纖維素酶等。
【背景技術】
[0002]纖維素酶能夠有效降解含纖維素的物質(如，飼料)，因此在飼料中添加纖維素酶能夠增強飼料的吸收利用率，從而節約飼養成本。例如，中國專利96196760.9公開了反芻動物飼料的酶添加物，其包含纖維素酶。
[0003]L-賴氨酸是重要的氨基酸原料，可以作為調味品、食品、飼料添加劑使用，也可以作為保健品、藥品中的有效或輔料成分，廣泛應用于食品業、飼料業、制藥業及其他化學工業中。當前，L-賴氨酸的生產主要是通過微生物的發酵生產的，如可以利用棒狀桿菌生產。
[0004]然而，當賴氨酸作為飼料的時候，由于其屬于小分子營養物質，很快就能釋放到動物體內，尤其在大量攝取時，影響了動物吸收利用的效率。通常解決的方法是少量多次地喂食動物，但是這將增加動物飼養的工作量。因此，本發明提出了直接用賴氨酸發酵培養液制備包被的賴氨酸制品的方法，可以有效減緩賴氨酸在動物體內釋放的速度。
[0005]常規地，包被的賴氨酸制品可以和含纖維素酶的酶添加劑在喂飼時一起混合入動物飼料中。這樣使用中比較麻煩，而且容易混合不均勻，相應利用率降低。
[0006]本發明人設想，在制備包被的賴氨酸制品的過程中將纖維素酶與賴氨酸發酵培養液直接混合，可以混合地很均勻，然后進行包被，然而卻發現受制于包被中要經歷的高溫以及干燥過程，常規的酶活性將極大地削弱，甚至完全喪失。令人意外地，本發明人發現了一株耐熱且耐旱的霉菌菌株，經過艱苦深入細致的研究，其中分離的纖維素酶經歷高溫干燥后仍舊能夠保持高纖維素酶活性，因此適于在其中方便地使用，減少了喂飼時使用的麻煩。

【發明內容】

[0007]本發明要解決的技術問題在于提供新的發酵制備L-賴氨酸制品的方法，其包括發酵產生L-賴氨酸發酵液，該發酵液可以與可發酵獲得的耐高溫脫水的纖維素酶混合，高溫干燥后用脂肪包被。另外，本發明還提供了所述方法生產的產品以及其中所用的物質等。
[0008]具體而言，在第一方面，本發明提供了發酵制備L-賴氨酸制品的方法，包括，發酵產生L-賴氨酸發酵液，該發酵液可以與耐高溫脫水的纖維素酶混合，經高溫干燥后收集的顆粒用脂肪包被。因此，本發明第一方面的方法發酵制備的L-賴氨酸制品分兩層，外層包裹內層，其中外層是脂肪，而內層含有L-賴氨酸和耐高溫脫水的纖維素酶。該L-賴氨酸制品能夠減緩賴氨酸在動物體內釋放的速度，而且能夠具有纖維素酶活性。該制品優選是飼料添加劑。
[0009]更具體地，在第一方面，本發明提供了發酵制備L-賴氨酸制品的方法，其包括: (1)在發酵條件下培養導入了編碼吡啶核苷酸轉氫酶的多核苷酸的產L-賴氨酸的菌，獲得發酵液，過濾后保留濾液；
(2)在發酵條件下培養導入了編碼耐高溫脫水的纖維素酶的多核苷酸的分泌表達菌，過濾后保留上清液；
(3)混合步驟(I)獲得的濾液和步驟(2)獲得的上清液，得到混合液；
(4)對步驟(3)獲得的混合液高溫噴霧干燥，并任選進行篩分和/或破碎，收集顆粒；和
(5)將步驟(4)收集的顆粒用脂肪包被。
[0010]脂肪包被顆粒可以通過流化制粒包衣機將熔化的脂肪噴涂在顆粒表面上來實現，因此優選脂肪是室溫狀態下為固態而熔點略高于室溫(如，45-80°C，優選50-65°C)的脂肪。優選在本發明第一方面的方法中，脂肪優選是分餾棕櫚脂肪，更優選是百佳能(BergaFat)，其可以通過商業途徑方便地獲取。在本發明的【具體實施方式】中，包被所用的脂肪是百佳能HTL316。
