一種提高百合多糖活性的酶法修飾制備方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種提高百合多糖活性的生物修飾制備方法，屬于農(nóng)產(chǎn)品功能成分制備【技術(shù)領(lǐng)域】。采用復(fù)合酶(β-甘露聚糖酶和β-葡聚糖酶)法對(duì)百合多糖(403.3kDa)進(jìn)行生物修飾(即酶法可控降解)。修飾后經(jīng)分離純化，產(chǎn)物百合多糖的分子量為8.0kDa～70.0kDa。采用體外巨噬細(xì)胞RAW264.7模型研究百合多糖及其修飾產(chǎn)物體外免疫調(diào)節(jié)活性。修飾后的百合多糖活性顯著提高，與底物相比，對(duì)巨噬細(xì)胞增殖活性增加40.5～77.2％。百合多糖的分子量過高或過低，其活性都較低。本發(fā)明創(chuàng)立了提高百合多糖免疫活性的方法，生物修飾后的百合多糖在醫(yī)藥和功能食品領(lǐng)域更具應(yīng)用價(jià)值。
【專利說明】一種提高百合多糖活性的酶法修飾制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于農(nóng)產(chǎn)品功能成分制備【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及一種提高百合多糖活性的生物修飾制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]百合是國家衛(wèi)生部審批通過的首批藥食兩用品之一，不僅在臨床上有著廣泛的應(yīng)用，而且還具有很好的保健作用，百合多糖是百合的主要功能因子之一。研究表明百合多糖具有增強(qiáng)免疫，抗腫瘤等生物活性。通過超聲波輔助熱水浸提法，我們從百合中提取一種百合多糖，分子量為403.3kDa，主要由甘露糖、葡萄糖按1:1的摩爾比通過β _1，4糖苷鍵組成(含有少量I —2或1 — 6鍵型)，還含有微量的阿拉伯糖和少量硫酸基團(tuán)。采用體外巨噬細(xì)胞RAW264.7模型研究百合多糖免疫調(diào)節(jié)活性，發(fā)現(xiàn)該百合多糖活性較低，主要原因可能是其分子量過大，粘度較高所致。因此，通過對(duì)百合多糖化合物結(jié)構(gòu)進(jìn)行改造，降低分子量，尋找活性更強(qiáng)的百合多糖修飾產(chǎn)物的研究具有重要意義。
[0003]對(duì)于化合物的分子修飾，可采用物理、化學(xué)或生物(酶法)。相對(duì)于物理或化學(xué)方法，采用酶法對(duì)百合多糖進(jìn)行降解具有專一性強(qiáng)，反應(yīng)可控，產(chǎn)物分子量分散度小等優(yōu)點(diǎn)。β -甘露聚糖酶是一種半纖維素水解酶，以內(nèi)切方式降解β -1，4糖苷鍵，降解產(chǎn)物的非還原末端為甘露糖，其作用底物包括葡萄甘露聚糖、半乳甘露聚糖及甘露聚糖。葡聚糖酶能專一性作用于葡聚糖的β_1，4和β_1，3糖苷鍵產(chǎn)生低聚糖。但是，我們前期的實(shí)驗(yàn)表明兩種酶單獨(dú)作用于百合多糖時(shí)效率較低。因?yàn)閮煞N酶有著相似的最適作用溫度和ΡΗ，因此我們將兩種酶以一定的用量比復(fù)合應(yīng)用于百合多糖的降解，獲得較好的作用效果O
[0004]本發(fā)明采用復(fù)合酶(β_甘露聚糖酶和β_葡聚糖酶)法對(duì)百合多糖進(jìn)行可控降解修飾，通過反應(yīng)條件控制，以期獲得系列高活性的百合多糖修飾產(chǎn)物。
【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]技術(shù)問題
[0006]本發(fā)明的目的在于針對(duì)百合多糖活性低的問題，提供一種提高百合多糖活性的生物修飾制備方法。
[0007]技術(shù)方案
[0008]本發(fā)明的目的可通過如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn):
[0009]采用復(fù)合酶(β -甘露聚糖酶和β -葡聚糖酶)法對(duì)百合多糖(403.3kDa)進(jìn)行生物修飾，酶作用條件為:底物百合多糖濃度30?40g/L ； β -甘露聚糖酶濃度500?900U/L, β-葡聚糖酶250?450U/L ；ρΗ5.5?6.5 (PBS緩沖液);溫度40?55°C ;時(shí)間0.5?
