專利名稱：一種檢測dmd基因外顯子缺失和/或重復的方法
技術領域：
本發明涉及基因檢測領域，尤其涉及DMD基因的分析及其方法。
背景技術：
DMD基因是迄今為止發現的最大的人基因，該基因有時會發生突變，例如新生男嬰中1 3500出現該基因的突變。DMD基因內一個或多個外顯子的大片段會發生缺失，涉及基因近端和中部兩個熱點區域(外顯子3-7和外顯子44-5 。DMD基因內一個或多個外顯子的大片段會發生重復，約占DMD突變的6%。DMD基因發生更多的是點突變、小片段的缺失和插入。目前，DMD基因的檢測方法主要有以下幾種微陣列比較基因組雜交技術 (a-CGH)、MLPA, MAPH、SCAIP、多重PCR、DNA印跡、Sanger測序法和第二代測序技術。對于高通量檢測DMD基因外顯子缺失和重復而言，上述這些檢測方法的缺點是通量低、效率差。 所以，本領域中需要新的高通量檢測DMD基因外顯子缺失和重復的方法。

發明內容
本發明涉及一種檢測DMD基因外顯子缺失和/或重復方法，所述方法利用現在DMD 基因的序列信息設計探針，將捕獲富集獲得的DNA片段進行測序，通過分析獲得DMD基因外顯子缺失信息。本發明提供了一種檢測DMD基因外顯子缺失和/或重復的方法，包括步驟1)將從待測樣品和正常對照樣品提取基因組DNA分別打斷為雙鏈DNA片段，并在所述雙鏈DNA片段的兩端添加接頭序列；2)以第一引物和第二引物擴增所述帶有接頭的雙鏈DNA片段，獲得第一擴增產物；3)將所述第一擴增產物變性后，用核酸芯片進行雜交捕獲；4)以第三引物和第四引物擴增所捕獲的核酸，獲得第二擴增產物；5)對上述第二擴增產物進行測序，獲得測序序列片段；6)將所述測序序列片段比對到參考DMD基因的外顯子序列及外顯子側翼上；7)通過比較待測樣品和正常對照樣品比對結果確定所述待測樣品DMD基因的外顯子是否有重復和/或缺失，即如果比對到所述基因外顯子參考序列上的所述待測樣品測序序列顯著多于/少于所述正常對照樣品測序序列，表示所述基因的外顯子是否有重復和 /或缺失。本發明的方法結合序列捕獲技術、高通量測序和生物信息分析對DMD基因進行檢測。這三種技術的結合是一種非常有效的DMD基因缺失和/或重復的檢測策略。


下列附圖用于說明本發明的具體實施方案，而不用于限定由權利要求書所界定的本發明范圍。圖1顯示了用于確定本發明的設截止值的正態分布圖。 圖2顯示了實施例中的實驗上機條件。
具體實施例方式以下實施更詳細的描述了本發明，這些實施例僅為示例性的，但是本領域技術人員將會理解，下列實施例僅用于說明本發明，而不應視為限定本發明的范圍。利用目標區域捕獲技術，使用外顯子捕獲芯片對人DMD基因的外顯子測序，進而開展DMD基因外顯子缺失和重復突變相關研究，目前還是一項新技術。該技術的基本原理是使用一套寡核苷酸探針來捕獲基因組上的目標序列，然后使用根據DMD基因基因區序列和/或所述接頭序列設計的引物對這些捕獲到的序列進行PCR擴增，再對這些擴增產物進行高通量測序，從而識別DNA樣品中的堿基序列，通過生物信息分析方法對測序所得序列信息進行分析，從而找到目標序列的變異信息，包括單核苷酸變異、插入/缺失、重復、外顯子拷貝數變化等。本發明提供了一種檢測DMD基因外顯子缺失和/或重復的方法，包括步驟1)將從待測樣品和正常對照樣品提取基因組DNA分別打斷為雙鏈DNA片段，并在所述雙鏈DNA片段的兩端添加接頭序列；2)以第一引物和第二引物擴增所述帶有接頭的雙鏈DNA片段，獲得第一擴增產物；3)將所述第一擴增產物變性后，用核酸芯片進行雜交捕獲；4)以第三引物和第四引物擴增所捕獲的核酸，獲得第二擴增產物；5)對上述第二擴增產物進行測序，獲得測序序列片段；6)將所述測序序列片段比對到參考DMD基因的外顯子序列及外顯子側翼上；7)通過比較待測樣品和正常對照樣品比對結果確定所述待測樣品DMD基因的外顯子是否有重復和/或缺失，即如果比對到所述基因外顯子參考序列上的所述待測樣品測序序列顯著多于/少于所述正常對照樣品測序序列，表示所述基因的外顯子是否有重復和 /或缺失。在本發明的方法步驟1)中，經打斷后的所述雙鏈DNA優選為IOO-IOOObp，更優選在150-500bp，最優選在200-300bp，特別是在200_250bp，上述長度表示為雙鏈DNA電泳的