[0011]本發明人發現，脂肪層包被(噴涂)得越厚，制備得到的L-賴氨酸制品的抗降解能力越強。優選在本發明第一方面的方法中，在步驟(5)中，步驟(4)獲得的顆粒和脂肪的重量比為2?8:8?2，優選為3?7:7?3，更優選為5?6.5:5?3.5。
[0012]在步驟(4)中，對于其中干燥得到的粒徑分布不均勻，可以進行篩分，收集一定粒徑范圍的顆粒；和/或對于干燥和/或篩分得到的粒徑較大的顆粒，可以進行粉碎，然后繼續進行篩分，收集一定粒徑范圍的顆粒。優選在本發明第一方面的方法中，收集的顆粒的粒徑小于0.8mm,優選小于0.5mm。大于0.5mm的顆粒。另外優選在本發明第一方面的方法中，高溫噴霧干燥可以在流化床干燥機內進行。為了使最終顆粒的形狀更為均勻，流化床干燥機內尾氣溫度不宜過高，通常不高于100°C，優選不高于85°C，更優選保持在80±3°C。因此，優選在本發明第一方面的方法中，步驟(4)中，高溫為60-100°C，優選為65-90°C，更優選為75-85。。。
[0013]賴氨酸作為小分子化合物，高溫脫水干燥對其不會產生過多不利影響；而纖維素酶作為大分子蛋白質，經高溫和/或脫水，有可能使其降解和/或變性，從而導致其酶活性的顯著降低或喪失，無法起到相應作用。因此本發明可以采用了耐高溫脫水的纖維素酶，其中高溫為60-100°C，優選為65-90°C，更優選為75-85°C。
[0014]優選在作為飼料添加劑使用時，由于纖維素酶的需要量少于賴氨酸的，因此本發明第一方面的方法發酵制備的L-賴氨酸制品中優選賴氨酸含量高，而同時纖維素酶含量低，可以低至滿足飼料所需纖維素酶的活性。優選在本發明第一方面的方法中，步驟(I)獲得的濾液和步驟(2)獲得的上清液的體積比為10:0.01-10，優選為10:0.1-5，更優選為10:0.5?2。
[0015]多核苷酸可以通過各種本領域技術人員所熟知的方式被導入菌中，使該菌表達所述多核苷酸編碼的酶，如吡啶核苷酸轉氫酶和/或纖維素酶。所述多核苷酸可以直接被導入，例如利用微粒體、基因槍等導入細胞；也可以間接被導入，例如可以通過構建在質粒載體上導入細胞。導入的所述多核苷酸可以整合在細胞的基因組上表達，也可以游離表達。優選本發明第一方面的方法中，編碼酶的多核苷酸可以利用穿梭質粒導入菌中，如編碼吡啶核苷酸轉氫酶的多核苷酸可以利用大腸桿菌-棒狀桿菌穿梭質粒導入產L-賴氨酸的菌(如棒狀桿菌)中，又如編碼纖維素酶的多核苷酸可以利用大腸桿菌-酵母菌穿梭質粒導入分泌表達菌(如畢氏酵母)中。
[0016]吡啶核苷酸轉氫酶是吡啶核苷酸轉氫酶是野生型吡啶核苷酸轉氫酶或其變體。野生型吡啶核苷酸轉氫酶是本領域技術人員所知曉的，其包括α亞基和β亞基，其中α亞基和β亞基的序列分別如NCBI (http://www.ncb1.nlm.nih.gov)蛋白和基因登錄號NP416120.1和AAC74674.1所示。優選的變體可以是中國專利201110065683.5所公開的吡啶核苷酸轉氫酶變體，在實際生產中增加了賴氨酸的產量(也可參見中國專利201110151495.4)，其包括α亞基變體和β亞基變體，其中α亞基變體相對于野生型α亞基在Μ102、L127或Q322的位置上被其他天然氨基酸替換，優選替換是M102L、L127R和Q322K ； β亞基變體相對于野生型β亞基在Α398或D400的位置上被其他天然氨基酸替換，優選替換是A398S和D400H。在本發明的【具體實施方式】中，采用吡啶核苷酸轉氫酶變體，其是由如SEQ ID Νο:5所示的核苷酸序列編碼的。
