一種原核基因工程雜合陽離子抗菌肽cc的獲得及其發酵方法
【專利摘要】本發明公開了一種重組雜合陽離子抗菌肽CC的大腸桿菌基因工程菌的獲得方法。本發明的原理為，通過生物信息學與分子生物學技術相結合的方法，選取有醫療潛力的天然抗菌肽，進行抗菌肽的分子設計，翻譯后合成基因序列，經過克隆載體構建、表達載體構建等技術程序構建雜合抗菌肽CC大腸桿菌基因工程菌。通過在GST標簽與抗菌肽之間設置DPP三肽序列，表達后進行純化。通過乳糖誘導代替IPTG誘導轉化來降低成本，優化培養條件和培養基組成，與發酵相結合。對其進行的生物學活性鑒定結果表明，其高效的抗菌活性、對熱和pH穩定以及極微弱的溶血活性使其在食品、飼料以及養殖業上具有廣闊的應用前景。
【專利說明】—種原核基因工程雜合陽離子抗菌肽CC的獲得及其發酵
方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及基因工程和生物【技術領域】，尤其是涉及一種原核基因工程雜合陽離子抗菌肽CC的獲得與發酵方法。
【背景技術】
[0002]抗菌肽是動、植物和人類先天性免疫機制的組成部分，在機體受到病毒、細菌等攻擊時被誘導產生。抗菌肽具有廣譜抗菌作用，尤其是對一些產生抗生素耐藥性的病原菌的殺滅作用更引起了人們對它的興趣。抗菌肽在農業、醫療、食品等領域的應用潛力巨大。迄今為止，已經發現了上千種天然抗菌肽，但是具有較好的醫療選擇指數的種類卻比較少，因此，人們希望通過分子上的重新設計，例如，雜合肽的設計等方式從豐富的天然抗菌肽資源中獲得理想的新型人工抗菌肽。
[0003]雜合抗菌肽的設計特點是集兩個(或以上)天然肽的優點于一身，經過適當的人工修飾后，可以揚長避短，最大程度上發揮抗菌活性，并不引起溶血。天蠶素抗菌肽(cecropins)是目前研究最清楚、效果最好的天然抗菌肽；家蠅天蠶素抗菌肽(Cec Md)是本實驗室經誘導家蠅幼蟲，然后克隆得到的(同源性81% )。而Chensirin是近年來發現的中國東北林蛙皮膚上分泌的天然抗菌肽，其活性很高，但具有較高的溶血活性。通過對兩者進行雜合設計，獲得了低溶血，高抗菌活性的新型雜合肽，與天然肽相比具有很大的優勢。
[0004]人們為了得到抗菌肽主要采用了三種方法:1.直接從生物體中提取天然肽，但含量非常少，且提取工藝復雜，成本較高，難以滿足大規模生產的要求；2.化學方法合成。這種方法只適用于非常短的抗菌肽，但大多數抗菌肽分子量都比較大，不適合化學和成；
3.分子量比較大的抗菌肽大多都采用基因工程的方法，該方法研究的比較透徹，而且是生產抗菌肽的有效途徑。如果采用基因工程學的方法生產抗菌肽，就要得到高效表達的發酵菌株，并建立其純化和發酵的條件和方法。通過對誘導方式、誘導條件、培養基組成的優化以及建立發酵體系等進而為規模生產奠定基礎。

【發明內容】

[0005]本發明所要解決的技術問題是:提供了一種原核基因工程雜合陽離子抗菌肽CC的獲得及其發酵方法，得到高效表達的發酵菌株， 并建立了其純化和發酵的最優條件。
[0006]為解決上述技術問題，本發明的技術方案是:
[0007]—種原核基因工程雜合陽離子抗菌肽CC，其特征是，所述抗菌肽CC包括兩對引物，其核苷酸序列如序列表序列3-6所示；
[0008]所述抗菌肽CC是由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的抗菌肽；
[0009]所述抗菌肽CC的核苷酸序列如序列表中序列I所示或如下序列所示；
[0010]
【權利要求】
1.一種原核基因工程雜合陽離子抗菌肽Ce，其特征是，所述抗菌肽CC包括兩對引物，其核苷酸序列如序列表序列3-6所示； 所述抗菌肽CC是由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的抗菌肽； 所述抗菌肽CC的核苷酸序列如序列表中序列I所示或如下序列所示；