主帶位置。在本發明的方法步驟1)中，所述雙鏈DNA經打斷后優選具有平末端，例如通過末端修復造成所述平末端。在另一優選例中，還包括步驟在所述平末端雙鏈DNA片段的3’ 端加“A”，所述3’端加“A”的雙鏈DNA片段與帶有一個“T”的接頭相連，成為兩端都帶有接頭的雙鏈的DNA片段混合物。所述接頭序列長度優選是20-150nt，特別是50-100nt。本領域技術人員可以根據序列選擇合適的接頭序列，也可以市售的試劑盒中常用的序列作為接頭序列。在本發明的方法步驟1)中，優選所述雙鏈的DNA片段兩末端通過接頭連接序列與接頭序列連接。在另一優選例中，所述接頭連接序列為poly (N)n，其中，各個N分別獨立地選自A、T、G或C，η為選自1-20的任一正整數。在另一優選例中，所述的接頭連接序列為poly(A)n，其中，η為1-20的正整數，較佳地η = 1_2。在另一優選例中，所述的接頭連接互補區序列為poly(N’)m，其中各N’分別獨立地選自A、T、G或C，m為1-20的正整數，并且？017(吣11和？017(^)111為互補序列。在另一優選例中，m為選自1-3的任一正整數。在另一優選例中，所述的接頭連接互補區的長度與接頭連接序列的長度相同，即Poly(N)n* poly (N’ )m為完全互補序列。在另一優選例中，所述的接頭連接互補區為poly (T)m，其中，m 為1-20的正整數，較佳地m = 1-2。本領域技術人員可以根據序列選擇合適的接頭連接序列，也可以市售的試劑盒中常用的序列作為接頭連接序列。在本發明的方法步驟幻中，優選所述第一引物和第二引物根據DMD基因的基因區序列和/或所述接頭序列設計。在一個優選例中，所述的第一引物和第二引物具有對應于所述接頭的引物結合區的接頭結合區，以及位于接頭結合區外側的測序探針結合區。在另一優選例中，所述的第一引物和第二引物為長度30-80bp的寡核苷酸。在另一優選例中，第一引物和第二引物長度為55-6^p。在另一優選例中，所述的第一引物和第二引物是不同的。在本發明的方法步驟幻中，本發明使用的芯片可以通過以下方式進行設計通過微陣列技術，將高密度DNA片段陣列以一定的順序或排列方式使其附著在如玻璃片等固相表面，以熒光標記的DNA探針，借助堿基互補雜交原理，進行大量的基因表達及監測，捕獲目標序列。例如，芯片可以由美國Roche NimbleGen公司設計合成。 在本發明的方法步驟幻中，優選所述的核酸芯片固定有5-200，000種對應于所述 DMD基因的特異性探針。在另一優選例中，所述芯片上特異性探針的種類為50-150，000種， 更佳地500-100，000種，最佳地5000-80，000種。在另一優選例中，所述探針的序列對應于 DMD基因的以下區域外顯子和/或外顯子前后兩端優選50-500nt，更優選100-300nt，最優選200nt。在另一優選例中，所述特異性探針的長度為20-120mer，較佳地，50-100mer，更佳地，60-80mer。在另一優選例中，所述特異性探針為全人工合成或體外克隆合成。在本發明的方法步驟幻后，優選包括步驟用封閉分子封閉位于所述擴增產物兩端的、對應于第一引物和第二引物的區域，從而獲得兩端被封閉的單鏈擴增產物的混合物， 用所述的經封閉的單鏈擴增產物的混合物進行后續步驟4)。在另一優選例中，所述的封閉分子封閉第一 PCR擴增產物中對應于第一引物和第二引物的70% -100%區域。在另一優選例中，所述的封閉分子封閉第一 PCR擴增產物中對應于第一引物和第二引物的100%區域。在本發明的方法步驟4)中，優選所述第三引物和第四引物根據DMD基因的基因區序列和/或所述接頭序列設計。在一個優選例中，所述第三引物和第四引物分別特異性對應于或結合于所述的第一引物和第二引物。在另一優選例中，所述的第三引物和第四引物分別特異性結合于所述的第一引物和第二引物的外側，并且長度小于第一引物和第二引物。