猴腎病毒40大t基因轉染構建染色體易位細胞模型及其細胞庫的制作方法
【專利摘要】本發明涉及用于醫學研究領域的猴腎病毒40大T基因轉染染色體易位細胞模型及其細胞庫的構建，其主要特征是按常規以T4DNA連接酶、BamHI、pcDNA3.1(-)DNA及SV40LTag DNA構建SV40LTag-pcDNA3.1(-)重組子、以感受態大腸桿菌純化重組子、以脂質體轉染法將其導入經膠原酶II消化的離體傳代或呈對數生長的染色體易位組織細胞，使重組子與細胞的DNA整合，并擴大培養經G418篩選含陽性重組子的細胞克隆，篩選細胞形態、生長曲線、染色體核型、軟瓊脂集落生長、裸鼠致瘤試驗、轉染細胞DNA中SV40大T基因檢測、mRNA表達產物測定及DNA序列測定結果符合永生化細胞特性并與原代細胞相同或相近者作為SV40LT介導染色體易位體外研究細胞模型凍存于液氮中，為在體外從細胞水平長期研究染色體易位的發病機制奠定基礎。
【專利說明】猴腎病毒40大T基因轉染構建染色體易位細胞模型及其細胞庫

【技術領域】
[0001]本發明涉及猴腎病毒40大T基因(SV40LT抗原基因或SV40LT)介導(轉染)染色體易位細胞模型及其細胞庫的構建，主要用于醫學細胞遺傳學研究領域，為染色體易位的研究提供細胞模型并保存其科研資源。

【背景技術】
[0002]染色體易位是染色體畸變的一種，一般指一條或數條染色體的一部份或整體轉移到另一條或數條染色體上，或指一條或數條染色體的一部份與另外一條或數條染色體的一部份發生互換。通常分為丟失遺傳物質的不平衡易位和不丟失遺傳物質的平衡易位。不平衡染色體易位的個體自身表現出相應的染色體病臨床癥狀，平衡染色體易位的個體自身表現為“正常”，但在生育子代時易發生流產、死胎、不育，或生育相應染色體病的子代。染色體病是目前無法治療的疾病，是先天性出生缺陷之一，一旦出生，就會給社會和家庭造成嚴重的心理負擔和精神痛苦，嚴重影響我國的人口質量。
[0003]近年來有國外文獻報道，染色體易位是因為在細胞分裂前負責檢驗DNA損傷的機制不能嚴密運作所致。一些癌癥的早期也會出現染色體易位現象。以往的研究證實，慢性骨髓性白血病、前列腺癌等發病都與染色體易位有關。為何細胞在沒有排除染色體易位的情況下仍然繼續分裂？有報道推測，可能是在細胞分裂前負責檢驗DNA損傷的機制出錯，導致質量不合格的染色體得以“蒙混過關”，結果造成了染色體易位。有學者利用這種檢驗機制對不能嚴密運作的人體細胞進行了實驗，向這些細胞中添加能切斷DNA的藥劑。實驗結果顯示，這些細胞在DNA未經修復的情況下依然繼續分裂。實驗還發現，即使是極微小的DNA損傷，都能引起染色體易位。研究結果還揭示了染色體發生易位與環境、遺傳等多方面因素有關。
[0004]但是，由于沒有可在體外長期培養的、可用于發病機制研究的永生細胞模型及其細胞庫，就難以從細胞水平在體外研究染色體易位細胞受物理、化學、生物、遺傳等影響的基因突變、基因表達、功能改變、生理特性、生物傳導等機制，從而嚴重限制了染色體易位的進一步研究。
[0005]國外文獻報道，猴腎病毒40 (SV40)可以使某些人類細胞發生永生化。Poul in DL,Kung AL和Sullivan CS等研究表明，SV40T抗原基因的導入能加快轉化細胞的生長速率，永生化細胞在體外多次傳代后，仍具有相對穩定的增殖特性和功能狀態，同時也能保留其原始細胞的許多分化表型，可以用于轉基因動物模型及人類和動物某些種類的細胞模型的建立，據此可以借助于研究轉基因永生化細胞及動物模型而在體外研究原始細胞的特性，從而研究其發病機制。
[0006]根據文獻報道，Reilly用猿猴病毒(SV40)大T抗原基因轉化來建立血管平滑肌細胞株，構建細胞模型以研究肝素對血管平滑肌的抑制作用機制。Su等利用經SV40轉化的角化上皮細胞株，構建細胞模型來分析上皮細胞內蛋白質合成的調控作用。Miquel等用SV40轉化的角化上皮細胞株，作為細胞模型研究層粘連蛋白5介導的細胞粘附作用。Webber等用經SV40轉化的前列腺上皮細胞株作為細胞模型來研究前列腺上皮細胞的生理功能和分泌功能。Racusen等用經Adl2_SV40轉化腎小管上皮細胞模型來研究近曲小管的損傷和疾病。Hougton等用SV40轉化建立骨髓基質細胞株作為細胞模型以研究在一定培養條件下，細胞具有向脂肪細胞和成骨細胞的雙向分化的潛能，進一步研究骨質疏松的機制。