1.0h。
[0010]反應(yīng)結(jié)束后去除酶及產(chǎn)物分離制備方法為:反應(yīng)結(jié)束后，將溶液加熱至100°C，保溫5min,而后離心(6000rpm)去除酶蛋白，將上清液放入透析袋(截留分子量為5.0kDa)內(nèi)透析(4°C，12h)，透析結(jié)束后將樣品離心(5000rpm)，取上清液冷凍干燥，即可獲得白色粉末狀百合多糖修飾產(chǎn)物，百合多糖修飾產(chǎn)物的分子量是8.0kDa?70.0kDa0
[0011]采用體外巨噬細(xì)胞RAW264.7模型研究百合多糖及修飾產(chǎn)物體外免疫調(diào)節(jié)活性，修飾后的百合多糖活性顯著提高，與底物相比，對(duì)巨噬細(xì)胞增殖活性增加40.5?77.2%。
[0012]本發(fā)明技術(shù)與產(chǎn)品具有如下的有益效果:采用酶法對(duì)百合多糖進(jìn)行降解修飾具有專一性強(qiáng)，反應(yīng)可控，產(chǎn)物分子量分散度小等優(yōu)點(diǎn)；通過可控降解修飾，修飾產(chǎn)物的免疫活性明顯提高，生物修飾后的百合多糖可廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥和功能食品領(lǐng)域。
【具體實(shí)施方式】
[0013]研究中所用的酶活力及生產(chǎn)公司如下甘露聚糖酶(10000U/g)，禾本生物工程有限公司；β-葡聚糖酶(50000U/g)，上海工碩生物技術(shù)有限公司。
[0014]實(shí)施例1
[0015]按下列條件及操作利用復(fù)合酶對(duì)百合多糖進(jìn)行修飾:底物百合多糖濃度30/L ；β-甘露聚糖酶濃度500U/L，β-葡聚糖酶250U/L;pH5.5(PBS緩沖液)；溫度40°C;時(shí)間0.5h。反應(yīng)結(jié)束后，將溶液加熱至100 °C,保溫5min,而后離心(6000rpm)去除酶蛋白，將上清液放入透析袋(截留分子量為5.0kDa)內(nèi)透析(4°C，12h)，透析結(jié)束后將樣品離心(5000rpm)，取上清液冷凍干燥，即可獲得白色粉末狀百合多糖修飾產(chǎn)物(分子量:70.0kDa)，與底物百合多糖相比，對(duì)巨噬細(xì)胞增殖活性增加40.5%。
[0016]實(shí)施例2
[0017]按下列條件及操作利用復(fù)合酶對(duì)百合多糖進(jìn)行修飾:底物百合多糖濃度35/L ；β-甘露聚糖酶濃度600U/ L，β-葡聚糖酶300U/L;pH6.0(PBS緩沖液)；溫度45°C;時(shí)間40min。反應(yīng)結(jié)束后，將溶液加熱至100°C,保溫5min,而后離心(6000rpm)去除酶蛋白，將上清液放入透析袋(截留分子量為5.0kDa)內(nèi)透析(4°C，12h)，透析結(jié)束后將樣品離心(5000rpm)，取上清液冷凍干燥，即可獲得白色粉末狀百合多糖修飾產(chǎn)物(分子量:50.3kDa)，與底物百合多糖相比，對(duì)巨噬細(xì)胞增殖活性增加45.2%。
[0018]實(shí)施例3
[0019]按下列條件及操作利用復(fù)合酶對(duì)百合多糖進(jìn)行修飾:底物百合多糖濃度40/L ；β-甘露聚糖酶濃度700U/L，β-葡聚糖酶350U/L;pH6.5(PBS緩沖液)；溫度45°C;時(shí)間50min。反應(yīng)結(jié)束后，將溶液加熱至100°C,保溫5min,而后離心(6000rpm)去除酶蛋白，將上清液放入透析袋(截留分子量為5.0kDa)內(nèi)透析(4°C，12h)，透析結(jié)束后將樣品離心(5000rpm)，取上清液冷凍干燥，即可獲得白色粉末狀百合多糖修飾產(chǎn)物(分子量:40.5kDa)，與底物百合多糖相比，對(duì)巨噬細(xì)胞增殖活性增加55.0%。
[0020]實(shí)施例4
[0021]按下列條件及操作利用復(fù)合酶對(duì)百合多糖進(jìn)行修飾:底物百合多糖濃度35/L ；β-甘露聚糖酶濃度800U/L，β-葡聚糖酶400U/L;pH6.0(PBS緩沖液)；溫度50°C:時(shí)間45min。反應(yīng)結(jié)束后，將溶液加熱至100°C,保溫5min,而后離心(6000rpm)去除酶蛋白，將上清液放入透析袋(截留分子量為5.0kDa)內(nèi)透析(4°C，12h)，透析結(jié)束后將樣品離心(5000rpm)，取上清液冷凍干燥，即可獲得白色粉末狀百合多糖修飾產(chǎn)物(分子量:30.5kDa)，與底物百合多糖相比，對(duì)巨噬細(xì)胞增殖活性增加77.2%。[0022]實(shí)施例5
