高特異性生產α-環糊精的環糊精葡萄糖基轉移酶突變體的制作方法
【專利摘要】本發明公開了一種高特異性生產α-環糊精的環糊精葡萄糖基轉移酶突變體，屬于酶工程領域。本發明對來源于Paenibacillus?macerans?JFB?05-01的CGTase進行改造，對CGTase的145位的Asp，146位的Arg和147位的Asp進行定點突變，獲得的單突變體酶的β-環糊精生產能力較野生型CGTase降低，α-環糊精生產能力有所增加，主產物α-環糊精的特異性增加；對CGTase進行上述突變位點的組合突變，獲得雙突變體及三突變體；這些突變體與野生型CGTase相比β-環糊精生產能力顯著降低，α-環糊精生產能力有所增加，主產物α-環糊精的特異性增加，更利于α-環糊精的工業化生產。
【專利說明】高特異性生產α-環糊精的環糊精葡萄糖基轉移酶突變體
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種高特異性生產α -環糊精的環糊精葡萄糖基轉移酶突變體，及其制備和應用方法，屬于酶工程領域。
【背景技術】
[0002]環糊精(Cyclodextrin,簡稱⑶)，是一類由淀粉或淀粉類底物在環糊精葡萄糖基轉移酶(簡稱CGTase)作用下生成的由D-吡喃葡萄糖單元通過α -1, 4_糖苷鍵首尾相連的環狀化合物，常見的環糊精由6、7和8個葡萄糖單元構成，分別稱為α-、β-和Y-環糊精。環糊精分子外側親水內部疏水的桶形結構使得其可以與眾多的各類疏水性客體分子形成包合物，進而改變這些客體分子的物理和化學性質，這種獨特的性質使其在食品、醫藥、農業、化妝品、化學、環保等領域有廣泛的應用前景。
[0003]CGTase是α -淀粉酶家族的重要成員，它能催化四種不同的反應:環化反應、歧化反應、偶合反應和水解反應，其中環化反應是CGTase催化的特征反應，是利用CGTase生產環糊精的分子基礎。環糊精生產的制約因素之一是目前已知的野生型CGTase生產的環糊精為α-、β-、Y-環糊精的混合物，這不僅給產物的分離純化帶來不便，而且提高了生產成本。因此在環糊精的生產過程中通常添加特定的有機溶劑選擇性沉淀目的環糊精，提高CGTase產物特異性。
[0004]目前α-環糊精生產一般添加癸醇，但因其沸點高達229°C，增加了蒸餾去除的難度。因此，通過誘變篩選、分子改造等手段獲得高α-環糊精特異性的CGTase，可增加有機溶劑的可選擇范圍甚至不使用有機溶劑，簡化生產工藝，降低生`產成本。
[0005]本發明所使用的來源于Paenibacillus macerans JFB 05-01 (CCTCC NO: M208063)的CGTase在未使用有機溶劑的情況下，酶轉化反應初期主要生產α-環糊精，但隨著反應的進行，副產物之一環糊精比率顯著增加，這降低了 CGTase (生產α -環糊精)對底物的得率，同時也增加了分離純化的難度。因此，進一步提高該酶的產α-環糊精能力與特異性有利于α-環糊精生產成本的降低與規模化生產。

【發明內容】

[0006]本發明的一個目的是提供一種高特異性生產α -環糊精的環糊精葡萄糖基轉移酶突變體，是相對親本CGTase有一個、兩個或三個氨基酸殘基的變化。
[0007]所述親本CGTase的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
[0008]本發明的另一個目的是提供高特異性生產α-環糊精的環糊精葡萄糖基轉移酶突變體的制備和應用方法。
[0009]本發明的技術方案主要包括以下內容:
[0010]( I)突變位點及突變體選擇:
[0011]采用SWISS-MODEL 對來源于 Paenibacillus macerans JFB O5-Ol 的 CGTase (以下簡稱α-CGTase，氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示)進行同源建模，獲得模擬結構，與來源于 Bacillus circulans strain 251 的 β-GTase 分析對比，確定 a-CGTase 中亞位點 _7處參與β-環糊精生成的氨基酸為第145位天冬氨酸Aspl45、第146位精氨酸Argl46和第147位天冬氨酸Aspl47。
[0012]所述發生突變的氨基酸殘基為第145位天冬氨酸Asp、第146位精氨酸Arg或第147位天冬氨酸Asp，旨在削弱CGTase在中亞位點_7處與糖單元的結合，進而限制β -環糊精的生成。