[0007]因研究工作的需要，幾乎每種疾病都建立了各自的細胞模型。如糖尿病細胞模型、癌細胞細胞模型、轉基因細胞模型、絕經期綜合癥細胞模型、子宮內膜細胞模型、癲癇細胞模型、電子細胞模型、酒精性癡呆細胞模型、腦水腫細胞模型。等等。
[0008]但是，至今尚未見有關構建可用于在體外從細胞水平研究染色體易位與環境等關聯因素所致的發病機制的永生細胞模型及其細胞庫的文獻報道，也無法開展相關的研究項目。為了解決上述問題，本發明人提出了本發明。


【發明內容】

[0009]本發明的目的是要提供以SV40LT抗原基因介導染色體易位細胞模型及其細胞庫的構建方法，另一目的是為在體外從細胞水平研究染色體易位的發病機制提供SV40LT抗原基因介導染色體易位細胞模型及其細胞庫。
[0010]本發明的目的是這樣實現的:以T4DNA連接酶連接同時經BamHI酶切的pcDNA3.1 (-)DNA和PCR擴增、瓊脂糖凝膠電泳分離的SV40LTag DNA,構建SV40LTag-pcDNA3.1 (-)重組質粒，轉化DH5a大腸桿菌感受態細胞以擴增、純化并挑取耐氨芐青霉素的菌落抽提質粒，以脂質體轉染法導入經膠原酶II消化的離體傳代染色體易位懸液組織細胞或在含20%胎牛血清、5?1nmol / L胰島素的培養液中處于將進入或剛進入對數生長期、梭形細胞占90 %以上、匯合率達55 %?65 %的貼壁生長染色體易位細胞，使重組子與細胞的DNA整合，以G418篩選的含陽性重組子的細胞，作傳代、擴大培養，篩選細胞形態、細胞生長曲線、染色體核型、軟瓊脂集落生長試驗、裸鼠致瘤試驗、轉染細胞DNA中SV40大T基因檢測、mRNA表達產物測定及DNA序列測定結果符合永生化細胞特性并與原代細胞相同或相近者作為細胞模型凍存于液氮中，以此構建SV40LT抗原基因介導染色體易位細胞模型及其細胞庫。
[0011]本發明以PCR擴增、瓊脂糖凝膠電泳提純的SV40大T抗原基因經基因載體pcDNA3.1和脂質體轉染法導入染色體易位細胞而構建其細胞模型，其組織細胞用0.01%膠原酶II消化而不用常規的胰蛋白酶消化，以僅使引起細胞粘連的膠原被消化或使細胞懸浮，減少了細胞壁的蛋白質被消化而傷及細胞，使細胞培養的成功率由一般的約85%提高到95%以上；選用了含20mL / L胎牛血清、5?1nmol / L胰島素的特定培養基，使細胞不會生長過快而影響SV40大T抗原基因的整合，也不會因缺少營養或細胞生長刺激因子而使細胞在未達到要求的匯合率、未進入對數生長期前就過早死亡，或對數生長期縮短；制備的細胞系在_196°C液氮中凍存I個月后復蘇培養，均能生長出貼壁細胞；在作細胞系染色體鑒定時，秋水仙素的用量及作用時間是常規的5?10倍，使染色體分裂相增加，足以計數和分析；由此建成的染色體易位細胞模型及其細胞庫，為從細胞水平在體外研究染色體易位與環境等關聯因素所致的發病機制奠定基礎。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0012]圖1是本發明制備的唐氏綜合癥細胞模型(貼壁生長)圖。
[0013]如圖1，細胞傳代至第75代、培養至第9天時，呈對數生長、圓形、梭形、鋪滿瓶底，其細胞生長匯合率達95%以上，此后隨著傳代次數的增加，細胞生長變慢、變疏。

【具體實施方式】