[0017]本發明第一方面的方法中，耐高溫脫水的纖維素酶優選是本發明人令人意外地發現的菌株產生的纖維素酶，該纖維素酶與現有已知的纖維素酶同源性很低，而且具有耐高溫脫水的優勢，經證實即使被高溫蒸發干燥后，仍舊能保留90%以上的酶活性，從而使得本發明第一方面的方法能夠得以順利實施。優選本發明第一方面的方法中，耐高溫脫水的纖維素酶的氨基酸序列:
(1)如SEQ ID Νο:2 所示;或
(2)是對SEQID No:2缺失、添加和/或取代一個或幾個(優選不超過7個，更優選不超過5個，如不超過3個)氨基酸殘基而獲得的保留SEQ ID Νο:2活性的序列。本領域技術人員通過重組DNA技術，能夠制備出經缺失、添加和/或取代氨基酸殘基而獲得的變體蛋白。在本發明的【具體實施方式】中，纖維素酶是由如SEQ ID No:1所示的核苷酸序列編碼的。
[0018]在步驟(2)中，過濾除去菌體而保留上清液，其中優選使用0.22 μ m濾膜進行過濾。上清液可以提純和/或濃縮，也可以直接用于本發明第一方面的方法中，優選是后者。
[0019]優選本發明第一方面的方法中，在步驟(2)中，上清液的纖維素酶活性不小于1000IU/L，優選不小于5000IU/L，更優選不小于8000IU/L，例如不小于12000IU/L。本發明的耐高溫脫水的纖維素酶經高溫脫水干燥，仍舊能基本保留原酶活性。優選的步驟(2)中的在發酵條件下培養的方法包括:
(i)將分泌表達耐高溫脫水的纖維素酶的菌(如，酵母菌)接入液體培養基中，于28-33 °C 培養至 0D600 達到 3.0-8.0 ；
(ii )將步驟(i )獲得的培養液以3-7%(體積)的接種量接種于液體培養基中，于28-33°C培養20-28小時；
(iii)將甲醇以0.3-0.7% (體積)的接入量加入步驟(ii)獲得的培養液中，誘導培養3-8天，期間每24小時補加0.3-0.7% (體積)接入量的甲醇，通氣控制溶氧大于20%，并控制 pH 為 5.8-6.4。
[0020]在本文中，接種量或接入量具有本領域技術人員所能常規理解的含義，具體在以體積百分比表示的時候，指的是菌體培養液(接入的菌液)或接入的其他液體體積相對于被接入的培養基體積的百分比量。
[0021]其中，液體培養基是能使分泌表達耐高溫脫水的纖維素酶的菌(如，酵母菌)生長的液體培養劑。步驟(i)和步驟(ii)中的液體培養基可以是相同的，也可以使不同，優選是相同的，如可以是BMGY液體培養基，其配方為IOOmM磷酸鉀緩沖液(pH6.0)中，含1% (重量)酵母提取物、2% (重量)蛋白胨,酵母含氮堿基1.34% (重量)，生物素4*10-5% (重量)，葡萄糖2% (重量)，甘油1% (體積)。
[0022]在步驟(I)中，過濾除去菌體而保留濾液，其中優選使用超濾膜進行過濾。濾液可以提純和/或濃縮，也可以直接用于本發明第一方面的方法中，優選是后者。
[0023]優選本發明第一方面的方法中，在步驟(I)中，濾液中L-賴氨酸的含量高于50g/L，優選高于70g/L，更優選高于90g/L。這可以利用許多現有技術來實現，包括菌種的改良和/或發酵流程的改良。示例性的步驟(I)中的在發酵條件下培養的方法包括:
Ca)將產L-賴氨酸的菌接入第一發酵罐于31-38°C培養10-20小時；
(b)將步驟(a)獲得的培養液以3-7%(體積)的接種量接種于第二發酵罐，于36-40°C培養3-8小時；