[0013]第145位天冬氨酸突變為組氨酸，命名為D145H(以下類似)，保證α-環糊精的生成，同時引入空間位阻限制環糊精的生成。
[0014]第146位精氨酸分別突變為甘氨酸Gly (G)、丙氨酸Ala (Α)、纈氨酸Val (V)、異亮氨酸Ile (I)、亮氨酸Leu (L)和蛋氨酸Met (M)，移除Arg側鏈與糖鏈_7位糖單元形成的氫鍵，分別命名為:R146G，R146A，R146V，R146I，R146L，R146M ;第146位精氨酸分別突變為苯丙氨酸Phe (F)、酪氨酸Tyr (Y)和色氨酸Trp (W),引入空間位阻，同時移除Arg側鏈與糖鏈-7位糖單元形成的氫鍵，分別命名為:R146F，R146Y，R146W;第146位精氨酸突變為脯氨酸Pro (P)，引入空間位阻，同時移除Arg側鏈和主鏈與糖鏈_7位糖單元形成的氫鍵，命名為:R146P。
[0015]第147位天冬氨酸分別突變為甘氨酸Gly (G)、丙氨酸Ala (A)、纈氨酸Val (V)、異亮氨酸Ile (I)、亮氨酸Leu (L)和蛋氨酸Met (M)，移除Asp側鏈與糖鏈_7位糖單元形成的氫鍵，分別命名為:D147G，D147A，D147V，D147I，D147L，D147M ;第147位天冬氨酸突變為苯丙氨酸Phe (F)、酪氨酸Tyr (Y)和色氨酸Trp (W),引入空間位阻，同時移除Asp側鏈與糖鏈-7位糖單元形成的氫鍵，分別命名為:D147F，D147Y，D147W;第147位天冬氨酸突變為脯氨酸Pro (P)，引入空間位阻，同時移除Asp側鏈和主鏈與糖鏈-7位糖單元形成的氫鍵，命名為D147P。
[0016]將上述三個位點進行突變組合，設計雙突變和三突變，分別獲得雙突變體D145H/R146V, D145H/R146P, D145H/D147V, D145H/D147P, R146V/D147V, R146V/D147P, R146P/D147V, R146P/D147P，及三突變體 D145H/R146V/D147V，D147H/R146V/D147P, D145H/R146P/D147V, D145H/R146P/D147P。
[0017](2)突變
[0018]針對上述突變體設計引物對，其中上游引物為與CGTase片段基因同源、包含編碼突變位點突變后氨基酸的寡核苷酸，下游引物為與上游引物反向互補的寡核苷酸。上、下游引物中突變位點前后堿基數不小于10，單條引物堿基數不超過40。突變用引物由上海生工生物工程有限公司合成。
[0019]以攜帶有CGTase基因的質粒ompA_PET20b (+)/cgt (參見:李彬，吳敬，陳堅.信號肽對浸麻類芽孢桿菌α-環糊精葡萄糖基轉移酶在大腸桿菌中胞外表達的影響[J].工業微生物，2011，41(3):54-59;卩3611讓3(^11118 macerans JFB 05-01 CCTCC Ν0:Μ 208063)為模版，進行重疊PCR。
[0020]PCR 反應體系均為:5 X PS buffer 10 μ L, dNTPs Mix (2.5mM) 4 μ L，正向引物(10 μ Μ) I μ L，反向引物(10 μ Μ) I μ L，模板DNA I μ L,Prime STAR HS DNA polymerase (5U/μ L) 0.5 μ L，加入雙蒸水至50 μ L。PCR擴增條件均為:94°C預變性4min ;隨后進行30個循環(98°C 10s,58°C 5s, 72°C 6min) ;72°C繼續延伸 lOmin。PCR 產物經 Dpn I (Fermentas公司)消化，轉化大腸桿菌JM109感受態細胞，轉化的感受態細胞在LB固體培養基(含100 μ g/mL氨芐青霉素)培養過夜后，挑單克隆于LB液體培養基(含100 μ g/mL氨芐青霉素)中培養，后提取質粒，測序。
[0021](3)突變體及野生酶的表達與純化:
[0022]將測序為正確突變的質粒(對于野生酶，直接用模版質粒)轉化表達宿主大腸桿菌BL21 (DE3)感受態細胞，挑取轉入表達宿主大腸桿菌BL21 (DE3)的單克隆于LB液體培養基(含100 μ g/mL氨芐青霉素)37°C，200rpm,培養8~10h，按5%接種量將種子發酵液接到TB液體培養基(含100 μ g/mL氨芐青霉素)；大腸桿菌在37°C搖床培養至OD6tltl=0.6~0.8，加入0.01mM終濃度的IPTG誘導胞外表達，并在25°C搖床繼續培養發酵48小時后，將發酵液于4°C、1000Og離心15min除菌體，收集上清液并純化，分別得到突變體酶樣品。