[0014]1、SV40大T抗原DNA的提取:①SV40DNA酶切:從市售購買含有大T抗原基因的SV40冰凍干粉或SV40質粒，溶解于適量的H2O或TE緩沖液中，加2uL10X酶切緩沖液和18uL H20，加限制性內切酶BamH I (1-5U / ugDNA)，37°C溫育lh，75°C加熱15min，滅活酶，力口入5uL電泳加樣緩沖液(也可通過加入0.5mol / L EDTA)終止反應以備電泳。②SV40DNA電泳:取電泳級瓊脂糖以電泳緩沖液配成10%瓊脂糖凝膠，倒入已封好的凝膠灌制平臺上，插上樣品梳，待膠凝固后從制膠平臺上除去封帶，拔出梳子，放入加有足夠電泳緩沖液的電泳槽中，緩沖液高出凝膠表面約1mm，用適量的1X加樣緩沖液制備DNA樣品，然后用移液器將樣品加入樣品孔中，并同時做合適的DNA分子量標準對照物，接通電極，使DNA向陽極移動，在1-10V / cm凝膠的電壓下電泳至足夠分離DNA片段的距離時，關閉電源。③從瓊脂糖中分離約2600bp SV40大T抗原DNA:在300-360nm長波紫外光源下(使用長波紫外光源以防止DNA損傷)將含目標DNA片段的凝膠條帶切下裝入透析袋中，向透析袋內加入2ml電泳緩沖液，使之浸沒凝膠，并排空汽泡，將透析袋水平放入電泳槽(長度方向與電泳平行)，加入適量緩沖液將透析袋浸沒(約6-7_)，接通電源，150伏電洗，在紫外燈下觀察待DNA全部移出凝膠，改變電場方向繼續通電I分鐘，從透析袋中吸出緩沖液于l_5mlEppendorf管中，加入1.5倍體積正丁醇,混勻抽提去EB,在臺式離心機上最高速2分鐘,吸去上層正丁醇溶液，如此重復二次，自下層言DNA的溶液中加入等體積酚氯仿(2個)抽提2次，上清轉入另一 Eppendorf管中加入I / 10倍體積3M NaAc、2倍體積預冷無水乙醇,于20°C過夜，12000g，4°C下離心10分鐘，得DNA沉淀，棄上清，加入70%乙醇洗滌2次后棄干乙醇，加入50 μ I TE溶解DNA。此外，還可用低熔點瓊脂糖凝膠法、DNA濾膜插片法等將目的DNA片段從凝膠中分離、純化出來。
[0015]2、SV40大T抗原DNA與pcDNA3.1基因載體的連接:取9 μ I上述DNA成份(0.1-5 μ g)、10 μ 12X 連接緩沖液、I μ IlOmmol / L ATP、T4DNA 連接酶(20 ?500 粘性末端單位)或大腸桿菌DNA連接酶、pcDNA3.1空載體混合，15°C溫育24h，構建成SV40T /pcDNA3.1重組子。
[0016]3、SV40T / pcDNA3.1重組子的擴增、分離與鑒定:①大腸桿菌感受態的制備:其基本方法是用冰預冷的CaCl2或多種2價陽離子等處理細菌，使之進入感受態得以轉化，用CaCl2制備新鮮或冷凍的大腸桿菌感受態細胞，常用于成批制備感受態細菌，本法適用于大多數大腸桿菌菌株，操作過程簡述如下:從37°C培養16?20h的新鮮平板中挑取一個單菌落(如大腸桿菌DH52)，或Iml新鮮的16?20h過夜培養物，轉到一個含有10mlLB培養基的IL或500ml燒瓶中，于37°C劇烈振搖培養約2?3h (旋轉搖床200?300r / min)，每隔20?30min測量0D600值?0.4，在無菌條件下將細菌轉移到一個，用冰預冷的50ml聚丙烯離心管中，在冰上放置10?20min，于4°C用SorvallGS2轉頭(或與其離心管相配的轉頭)以4000r / min離心lOmin，以回收細胞，倒數培養液，將管倒置Imin以使最后殘留的痕量培養液流盡，以1ml用冰預冷的0.1mMCaCl2重懸每份沉淀，放于冰上，于4°C用SorvallGS3轉頭(或與其相應的轉頭)以4000r / min離心lOmin，以回收細胞，倒出培養液，將管倒置Imin以使最后殘留的痕量培養液流盡，每50ml初始培養物用2ml冰預冷的0.1M CaCl2重懸每份沉定，此時，可以迅速將細胞分裝成小份，液氮中冰凍，-70°C貯存備用，用冷卻的無菌吸頭從每種感受態細胞懸液中各取200μ I轉移到無菌的微量離心管中，在每管中加DNA或連接反應混合物(體積彡10 μ 1，DNA < 50ng)，輕輕旋轉以混勻內容物，在冰中放置30min，將離心管放到預加溫到40°C的循環水浴中的試管架上，放置90s?2min，不要搖動試管，快速將管轉移到冰浴中，使細胞冷卻I?2min，每離心管加800 μ ISOC培養基，用水浴將培養基加溫到37°C，然后將管轉移到37°C搖床上，溫育45min使細菌復蘇，并且表達質粒編碼的抗生素抗性標記基因，將適當體積(每個90mm平板可達200μ I)已轉化的感受態細胞轉移到含200mmol / LMgS04和相應抗生素的SOB培養基上，將平板置于室溫至液體被吸收，倒置平皿，于37°C培養，12?16h后可出現菌落。