在另一優選例中，所述的第三引物和第四引物長度為15-40bp，較佳地為20-2^p。在另一優選例中，所述的第三引物和第四引物是不同的。在本發明的方法步驟5)中，所述測序優選采用第二代測序技術，例如illumina solexa,Hiseq 2000、ABI SOLiD,Roche 454 測序平臺和 / 或 Ion torrent。在另一優選例中，將所述的第二擴增產物的混合物與固相載體上固定的測序探針進行雜交，并進行固相橋式PCR擴增，形成測序簇；然后對所述測序簇用“邊合成-邊測序”法進行測序，從而得到樣本中疾病相關核酸分子的核苷酸序列。目前，有一些生物技術服務公司可提供測序服務。
在本發明的方法步驟6)中，將所述測序序列比對到參考DMD基因外顯子序列及外顯子側翼上可以通過本領域中已知的軟件進行，例如短寡核苷酸分析包(Short Oligonucleotide Analysis Package, SOAP)比對禾口BWA (Burrows—Wheeler Aligner)比對； 所述側翼長度優選為50-500nt，更優選100-300nt，最優選200nt。在本發明的方法步驟6)后，可以先對測序結果原始測序序列質控，去除不合格的測序序列，其中原始read質控包括的項目見下表；
權利要求
1.一種檢測DMD基因外顯子缺失和/或重復的方法，包括步驟1)將從待測樣品和正常對照樣品提取基因組DNA分別打斷為雙鏈DNA片段，并在所述雙鏈DNA片段的兩端添加接頭序列；2)以第一引物和第二引物擴增所述帶有接頭的雙鏈DNA片段，獲得第一擴增產物；3)將所述第一擴增產物變性后，用核酸芯片進行雜交捕獲；4)以第三引物和第四引物擴增所捕獲的核酸，獲得第二擴增產物；5)對上述第二擴增產物進行測序，獲得測序序列片段；6)將所述測序序列片段比對到參考DMD基因的外顯子序列及外顯子側翼上；7)通過比較待測樣品和正常對照樣品比對結果確定所述待測樣品DMD基因的外顯子是否有重復和/或缺失，即如果比對到所述基因外顯子參考序列上的所述待測樣品測序序列顯著多于/少于所述正常對照樣品測序序列，表示所述基因的外顯子是否有重復和/或缺失。
2.根據權利要求1的方法，其中步驟7)中比較待測樣品和正常對照樣品比對結果的步驟如下第一步對于每個DMD基因外顯子，將待測樣品比對到該外顯子上的測序序列數目相對于比對到全部外顯子的測序序列數目標準化，獲得標準化的待測樣品測序序列數目比值，將對照樣品比對到該外顯子上的測序序列數目相對于比對到全部外顯子的測序序列數目標準化，獲得標準化的對照樣品測序序列數目比值；第二步對所述標準化的待測樣品測序序列數目比值和標準化的對照樣品測序序列數目比值進行比較，如果它們在統計學上差異顯著，則當所述標準化的待測樣品測序序列數目比值小于標準化的對照樣品測序序列數目比值時，將所述標準化的待測樣品測序序列數目比值乘以2后和標準化的對照樣品測序序列數目比值進行比較，如果它們在統計學上差異顯著，表示該外顯子沒有發生雜合缺失，當所述標準化的待測樣品測序序列數目比值大于標準化的對照樣品測序序列數目比值時，將所述標準化的待測樣品測序序列數目比值除以2后和標準化的對照樣品測序序列數目比值進行比較，如果它們在統計學上差異顯著，表示該外顯子沒有發生雜合缺失。
3.根據權利要求1或2的方法，其中在步驟1)中經打斷后的所述雙鏈DNA為 lOO-lOOObp，優選在150-500bp，更在200_300bp，最優選在200_250bp ；優選所述雙鏈DNA 經打斷后具有平末端，或者通過末端修復造成平末端；并且還優選在所述平末端雙鏈DNA 片段的3’端加“A”，所述3’端加“A”的雙鏈DNA片段與帶有一個“T”的接頭相連，成為兩端都帶有接頭的雙鏈的DNA片段混合物。
4.根據權利要求1-3任一項的方法，其中所述接頭序列長度是20-150nt，優選是 50-100nt，優選所述雙鏈的DNA片段兩末端通過接頭連接序列與接頭序列連接，其中所述接頭連接序列例如為poly (N) n，其中，各個N分別獨立地選自A、T、G或C，η為選自1_20的任一正整數，例如，所述的接頭連接序列為Poly(A)n,其中，η為1-20的正整數，較佳地η = 1-2，并且所述的接頭連接互補區序列為poly (N’)m，其中各N’分別獨立地選自A、T、G或C， m為1-20的正整數例如選自1-3的任一正整數，并且poly (N)n和poly (N’)m為互補序列；優選所述的接頭連接互補區的長度與接頭連接序列的長度相同，即Poly(N)n* poly(N’)m 為完全互補序列。