(c)向第二發酵罐持續流加糖，其中糖的每小時流加量為第二發酵罐內培養液量的0.2-0.35% (重量)，進行10-18小時；
Cd)向第二發酵罐持續流加 糖和氮源，其中糖的每小時流加量為第二發酵罐內培養液量的0.3-0.5%(重量),而且氮源的每小時流加量為第二發酵罐內培養液量的0.1-0.25%(重量)，進行30-65小時，優選50-55小時。
[0024]在本文中，“第一”和“第二”在修飾發酵罐的時候，是為了區分所修飾的發酵罐，SP第一發酵罐和第二發酵罐是不同的。其中，優選第一發酵罐中的培養基配方為:每18立方米培養基中含，葡萄糖500-750公斤，甘蔗糖蜜50-300公斤，玉米漿400-600公斤，KH2PO430-80 公斤，MgSO4.7Η20 3-15 公斤，FeSO4.7Η20 0.1-1 公斤，MnSO4.7Η20 0.1-1 公斤，生物素5-30克，和葉酸3-10克，和/或，優選第二發酵罐的培養基配方為:每315立方米培養基中含，葡萄糖10000-15000公斤，甘蔗糖蜜50-3000公斤，玉米漿10000-15000公斤，KH2PO4700-1200 公斤，MgSO4.7Η20 5-220 公斤，FeSO4.7Η20 5-25 公斤，MnSO4.7Η20 5-220 公斤，生物素150-300克，和葉酸50-120克。
[0025]步驟(C)和(d)的部分培養條件(如，溫度，pH等)與步驟(b)的可以相同，也可以不同。步驟(b)中，不進行流加操作；而在步驟(c)和(d)中，pH維持在6.5至7.8之間，這可以簡單地通過流加堿或酸來實現。
[0026]在本文中，流加量具有本領域技術人員所能常規理解的含義，具體在以重量百分比表示的時候，指的是加入物質的重量占被加入物質(如，培養液)的重量的百分比量。優選步驟(c)和(d)中的糖是葡萄糖。在步驟(c)中，葡萄糖的每小時流加量為第二發酵罐內培養液量的0.2-0.35% (重量)，優選為0.27-0.33% (重量)。在步驟(d)中，葡萄糖的每小時流加量為第二發酵罐內培養液量的0.3-0.5% (重量)，優選為0.42-0.48% (重量)。
[0027]優選步驟(d)中的氮源是無機氮源，優選是硫酸氨或氯化銨，如硫酸氨。在步驟(d)中，硫酸氨的每小時流加量為第二發酵罐內培養液量的0.1-0.25% (重量)，優選為
0.17-0.23% (重量)。
[0028]在第二方面，本發明提供了 L-賴氨酸制品(如，飼料添加劑)，其包括用脂肪包裹的顆粒，其中顆粒包含L-賴氨酸和耐高溫脫水的纖維素酶，優選耐高溫脫水的纖維素酶是本發明人令人意外地發現的菌株產生的纖維素酶。優選在本發明第二方面的制品是由本發明第一方面的方法發酵制備的。[0029]在第三方面，本發明提供了耐高溫脫水的纖維素酶或其編碼基因、其載體、菌種。具體而言，本發明:
在第I方面提供了耐高溫脫水的纖維素酶，其氨基酸序列:
(1)如SEQ ID No:2 所示;或
(2)是對SEQID No:2缺失、添加和/或取代一個或幾個(優選不超過7個，更優選不超過5個，如不超過3個)氨基酸殘基而獲得的保留SEQ ID No:2活性的序列。
[0030]在第II方面提供了編碼第I方面的纖維素酶的基因，優選其核苷酸序列如SEQ IDNo:1所示。
[0031]在第III方面提供了包含第II方面的基因的載體。