②重組子的篩選、擴增與提取:用無菌牙簽或滅菌接種針挑選單個菌落接種于5mL無菌的LB培養基或豐富培養基(如超級肉湯或TB超級肉湯培養基)中，培養過夜后，再加入到500mL含LB培養基(含有適當抗生素)的2L燒瓶中，再于37°C培養至飽和狀態(0D_?4，為提高產量，應采用表面積較大及帶折流板的燒瓶以盡量增大通氣度，振搖速度應大于400r / min),于4°C,6000g離心lOmin,用4mL GTL溶液重懸沉淀，并轉移到一個容積彡20mL的高速離心管中(細菌沉淀可以在_20°C或-70°C無限期保存)，加入ImL新配的含25mg / mL溶菌酶的GTE溶液，重懸沉淀，于室溫放置lOmin，加入1mL新配NaOH / SDS溶液，并且輕輕混勻直至液體變得均一、清亮而粘稠，于冰上放置10min，WA 7.5mL乙酸溶液，用吸管輕輕攪拌直至粘稠度下降并形成大的沉淀，于冰上放置lOmin，于4°C，20000g離心lOmin，將上清輕輕倒入至另一個干凈的離心管中，如果有可見的飄浮物可用數層紗布過濾，加入0.6倍體積的異丙醇，顛倒混勻，室溫放置5?1min,于室溫，1500g離心1min,加入2mL70%乙醇輕輕洗漆沉淀,然后短暫快速離心，吸去乙醇，并真空干燥(沉淀可在4°C長期保存)。③重組子的鑒定:上述從感受態大腸桿菌中提取的DNA(含重組子SV40T / pcDNA3.1)，同上法用限制性內切酶BamH I進行酶切，10g/L瓊脂糖凝膠電泳鑒定，獲得大小約2600bp及5600bp的2條帶，前者符合GenBank中SV40T片段的大小。
[0017]4、SV40T / pcDNA3.1重組子導入染色體易位細胞及其陽性克隆的篩選與擴增:①染色體易位細胞的收集與培養:以無菌操作提取在作其他實驗或其他檢查后多余、廢棄的染色體易位細胞(來自患兒羊水脫落細胞)，以細胞終濃度約為IX 15 / mL備用，取上述呈單個分散的細胞或經處理后成為單個分散的細胞接種于含5?1nmol / L胰島素、20%胎牛血清的RPMI1640液中或接種于含20%胎牛血清、5?1nmol / L胰島素的低糖DMEM細胞培養基中，置于37°C，體積分數5% C02培養箱內，細胞貼壁培養約3?4天、細胞形態為梭形、小園形細胞不到10 %、貼壁細胞的匯合率達75 %?85 %、處于剛進入對數生長期時，即考慮收集培養細胞，先吸干凈培養瓶中的培養液，加入l_2ml0.01%的膠原酶II液(以消化液能覆蓋整個瓶底為準)，靜置2-10min (顯微鏡下動態監測)，吸去膠原酶II液，加入低糖DMEM或RPMI1640培養液，用吸管吸取瓶內培養液，反復吹打瓶壁細胞，形成細胞懸液，轉入離心管離心沉淀，去上清液，細胞沉淀用上述培養液清洗2次后，制成懸液，用作重組子導入。②SV40T / pcDNA3.1的導入:方法1:在上法分離所得細胞中，選用脂質體轉染法，將上述2 X 15個細胞接種于35mm培養皿中，在37°C CO2培養箱培養24?36h，使細胞生成單層、細胞形態為梭形、尚未見或僅見少于10%小園形細胞、貼壁細胞的匯合率達55%?65%、處于將進入或剛進入對數生長期時，即應該考慮轉染重組子SV40T / pcDNA3.1，即在1.5ml微量離心管中制備下列溶液:管A，將SV40T / pcDNA3.1溶于100 μ I無血清培養液中；管B,將20 μ I Lipofectamine溶于80 μ I無血清培養液中，將管A和管B混勻，室溫下置45min，吸去細胞培養液后，用無血清培養液洗滌細胞2次，在LipOfectamine-SV40T /pcDNA3.1混合物中加入Iml無血清培養液，輕輕混勻，再滴加至細胞培養皿內，然后加入Iml無血清培養液，在CO2培養箱培養10h，吸出轉染液，加4ml完全培養液繼續培養16h，棄去培養液，更換濃度為400mg° Γ1的G418培養液繼續培養，8?10天后選擇單個細胞集落進行亞克隆，擴大培養后再加大G418濃度到800mg° L_\將能在高濃度的G418環境中穩定生長的克隆進行傳代擴增，另外染色體易位細胞與SV40或EB病毒共同培養后，感染了病毒DNA并發生整合的染色體易位細胞進行傳代擴增。