5.根據權利要求1-4任一項的方法，其中步驟幻中的所述第一引物和第二引物根據 DMD基因的基因區序列和/或所述接頭序列設計；所述的第一引物和第二引物具有對應于所述接頭的引物結合區的接頭結合區，以及位于接頭結合區外側的測序探針結合區；所述的第一引物和第二引物為長度30-80bp的寡核苷酸，優選第一引物和第二引物長度為 55-6^p;優選所述的第一引物和第二引物是不同的；例如第一引物是SEQ ID NO. 1并且/ 或者第二引物是SEQ ID NO. 2。
6.根據權利要求1-5任一項的方法，其中步驟；3)中的所述核酸芯片固定有5-200，000 種對應于所述DMD基因的特異性探針，優選50-150，000種，更佳地500-100，000種，最佳地 5000-80，000種；所述探針的序列對應于DMD基因的以下區域外顯子和/或外顯子前后兩端優選50-500nt，更優選100-300nt，最優選200nt ；并且/或者所述特異性探針的長度為 20-120mer,較佳地 50_100mer，更佳地 60_80mer。
7.根據權利要求1-6任一項的方法，其中方法步驟；3)后包括步驟用封閉分子封閉位于所述擴增產物兩端的、對應于第一引物和第二引物的區域，從而獲得兩端被封閉的單鏈擴增產物的混合物，用所述的經封閉的單鏈擴增產物的混合物進行后續步驟4)；優選其中所述的封閉分子封閉第一 PCR擴增產物中對應于第一引物和第二引物的70%-100%區域， 特別是100%區域；例如，所述封閉分子是SEQ ID NO. 3或SEQ ID NO. 4。
8.根據權利要求1-7任一項的方法，其中步驟4)中的所述第三引物和第四引物根據 DMD基因的基因區序列和/或所述接頭序列設計；所述第三引物和第四引物分別特異性對應于或結合于所述的第一引物和第二引物；所述的第三引物和第四引物分別特異性結合于所述的第一引物和第二引物的外側，并且長度小于第一引物和第二引物；所述的第三引物和第四引物長度為15-40bp，較佳地為20-2^p ；并且/或者所述的第三引物和第四引物是不同的；例如，第三引物是SEQ ID NO. 5并且/或者第四引物是SEQ ID N0. 6。
9.根據權利要求1-8任一項的方法，其中步驟幻中的測序采用第二代測序技術，例如 illumina solexa,Hiseq 2000,ABI SOLiD,Roche 454 測序平臺和 / 或 Ion torrent ；或者將所述的第二擴增產物的混合物與固相載體上固定的測序探針進行雜交，并進行固相橋式 PCR擴增，形成測序簇；然后對所述測序簇用“邊合成-邊測序”法進行測序，從而得到樣本中疾病相關核酸分子的核苷酸序列。
10.根據權利要求1-9任一項的方法，其中步驟6)中的比對通過短寡核苷酸分析包(Short Oligonucleotide Analysis Package, SOAP)比對禾口 BWA(Burrows-Wheeler Aligner)進行；所述側翼長度優選為50_500nt，更優選100-300nt，最優選200nt ；并且/或者在步驟6)之前，先對測序結果原始測序序列質控，去除不合規的測序序列。
全文摘要
本發明涉及一種檢測DMD基因外顯子缺失和/或重復方法，所述方法利用現在DMD基因的序列信息設計探針，將捕獲富集獲得的DNA片段進行測序，通過分析獲得DMD基因外顯子缺失信息。
文檔編號C12Q1/68GK102533985SQ20111042629
公開日2012年7月4日 申請日期2011年12月19日 優先權日2011年12月19日
發明者瞿寧, 藍章彰, 謝姝琦, 陳洋, 魏曉明 申請人:深圳華大基因研究院, 深圳華大基因科技有限公司