[0032]在第IV方面提供了菌種，尤其是分泌表達菌(如，酵母)，其包含第II方面的基因，或用第III方面的載體轉化或者轉染。
[0033]在第V方面提供了發酵生產纖維素酶的方法，其包括在發酵條件下培養第IV方面的菌種，從培養物中分離出第I方面的纖維素酶。
[0034]在第VI方面提供了第I方面的纖維素酶在制備飼料或飼料添加劑中的用途。
[0035]本發明具有以下有益效果:本發明的制品安全可靠，可有效降低動物體內賴氨酸的釋放速度，具有纖維素酶活性，可以進一步提高飼料的利用率；本發明的纖維素酶具有耐高溫脫水的優勢。
[0036]為了便于理解，以下將通過具體的實施例對本發明進行詳細地描述。需要特別指出的是，這些描述僅僅是示例性的描述，并不構成對本發明范圍的限制。依據本說明書的論述，本發明的許多變化、改變對所屬領域技術人員來說都是顯而易見的。
[0037]另外，本發明引用了公開文獻，這些文獻是為了更清楚地描述本發明，它們的全文內容均納入本文進行參考，就好像它們的全文已經在本文中重復而明確記載過一樣。
[0038]
【具體實施方式】
[0039]以下通過實施例進一步說明本發明的內容。如未特別指明，實施例中所用的技術手段為本領域技術人員所熟知的常規手段和市售的常用儀器、試劑，可參見《分子克隆實驗指南(第3版)》(科學出版社)、《微生物學實驗(第4版)》(高等教育出版社)以及相應儀器和試劑的廠商說明書等參考。
[0040]實施例1耐熱且耐失水的纖維素酶基因的表達構建體的制備
根據我們發現的菌株，委托中國科學院微生物研究所，進行序列分析，發現了新的纖維素酶基因，其核苷酸序列如序列表的SEQ ID No:l所示，所編碼的纖維素酶的氨基酸序列如SEQ ID No:2所示。然后，根據《分子克隆實驗指南》以及所用商品化試劑的操作指南構建分泌表達的酵母，簡而言之，即將編碼該纖維素酶的基因用正向引物如序列表的SEQ ID No:3所示(引入了 EcoR I內切酶位點)、反向引物如序列表的SEQ ID No:4所示(引入了 Not I內切酶位點)擴增后用EcoR I和Not I雙酶切，并與經這兩個內切酶酶切的pPIC3.5質粒(可購自Invitrogen公司)用T4 DNA連接酶進行連接，轉化入大腸桿菌DH5 α中。挑出陽性克隆，抽提出其中的質粒，經測序驗證正確后，將陽性質粒用Sal I酶切線性化后，通過電轉化法轉化入畢氏酵母GS115株，在含G418的平板上挑出陽性酵母轉化株，寄回。[0041]實施例2耐熱且耐失水的纖維素酶的發酵制備及活性測定
將實施例1獲得的陽性酵母轉化株接種到50ml BMGY液體培養基(IOOmM磷酸鉀緩沖液(pH6.0)，其中含1%酵母提取物、2%蛋白胨，酵母含氮堿基1.34%，生物素4*10_5%，葡萄糖2%，甘油1%)中，于30°C、200rpm培養至0D600達到5.0。
[0042]將上述培養物轉接到IL BMGY液體培養基中，于30°C、200rpm培養24小時，加入5ml甲醇,然后繼續于30°C、200rpm培養6天,期間每24小時補加5ml甲醇,通氣控制溶氧(DO)大于20%，并控制pH為6.0 (用氨水調節)。培養完成后，用0.22 μ m濾膜過濾并保留上清液，該上清液經SDS-PAGE檢測其中富含纖維素酶對應的蛋白質，由此發酵得到纖維素酶上清液。