方法2:吸取I / 10-1 / 40細胞懸液，配制成終濃度為IXlO5 / mL細胞懸液，接種于培養瓶內，選擇低糖DMEM或RPMI1640培養基，其中含20mL/L胎牛血清、1nmol / L胰島素，培養48h后，使細胞生成單層、細胞形態為梭形、尚未見或僅見少于10%小園形細胞、貼壁細胞匯合率達55%?65%、處于將進入或剛進入對數生長期時，采用脂質體轉染的方法，將重組子SV40T / pcDNA3.1轉染至染色體易位細胞內，或將SV40直接感染至染色體易位細胞內，用含700mg / L G418的培養液篩選lwk，將G418濃度改為300mg / L，至出現陽性克隆，將其轉移至新培養瓶進行擴大、傳代培養；方法3:將上述的細胞懸液以低糖DMEM或RPMI1640培養液配成5X108 / L終濃度的細胞懸液接種于24孔培養板，待細胞長至90 %左右融合時用于轉染，將0.2 μ g含量的重組子SV40T / pcDNA3.1，用DMEM或RPMI1640調整體積為50 μ I，室溫放置5min ;脂質體6 μ I，用DMEM調整體積為50 μ 1，室溫放置5min，兩種試劑輕輕混勻，室溫放置20min，同時將24孔板內的細胞用DMEM洗3次后，再在每孔加培養液100 μ 1，加脂質體-SV40T / pcDNA3.1混合液，輕輕在細胞表面鋪均勻，于37°C C02培養箱放置6h，隨后用0.0lg / L膠原酶將細胞消化，轉入6孔板內，加入完全培養基，次日加G418抗生素使終濃度為500mg / L，直到有單克隆細胞長出。約1d后有單克隆細胞集落長出，挑出置于24孔板內繼續培養，以300mg /L的G418維持并穩定傳代擴增培養。以此構建染色體易位細胞模型。
[0018]5、染色體易位細胞模型的傳代、擴增:收集上述經脂質體轉染法導入SV40大T抗原基因的陽性單克隆細胞集落，以低糖DMEM或RPMI1640培養基配成約IXlO5 / mL的細胞懸液，接種于數瓶20?50cm2培養瓶中，加入5mL含20mL/L胎牛血清、1nmol / L胰島素的低糖DMEM或RPMI1640培養基，至細胞貼壁生長、匯合率達80?85%、處于對數生長期的前期時收集細胞，再按上述步驟傳代培養，如此反復傳代接種、培養，記錄代數并觀察細胞生長特點。如圖1，細胞傳代至第75代、培養至第9天時，呈對數生長、圓形、梭形、鋪滿瓶底，其細胞生長匯合率達95%以上，此后隨著傳代次數的增加，細胞生長變慢、變稀疏。其中對數生長是指細胞生長速度快，細胞數量的增加與培養時間呈倍增關系，通常按常規按種細胞進行培養時，培養I?2天便可在顯微鏡下找到生長的單個細胞；4?5天時可見細胞集落，貼壁生長細胞鋪蓋培養瓶底的I / 3，培養7?13天時可見貼壁生長細胞鋪蓋培養瓶底的2 / 3以上，甚至細胞重疊、幾乎不留空隙(匯合率達95?100% )，細胞光亮，無顆粒、無粗糙感等老化現象，也可據細胞計數與培養時間的關系來判斷；死亡的細胞少，每周因死亡而漂浮的細胞少于10% [通過臺盼藍染色法鑒別死細胞和活細胞，因為正常的活細胞，胞膜結構完整，能夠排斥，使臺盼藍不能夠進入胞內；而喪失活性的細胞，胞膜的通透性增加，可被臺盼藍染成藍色，可判斷為細胞已經死亡，方法是每周吸取一定量的細胞培養懸液，與臺盼藍染色劑混合后置室溫5?10分鐘，然后制成細胞薄片，在顯微鏡下計數1000個細胞總數，計算著色的死細胞和不著色的活細胞的百分比]。