[0023]本發明通過對CGTase進行定點突變，獲得了多種單突變體、雙突變體及三突變體，所得突變體生產β -⑶的活力下降，生產α -⑶的活力增強；產物中α -⑶的比例提高，有利于簡化α-⑶的后續純化工藝與實現規模化生產，并且能顯著降低α-環糊精的生產成本，具備廣泛的工業化應用前景。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0024]圖1 為 a-CGTase 與 Bacillus circulans strain 251 來源的 β-CGTase 比較；氨基酸黑色棒狀顯示為a -CGTase中的序列144ADRDQ148及Ν193和Υ195位點，對應的灰色棒狀顯示為β -CGTase中序列144ASSDQ148及Ν193和Υ195位點,糖單元灰色棒狀狀顯示的為結合于β -CGTase-1至_7位點的含有7個葡萄糖單元的糖鏈。
【具體實施方式】
`[0025]實施例1本例說明突變體酶及野生酶的制備。
[0026]I)定點突變
[0027]以質粒ompA-PET20b (+) /cgt (參見:李彬，吳敬，陳堅.信號肽對浸麻類芽孢桿菌α-環糊精葡萄糖基轉移酶在大腸桿菌中胞外表達的影響[J].工業微生物，2011，41 (3):54-59 ；Paenibacillus macerans JFB 05-0ICCTCC Ν0:Μ 208063)為模版，利用合成的突變引物，進行重疊PCR。
[0028]PCR 反應體系均為:5 X PS buffer 10 μ L, dNTPs Mix (2.5mM) 4 μ L，正向引物(10 μ Μ) I μ L，反向引物(10 μ Μ) I μ L，模板DNA I μ L,Prime STAR HS DNA polymerase (5U/μ L) 0.5 μ L，加入雙蒸水至50 μ L。PCR擴增條件均為:94°C預變性4min ;隨后進行30個循環(98°C 10s,58°C 5s, 72°C 6min) ;72°C繼續延伸 lOmin。PCR 產物經 Dpn I (Fermentas公司)消化，轉化大腸桿菌JM109感受態細胞，感受態細胞在LB固體培養基(含100 μ g/mL氨芐青霉素)培養過夜后，挑單克隆于LB液體培養基(含100 μ g/mL氨芐青霉素)中培養，后提取質粒，測序。
[0029]2)突變體酶及野生酶的表達與純化
[0030]將測序為正確突變的質粒(對于野生酶，直接用模版質粒)轉化表達宿主大腸桿菌BL21 (DE3)感受態細胞，挑取轉入表達宿主大腸桿菌BL21 (DE3)的單克隆于LB液體培養基(含100 μ g/mL氨芐青霉素)生長8~10h，按4%接種量將種子發酵液接到TB液體培養基(含100 μ g/mL氨芐青霉素)；大腸桿菌在37 °C搖床培養至OD6tltl=0.6~0.8，加入0.01mM終濃度的IPTG誘導胞外表達，并在25°C搖床繼續培養發酵48小時后，將發酵液于4°C、1000Orpm離心15min除菌體,收集上清液。
[0031]往上清液中緩慢加入25%的(NH4) 2S04，4°C放置鹽析過夜。4°C、1000Og離心15min，收集沉淀。用20mM磷酸緩沖液(pH6.5)復溶沉淀后，在20mmol/L磷酸緩沖液(pH6.5)中透析過夜，期間更換2-3次透析緩沖液，通過0.22 μ m膜過濾后制成上樣樣品。
[0032]采用AKTA蛋白純化儀進行重組蛋白的純化，整個純化過程在層析柜中進行，控制溫度為4°C。陰離子交換色譜純化步驟:(I)平衡:用5倍體積的20mmol/L磷酸緩沖液A(pH6.5)平衡DEAE陰離子交換色譜柱；⑵上樣:預先處理好的樣品以lmL/min的流速上樣；(4)洗脫,流速1.0mL/min,進行梯度洗脫,檢測波長為280nm,分部收集含CGTase酶活性的洗脫液；活力組分在50mM pH5.5磷酸緩沖液中透析過夜后，得到純化突變體酶(每種突變體酶及野生酶純化過程一致)。
[0033]實施例2本實施例說明酶活分析。
[0034]酶活測定方法:
[0035]甲基橙法測定α-環化活力的方法:取適當稀釋的酶液0.lmL，加入裝有2.0mL預先用50mM磷酸緩沖液(pH5.5)配制的l%(w/v)可溶性淀粉溶液中(底物45°C預熱lOmin)，在45°C下反應10min后，加入0.2mL 3.0M的鹽酸終止反應，再加入0.2mL用0.44mM甲基橙，在16°C下保溫15min，在505nm下測定吸光度。一個酶活單位定義為在上述條件下每分鐘生成I μ mol α -環糊精所需的酶量。