[0043]取新鮮的上清液，分成三份，一份冷藏加鹽酸調節pH至4.8待用(A)，一份冷凍干燥至固體后用檸檬酸緩沖液(PH4.8)重新溶解(B)，一份于80°C烘箱中蒸發干燥至固體后用檸檬酸緩沖液(PH4.8)重新溶解(C);對照采用3萬U/g規格的市售纖維素酶(可購自湖北興銀河化工有限公司)，用檸檬酸緩沖液(PH4.8)溶解后分成三份，一份冷藏待用(CA)，另兩份分別冷凍干燥(CB)和80°C烘箱蒸發干燥(CC)，然后重溶于檸檬酸緩沖液(pH4.8)。分別測定這些纖維素酶活性，換算成原單位體積上清液或單位重量的酶活，計算由于高溫脫水造成的酶活損失率，結果如表I所示，表明相對于市售產品幾乎喪失了酶活的情況，本發明的纖維素酶耐高溫脫水，即便經過高溫脫水，仍舊能夠保留93%左右的活性，基本保留原酶活功能。
[0044]表I本發明和市售的纖維素酶的高溫脫水酶活損失率
【權利要求】
1.發酵制備L-賴氨酸制品的方法，包括，發酵產生L-賴氨酸發酵液，該發酵液與耐高溫脫水的纖維素酶混合，經高溫干燥后收集的顆粒用脂肪包被。
2.權利要求1所述的方法，其包括: (1)在發酵條件下培養導入了編碼吡啶核苷酸轉氫酶的多核苷酸的產L-賴氨酸的菌，獲得發酵液，過濾后保留濾液； (2)在發酵條件下培養導入了編碼耐高溫脫水的纖維素酶的多核苷酸的分泌表達菌，過濾后保留上清液； (3)混合步驟(I)獲得的濾液和步驟(2)獲得的上清液，得到混合液； (4)對步驟(3)獲得的混合液高溫噴霧干燥，并任選進行篩分和/或破碎，收集顆粒；和 (5)將步驟(4)收集的顆粒用脂肪包被。
3.權利要求1或2所述的方法，其中收集的顆粒和脂肪的重量比為2-8:8-2，優選為3-7:7-3，更優選為5-6.5:5-3.5 ;和/或，脂肪是分餾棕櫚脂肪，更優選是百佳能，最優選是百佳能HTL316 ;和/或，高溫為60-100°C，優選為65_90°C，更優選為75_85°C ;和/或，收集的顆粒的粒徑小于0.8mm,優選小于0.5mm。
4.權利要求2所述的方法，其中步驟(3)中，步驟(I)獲得的濾液和步驟(2)獲得的上清液的體積比為10:0.01-10，優選為10:0.1-5，更優選為10:0.5?2。
5.權利要求1或2所述的方法，其中耐高溫脫水的纖維素酶的氨基酸序列: (1)如SEQ ID No:2 所示;或 (2)是對SEQID No:2缺失、添加和/或取代一個或幾個(優選不超過7個，更優選不超過5個，如不超過3個)氨基酸殘基而獲得的保留SEQ ID No:2活性的序列。
6.權利要求2所述的方法，其中步驟(I)中，濾液中L-賴氨酸的含量高于50g/L，優選高于70g/L,更優選高于90g/L。
7.權利要求1或2所述的方法，其中制品是飼料添加劑。
8.制品，優選是飼料添加劑，其包括用脂肪包裹的顆粒，其中顆粒包含L-賴氨酸和耐高溫脫水的纖維素酶，優選其是由權利要求1-8之任一所述的方法制備的。
9.耐高溫脫水的纖維素酶，其氨基酸序列: (1)如SEQ ID No:2 所示;或 (2)是對SEQID No:2缺失、添加和/或取代一個或幾個(優選不超過7個，更優選不超過5個，如不超過3個)氨基酸殘基而獲得的保留SEQ ID No:2活性的序列。
10.本發明的第I1、II1、IV、V或VI方面。
【文檔編號】C12N9/42GK103444983SQ201310403722
【公開日】2013年12月18日 申請日期:2012年6月7日 優先權日:2012年6月7日
【發明者】馬吉銀, 陳崇安, 孟剛, 曹洪, 程耀東, 劉鑫 申請人:寧夏伊品生物科技股份有限公司