[0023]按下列條件及操作利用復(fù)合酶對(duì)百合多糖進(jìn)行修飾:底物百合多糖濃度30/L ；β-甘露聚糖酶濃度850U/L，β-葡聚糖酶425U/L;pH6.5(PBS緩沖液)；溫度50°C;時(shí)間50min。反應(yīng)結(jié)束后，將溶液加熱至100°C,保溫5min,而后離心(6000rpm)去除酶蛋白，將上清液放入透析袋(截留分子量為5.0kDa)內(nèi)透析(4°C，12h)，透析結(jié)束后將樣品離心(5000rpm)，取上清液冷凍干燥，即可獲得白色粉末狀百合多糖修飾產(chǎn)物(分子量:18.3kDa)，與底物百合多糖相比，對(duì)巨噬細(xì)胞增殖活性增加60.8%。
[0024]實(shí)施例6
[0025]按下列條件及操作利用復(fù)合酶對(duì)百合多糖進(jìn)行修飾:底物百合多糖濃度30/L ；β-甘露聚糖酶濃度900U/L，β-葡聚糖酶450U/L ;pH6.5 (PBS緩沖液)；溫度55°C;時(shí)間Ih。反應(yīng)結(jié)束后，將溶液加熱至100°C，保溫5min，而后離心(6000rpm)去除酶蛋白，將上清液放入透析袋(截留分子量為5.0kDa)內(nèi)透析(4°C，12h)，透析結(jié)束后將樣品離心(5000rpm)，取上清液冷凍干燥，即可獲得白色粉末狀百合多糖修飾產(chǎn)物(分子量:8.0kDa)，與底物百合多糖相比，對(duì)巨噬細(xì) 胞增殖活性增加50.8%。
【權(quán)利要求】
1.一種提高百合多糖活性的生物修飾制備方法，其特征在于采用復(fù)合酶(β-甘露聚糖酶和β -葡聚糖酶)法對(duì)百合多糖(403.3kDa)進(jìn)行生物修飾(即酶法可控降解)，通過反應(yīng)條件控制，獲得系列高免疫活性百合多糖修飾產(chǎn)物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述方法，其特征在于復(fù)合酶的作用條件為:底物百合多糖濃度30?40g/L ； β -甘露聚糖酶濃度500?900U/L，β -葡聚糖酶250?450U/L ；ρΗ5.5?6.5 (PBS緩沖液);溫度40?550C ;時(shí)間0.5?1.0h。
3.根據(jù)權(quán)利要求1?2所述的方法，在復(fù)合酶中，β-甘露聚糖酶和β-葡聚糖酶用量比為 2:1 (U/U)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1?3所述的方法，其特征在于反應(yīng)結(jié)束后去除酶及產(chǎn)物分離制備方法為:反應(yīng)結(jié)束后，將溶液加熱至100°C，保溫5min，而后離心(6000rpm)去除酶蛋白，將上清液放入透析袋(截留分子量為5.0kDa)內(nèi)透析(4°C，12h)，透析結(jié)束后將樣品離心(5000rpm)，取上清液冷凍干燥，即可獲得白色粉末狀百合多糖修飾產(chǎn)物，百合多糖修飾產(chǎn)物的分子量范圍是8.0kDa?70.0kDa0
5.根據(jù)權(quán)利要求1?4所述的方法，其特征在于采用體外巨噬細(xì)胞RAW264.7模型研究百合多糖及修飾產(chǎn)物體外免疫調(diào)節(jié)活性，修飾后的百合多糖活性顯著提高，與底物相比，對(duì)巨噬細(xì)胞增殖活性增加40.5?77.2%。百合多糖的分子量過高或過低，其活性都較低。
6.根據(jù)權(quán)利要求1?5所述的方法，其特征在于百合多糖、β-甘露聚糖酶和β-葡聚糖酶，pH，溫度及作用時(shí)間優(yōu)選組合為35g/L、800U/L和400U/L、6.0 (PBS緩沖液)、50°C和45min。在此作用條件下，百合多糖修飾產(chǎn)物的分子量為30.5kDa。與底物百合多糖相比，對(duì)巨噬細(xì)胞增殖活性增加77.2%。
【文檔編號(hào)】C12P19/14GK103436571SQ201310404673
【公開日】2013年12月11日 申請(qǐng)日期:2013年9月9日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月9日
【發(fā)明者】陳志剛, 張丹妮, 王芬, 郭曉玉 申請(qǐng)人:南京農(nóng)業(yè)大學(xué)