2.根據權利要求1所述的一種原核基因工程雜合陽離子抗菌肽CC的獲得方法，其特征是，包括以下步驟: 51.合成CC融合蛋白基因； 52.構建雜合抗菌肽CC重組大腸桿菌基因工程菌； 53.CC融合蛋白的誘導表達； 54.CC的純化； 55.CC的生物學活性鑒定； 56.CC融合蛋白誘導表達方式的轉變； 57.CC重組基因工程菌的發酵培養。
3.根據權利要求2所述的一種大腸桿菌基因工程雜合陽離子抗菌肽CC的獲得方法，其特征是，所述SI過程包括:根據家蠅cecropin基因(GenBank:DQ232774)并應用生物信息學工具計算各組合的一級特征參數、預測二級和三級結構和抗菌活性，設計出具有醫療潛力的雜合抗菌肽CC,在其基因序列前端引入三肽序列(Asp-pro-pro, DPP);根據大腸桿菌對密碼子的偏愛性將雜合抗菌肽的基因序列翻譯成核酸序列，在其兩端加上BamH I和SalI限制性內切酶位點和保護性堿基，末端加上終止密碼子，合成兩對引物F1、Rl, F2、R2，應用重疊PCR技術合成雜合抗菌肽CC的基因；所述兩對引物的核苷酸序列如序列表中序列3-6所示。
4.如權利要求2所述的一種大腸桿菌基因工程雜合陽離子抗菌肽CC的獲得方法，其特征是，所述S2過程包括:構建CC克隆質粒pMD18-T / CC并測序鑒定，構建表達質粒pGEX-6p-l / CC并測序鑒定，構建基因工程菌株pGEX-6P-l / CC / BL21(DE3)并測序鑒定，所述測序鑒定為:測序結果使用NCBI Blast與所設計的基因進行對比，選取兩者結果一致的重組菌為測序結果正確的重組菌。
5.如權利要求2所述的一種大腸桿菌基因工程雜合陽離子抗菌肽CC的獲得方法，其特征是，所述S3過程中包括:將步驟S2中測序結果正確的重組菌和含有空載體的對照菌進行平板培養、種子培養，將發酵液中菌體生長到對數期后分別加入IPTG誘導表達，然后進行SDS-PAGE分析和western blot分析,選取表達成功的雜合抗菌肽CC。
6.如權利要求2所述的一種大腸桿菌基因工程雜合陽離子抗菌肽CC的獲得方法，其特征是，所述S4過程包括:將基因工程菌pGEX-6P-l / CC / BL21(DE3)大量培養、誘導，收集菌體并獲得融合蛋白包涵體，經變性、復性后進行親和層析純化，純化后的融合蛋白經甲酸切割后去除標簽，然后進行定量，純化樣品保留。
7.如權利要求2所述的一種大腸桿菌基因工程雜合陽離子抗菌肽CC的獲得方法，其特征是，所述S6過程包括:利用乳糖來誘導雜合抗菌肽CC融合蛋白的表達，并將其與IPTG誘導的表達效果進行比較；在確定具有可行性的基礎上，應用單因素試驗設計對基因工程菌PGEX-6P-1 / CC / BL21(DE3)的誘導時間、誘導溫度和轉速進行了優化；應用正交試驗設計對乳糖的誘導濃度、碳源、磷酸鹽和氯化鈉的添加量進行了較大范圍的初步優化；應用均勻試驗設計對培養基組成的碳源、氮源、氯化鈉、磷酸鹽以及微量元素鐵的添加量進行了優化，并進行回歸建模。
8.如權利要求2所述的一種大腸桿菌基因工程雜合陽離子抗菌肽CC的獲得方法，其特征是，所述S7過程中包括:應用均勻設計的回歸模型Y=183.501+22.376XJ0.710Χ3_44.483Χ4-872.168Χ5+4.416Χ/+4673.818Χ52_59.618Χ62來預測結果，通過回歸模型對發酵過程的控制和調整，獲得聞效表達、質粒穩定的發酵方法和條件。
【文檔編號】C12N15/70GK103467584SQ201310409440
【公開日】2013年12月25日 申請日期:2013年9月3日 優先權日:2013年9月3日
【發明者】張愛忠, 姜寧, 蔡鵬 , 王志強, 孫艷發, 趙平森, 任文, 張晨雪, 王法明, 朱雙, 劉曉明 申請人:黑龍江八一農墾大學