[0019]6、染色體易位細胞模型生物學特性的鑒定:使用SV40建立細胞模型后，鑒定的關鍵問題有:一是要求該細胞具有持續的增殖能力，即T抗原在細胞系中穩定表達；二是要求其形態、基本生理功能等表型保持不變。①觀察細胞形態:在倒置光學顯微鏡下每日觀察細胞是否呈典型的上皮細胞樣貼壁生長，是否呈梭形、或小園形生長；②觀察細胞生長曲線:取生長較好的轉染細胞，采用0.25胰蛋白酶液消化，制成細胞懸液，經計數，分別取1.4X 14細胞接種于30個含15FBS低糖DMEM培養基培養瓶。每天取2瓶細胞進行計數，計算均值，連續觀察直至細胞數量明顯下降，培養3天后每隔2天給未計數的細胞換液，采用同樣方法觀察轉染細胞在h印ato ZYME-SFM無血清培養基中的生長情況。結果以培養時間為橫軸，細胞數量為縱軸(對數)，描繪在半對數座標上制成曲線后即成該細胞的生長曲線，永生化細胞系呈典型的“S”特征或“穹隆”形成；③檢查染色體:通過分析染色體核型，如果染色體核型為二倍體“46，XX”或“46，XY”，或相同于本發明采集的原代染色體易位細胞，則說明該細胞系沒有發生惡性轉化(同時可用流式細胞儀分析細胞系中是否出現異常的DNA群體，如果沒有，也說明細胞系未出現瘤性特征)。染色體核型分析方法是:在細胞生長密度達85-95% (其中小園形細胞占10% )、處于對數生長期的培養物中按5mL培養液中加入預熱的250ug / ml秋水仙素lOOul，混勻后置37°C培養箱4小時，吸干培養液，加入預熱的2-3mL EDTA-胰酶消化液，37°C作用5分鐘，終止消化，洗下貼壁細胞，經離心、低滲、固定、制片、G顯帶后分析染色體核型軟瓊脂集落生長試驗:將SV40T轉染后永生化的細胞以5X104 / ml接種于直徑為35mm軟瓊脂平皿內，觀察三周后，未發現克隆形成，說明本實驗的SV40T永生化染色體異常羊水細胞不能在軟瓊脂內形成克隆，符合永生化特點裸鼠致瘤試驗:將SV40T永生化的細胞以3X 17接種裸鼠背部皮下，2個月后，4只裸鼠均未見腫瘤形成，證明此細胞為非惡化細胞；⑥轉染細胞DNA中SV40大T基因檢測:如以免疫組織化學檢測，SV40轉染的細胞核內染色可見大量棕色顆粒，表明SV40T抗原已整合入細胞內；也可用RT-PCR法檢測T抗原在細胞中的表達，其中T抗原的引物:上游引物(A4239)5，-GTT ATG ATT ATA ACT GTTATG-3’，下游引物(S4496)5，-GAA ATG CCATCT AGT GAT-3，;擴增產物長度為 268bp，擴增條件為 94°C，5min，即:(94°C，lmin ;55°C，lmin, -0.5°C / 循環；72°C, lmin) X 30、(94°C，30S ；40°C，30S, 72°C，30S) X 15，擴增體系為50 μ I:[Mg2+]2mmol / L、dNTPs200ymol / L、引物濃度 0.4 μ mo I / L、TaqlU、模板 5 μ I ;實驗組以第19代細胞的cDNA為模板(參照市售cDNA第一鏈合成試劑盒進行cDNA第一鏈合成，產物_20°C保存)；陰性對照設兩個，分別以無菌水、原代細胞的cDNA做模板，陽性對照以SV40DNA為模板(參照SDS-蛋白酶K法提取SV40DNA，因為SV40病毒無包膜，不使用SDS破膜，取5 μ I進行1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，其余_20°C保存備用)?’⑦mRNA表達產物測定:T抗原mRNA RT-PCR產物測序:取100 μ I體系的擴增產物，用凝膠回收試劑盒(Takara,日本)回收產物，取2 μ I DNA溶液稀釋100倍，測濃度，余下的DNA及上、下游引物各10 μ I進行測序。④流式細胞術檢測:檢測第19代細胞系中合成、分裂的細胞比例，如果其增殖能力明顯比未建系的正常細胞增強，說明是SV40大T抗原整合、表達的結果；⑧DNA序列測定:按常規測序儀檢測，顯示SV40大T抗原DNA序列。
[0020]所以，本發明的細胞模型為①細胞在倒置光學顯微鏡下呈梭形或小園形的上皮細胞樣貼壁生長；②細胞的生長曲線如以培養時間為橫軸，細胞數量為縱軸，在hepatoZYME-SFM無血清培養基中呈“S”特征或“穹隆”形成；@染色體核型為46，XX (XY)，并存在染色體平衡易位；或相同于本發明采集的原代染色體平衡易位細胞細胞不能在軟瓊脂內生長(形成克隆)；⑤細胞為非惡化細胞，裸鼠致瘤試驗陰性細胞的DNA中整合了 SV40T抗原基因，表達SV40T抗原mRNA產物；?細胞傳代至第75代、培養至第9天時，呈對數生長、圓形、梭形、鋪滿瓶底，其細胞生長匯合率達95%以上，此后隨著傳代次數的增加，細胞生長變慢、變稀疏。