[0036]酚酞法測定環化活力的方法:取適當稀釋的酶液0.lmL，加入裝有2.0mL預先用50mM磷酸緩沖液(pH5.5)配制的l%(w/v)可溶性淀粉溶液中(底物45°C預熱lOmin)，在45°C下反應10min后，加入0.2mL `0.6M的鹽酸終止反應，滅酶lOmin，加入0.2mL 0.6M碳酸鈉調節PH，加入0.2mL 1.2mM酚酞(20%乙醇溶解)，25°C保溫15min，在550nm下測定吸光度。一個酶活單位定義為在上述條件下每分鐘生成I μ mol β -環糊精所需酶量。
[0037]實施例3本實施例說明HPLC方法分析環糊精生成量。
[0038]配制5%(w/v)可溶性淀粉溶(pH5.5)液作為底物。分別加入一定量的CGTase野生酶及突變酶，加酶量為4U/g淀粉，置于45°C、150rpm反應10h。取樣，沸水浴煮IOmin滅酶，取500 μ L與95% (V/V)乙醇1:1混合，室溫放置2h沉淀大分子量的糊精或極限糊精，12000rpm離心20min,取上清進行HPLC分析。
[0039]采用HPLC進行產物分析的色譜條件是:Agilent 1200HPLC色譜儀，Agilent自動進樣器，色譜柱 Thermo Aps-2 HYPERSIL(4.6mmX 250mm), Agilent 2410 不差檢測器；流動相(V/V)為70%乙腈水溶液，流速0.8mL.min—1 ;柱溫40 °C。
[0040]實施例4本實施例說明野生酶及單突變體酶活性及酶轉化產物分析結果。
[0041]野生酶及單突變體酶活性結果如表1所示(由于Y-⑶生成活性極低，占總活性的比率可忽略不計，這里不作為參考指標)，Argl46的突變使α-⑶生成活性稍有增加，Asp 147的突變使β -⑶生成活性降低，在限制β -⑶生成活性比率方面Aspl45、Argl46和Aspl47的突變都有效果，其中以Aspl47的突變尤為顯著。
[0042]表1野生酶及單突變體酶活比較
[0043]
【權利要求】
1.一種環糊精葡萄糖基轉移酶的突變體，其特征在于，相對于具有SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的CGTase，包括一個、兩個或三個氨基酸殘基的變化，所述變化與CGTase產α -環糊精的特異性相關。
2.權利要求1所述的突變體，其特征在于，所述氨基酸殘基為第145位天冬氨酸Asp、第146位精氨酸Arg或第147位天冬氨酸Asp。
3.權利要求2所述的突變體，其特征在于，所述一個氨基酸殘基的變化得到的突變體為: (1)第145位天冬氨酸發生突變，得到突變體D145H； (2)第146 位精氨酸發生突變，得到突變體:R146G、R146A、R146V、R1461、R146L、R146M、R146F、R146Y、R146W 或 R146P ； (3)第147位天冬氨酸發生突變，得到突變體:D147G、D147A、D147V、D1471、D147L、D147M、D147F、D147Y、D147W 或 D147P。
4.權利要求2所述的突變體，其特征在于，所述2個氨基酸殘基的變化得到的突變體為:D145H/R146V、D145H/R146P、D145H/D147V、D145H/D147P、R146V/D147V、R146V/D147P、R146P/D147V 或 R146P/D147P。
5.權利要求2所述的突變體，其特征在于，所述3個氨基酸殘基的變化得到的突變體為:D145H/R146V/D147V、D147H/R146V/D147P、D145H`/R146P/D147V 或 D145H/R146P/D147P。
6.編碼權利要求1-5所述任一CGTase突變體的基因序列。
7.攜帶權利要求6所述DNA序列的質粒或細胞。
8.權利要求7所述的細胞，其特征在于，是微生物細胞，包含細菌、真菌或古菌。
9.獲得權利要求1-5所述任一突變體的方法，其特征在于，可通過定點突變、定向進化或誘變獲得突變體。
10.權利要求1-5所述任一突變體在α-環糊精生產中的應用。
【文檔編號】C12N1/21GK103484439SQ201310409534
【公開日】2014年1月1日 申請日期:2013年9月10日 優先權日:2013年9月10日
【發明者】吳敬, 王蕾 申請人:江南大學