[0021]7、SV40LT抗原基因介導染色體易位細胞模型及其細胞庫:篩選并繼續傳代、擴大培養經上述鑒定后符合永生化細胞特性并與原代細胞相同或相近的細胞，取生長狀態良好、處于對數生長期的不同世代的貼壁細胞，經過消化、終止和離心分離(1200r / min,6min)，用含二甲亞砜的凍存液0.5?Iml重懸細胞，細胞密度為5X 15個/ ml，加入凍存管，經4°C，0.5h ；-20°C,2h ;-70°C，過夜，入_196°C液氮凍存，以此法構建生物學特性穩定的永生化染色體易位細胞模型及其細胞庫，以集中保存遺傳資源，為其他研究提供科研材料，又可直接作為染色體易位發病機制體外研究的細胞模型，以加速拓展染色體易位研究的新途徑，從細胞水平在體外研究染色體易位細胞受物理、化學、生物、遺傳等影響的基因突變、基因表達、功能改變、生理特性、生物傳導等機制。
[0022]8、細胞模型應用
[0023]細胞模型作為科研細胞:使染色體易位細胞模型處于人為制造的具有不同含量或濃度的有害物如物理(如X射線)、化學(如甲醛、汽油、鉛、汞)、生物(如風疹病毒，巨細胞病毒，皰疹病毒)的條件下培養，然后取體外長期傳代的不同周期的活細胞、傳代過程的凋亡細胞、含有傳代培養中所產生的代謝產物的培養液從不同角度和水平，研究染色體易位細胞模型、正常對照細胞模型對有害物的耐受性的差異、有害物致染色體易位出生缺陷的機制。例如應用常規方法如基因芯片、miRNA芯片、比較基因組雜交芯片(CGH)、差異甲基化雜交芯片(DMH)和SNPs等篩選差異的基因及其多態性、甲基化水平；運用原位雜交(FISH)、Northern blot、Real-time PCR、CHIP、EMSA等技術檢測基因所在研究細胞模型中的基因轉率表達、定位及調控；利用酶反應學、代謝組學技術鑒定細胞模型長期傳代中蛋白質代謝過程和關鍵的代謝產物；應用雙向電泳、MALD1-T0F質譜鑒定、酵母雙雜交和免疫共沉淀等技術研究細胞模型在長期傳代中的蛋白質功能及蛋白質間的相互作用，從活細胞培養過程動態、長期研究環境有害因素致出生缺陷的機制，例如:①環境中常見的毒性物質苯并芘致染色體易位出生缺陷的研究:使細胞模型和對照細胞分別在含有0.1,1.0,5.0、10.0,20.0pmol / L苯并芘的培養液中培養，對比檢測兩者在培養2周、4周、6周、8周、16周等不同培養時間的可作為細胞毒性指標的細胞凋亡、壞死、雙核細胞率和可作為遺傳毒性指標的微核率、核質橋率、核芽率，即在光學顯微鏡下計數10000個雙核細胞中的微核數、核質橋數和核芽數；500個活細胞中的凋亡和壞死細胞數、雙核細胞數，以及檢測細胞存活率，即應用四甲基偶氮唑鹽比色法(MTT法)，在吸去原培養液后，在96孔板上加入20%的5mg / mlMTT的無血清培養液，繼續培養4h，小心吸棄孔內上清液，每孔加入150 μ L 二甲亞砜，振蕩lOmin，使紫色結晶物充分溶解，本酶標儀以490nm測定各孔的吸光度值，計算出細胞存活率。還可以其他常規實驗方法檢測不同培養時間的含毒性物與不含毒性物、染色體易位細胞與正常細胞中各組細胞的基因突變、蛋白質組學、細胞分泌功能、染色體畸變、細胞存活率(壽命)等，以從活細胞培養過程中從細胞水平動態、長期研究環境有害因素致染色體易位出生缺陷的機制。②以某種病源微生物替換毒性物質苯并芘做同樣的研究，即可從活細胞培養過程中從細胞水平動態、長期研究生物因素致染色體易位出生缺陷的機制。③將配成濃度梯度的治療藥物與配成濃度梯度的病源微生物或毒性化學物質以及細胞模型共同培養，檢測細胞培養過程壽命、基因突變、各種分子變化等，即可從活細胞培養過程中從細胞水平動態、長期研究藥物對染色體易位出生缺陷的治療效果及干預效果。④同樣可用染色體易位細胞模型研究基因治療的方法，替代某些以人體直接做試驗。⑤以細胞模型的形式保存染色體易位遺傳資源。
【權利要求】
1.一種用于醫學研究領域的猴腎病毒40大T基因轉染染色體易位細胞模型及其細胞庫的構建，其主要特征是按常規以T4DNA連接酶、BamH1、pcDNA3.1 (-)DNA及SV40LTag DNA構建SV40LTag-pcDNA3.1 (-)重組子、以感受態大腸桿菌純化重組子、以脂質體轉染法將其導入經膠原酶II消化的離體傳代或呈對數生長的染色體易位組織細胞，使重組子與細胞的DNA整合，并擴大培養經G418篩選含陽性重組子的細胞克隆，篩選細胞形態、生長曲線、染色體核型、軟瓊脂集落生長、裸鼠致瘤試驗、轉染細胞DNA中SV40大T基因檢測、mRNA表達產物測定及DNA序列測定結果符合永生化細胞特性并與原代細胞相同或相近者作為SV40LT抗原基因介導染色體易位體外研究細胞模型凍存于液氮中，為在體外從細胞水平(替代人體或動物直接試驗)長期研究染色體易位的發病機制奠定基礎。猴腎病毒40大T基因轉染構建染色體易位細胞模型及其細胞庫。
2.根據權利要求1所述的猴腎病毒40大T基因轉染染色體易位細胞模型及其細胞庫的構建，其特征是所指細胞模型(I)細胞在倒置光學顯微鏡下呈梭形或小園形的上皮細胞樣貼壁生長；(2)細胞的生長曲線如以培養時間為橫軸，細胞數量為縱軸，在hepatoZYME-SFM無血清培養基中呈“S”特征或“穹隆”形成；(3)染色體核型為平衡易位的二倍體；(4)細胞不能在軟瓊脂內生長(不形成克隆)；(5)細胞為非惡化細胞，裸鼠致瘤試驗陰性；(6)細胞的DNA中整合了 SV40LT基因，表達SV40LTmRNA產物；(7)細胞傳代至第75代、培養至第9天，仍呈對數生長、圓形、梭形；(8)作為細胞模型用于在體外從細胞水平研究環境因素所致染色體易位的發病機制、對環境有害物的耐受性、遺傳資源貯存。
3.根據權利要求1所述的猴腎病毒40大T基因轉染染色體易位細胞模型及其細胞庫的構建，其特征是取自因其他實驗所需而采集的、并在其他實驗后多余、廢棄的染色體易位組織細胞構建之。
4.根據權利要求1所述的猴腎病毒40大T基因轉染染色體易位細胞模型及其細胞庫的構建，其特征是所用的培養液為含有20%胎牛血清、5?1nmol / L胰島素的RPMI1640或含有20mL / L胎牛血清、5?1nmol / L胰島素的低糖DMEM培養液。
5.根據權利要求1所述的猴腎病毒40大T基因轉染染色體易位細胞模型及其細胞庫的構建，其特征是用作傳代培養以備脂質體轉染法導入重組子的染色體易位組織細胞，在原代擴增培養中，其收集指標是細胞貼壁培養約3?4天、細胞形態為梭形、小園形細胞不到10%、貼壁細胞的匯合率達75%?85%、處于剛進入對數生長期時收集細胞；用作脂質體轉染法導入重組子的傳代染色體易位組織細胞，其時機選擇的指標是細胞形態為梭形、尚未見或僅見少于10%小園形細胞、貼壁細胞的匯合率達55%?65%、處于將進入或剛進入對數生長期時的培養細胞；傳代細胞系收集的指標是選擇細胞貼壁生長的匯合率達80?85%、處于對數生長期的前期時收集細胞；染色體核型分析的細胞收集指標是細胞生長密度達85-95 %、小園形細胞占10 %以上、處于對數生長期的細胞。
6.根據權利要求1所述的猴腎病毒40大T基因轉染染色體易位細胞模型及其細胞庫的構建，其特征是以0.01%膠原酶II消化貼壁生長的染色體易位組織細胞，作染色體核型分析時，每5mL培養液中加入250ug / ml秋水仙素lOOul，混勻后置37°C培養箱4小時。
7.根據權利要求1所述的猴腎病毒40大T基因轉染染色體易位細胞模型及其細胞庫的構建，其特征是細胞庫的構建包括(I)篩選經鑒定后符合永生化細胞特性并與原代細胞相同或相近的SV40LT介導的染色體易位細胞；(2)作傳代、擴大培養，取生長狀態良好、處于對數生長期的不同世代的貼壁細胞；(3)經消化、終止、離心(1200r / min,6min)步驟收獲細胞；(4)用含二甲亞砜的凍存液配制密度為5父105個/ ml的細胞懸液；(5)按照4°C，.0.5h:-20°C,2h ;-70°C，過夜；入-196°C液氮的程序凍存細胞；(6)可再生性地長期保存SV40LT介導染色體易位細胞模型，備作遺傳資源和科研材料。
【文檔編號】C12N15/85GK104419666SQ201310403921
【公開日】2015年3月18日 申請日期:2013年9月1日 優先權日:2013年9月1日
【發明者】翁炳煥, 黃荷鳳, 徐晨明, 李曉, 趙永富, 金昱 申請人:翁炳煥