Snp標記及其應用的制作方法
【專利摘要】本發明公開了SNP標記及其應用。其中，該SNP標記為SEQ ID NO：1所示核苷酸序列自5’端起第251位堿基T或C。本發明的SNP標記與斜帶石斑魚的全長性狀緊密相關，能夠有效用于斜帶石斑魚的分子標記輔助育種。
【專利說明】SNP標記及其應用

【技術領域】
[0001] 本發明涉及SNP標記及其應用。具體地，本發明涉及斜帶石斑魚全長性狀相關的 SNP標記，用于檢測前述SNP標記的引物對和試劑盒，前述SNP標記、引物對、試劑盒在斜帶 石斑魚選育中的用途，以及檢測斜帶石斑魚全長性狀的方法。

【背景技術】
[0002] 石斑魚是名貴的海水經濟魚類。近十多年來，石斑魚人工繁育技術已相對成熟，石 斑魚的養殖規模也逐漸擴大，石斑魚產業的迅速發展，對于促進漁民增收，滿足國民水產品 需求，優化水產養殖業結構有重要意義。但是，種質退化，優良品種缺乏是石斑魚產業可持 續健康發展的主要瓶頸。因此，培育石斑魚優良新品種已成為我國石斑魚產業發展的關鍵。
[0003] 傳統的魚類選育方法完全依賴于表型，存在周期長和效率低等無法逾越的障礙。 分子育種，即分子標記輔助選擇育種，是指利用DNA分子標記對育種材料進行選擇，綜合改 良選育物種的重要經濟性狀，是傳統遺傳育種與現代分子生物學有機結合的育種方法。分 子育種為魚類育種開辟了一條新的途徑，隨著現代生物技術的發展，分子標記在魚類育種 中的作用將日益突出。在石斑魚的育種中，人們希望通過對于生長性狀密切相關，并且與數 量性狀緊密連鎖的DNA標記的選擇，以實現早期選種和提高育種準確性的目標，從而取得 更大的遺傳進展。
[0004] 然而，現階段能夠有效用于石斑魚育種的生長性狀相關的分子標記仍有待挖掘。


【發明內容】

[0005] 本發明旨在至少解決現有技術中存在的技術問題之一。為此，本發明的一個目的 在于提出一種與石斑魚生長性狀相關，能夠有效用于石斑魚選育的SNP標記。
[0006] 其中，需要說明的是，SNP (single nucleotide polymorphism，SNP，即單核苷酸多 態性）是1996年由美國麻省理工學院的人類基因組研究中心學者Lander提出的一類分子 遺傳標記，主要是指基因組水平上由單個核苷酸的變異所引起的DNA序列多態性。SNP表現 出的多態性僅涉及到單個堿基的變異，表現是有轉換、顛換、插入和缺失等。
[0007] 根據本發明的一個方面，本發明提供了一種斜帶石斑魚全長性狀相關的SNP標 記。根據本發明的實施例，該SNP標記為SEQ ID NO :1所示核苷酸序列自5'端起第251位 堿基T或C。根據本發明的實施例，SEQ ID N0:1所示核苷酸序列如下：AGGTCCTTCACAAAGC CGTCACCGTCCACTGACACCACATACGTCACTGGAGCTGTTGCATTCTTGGAGCAGAGATGAGGCATCCCAACACCG TGCTCCACATCTACGCAAACCCAGGATGAAGTTTTCTCCAAATACACCTCCAACCACTCGTCCGCCCCAGGCCCCTC CTTCTTTTTCCCACCCCGCTTTGTTGTGTTACTTGTTGTTACTTCTTCCTCATCATCTTCCTCTTGCTCTTCGCCCT CCTYGTCTTTCAACTGTTTCTTCCCTCCACTGCTCCTCCTCTTCGAAGCTGCAGTGTTCTTGCTCGTCCCTTTCCCC TTCTTCCCCTTTGTGGATTTAGCCCCTCCCTCTGAATCCTCACTGTCCTCGTCGCTTGTTGCCTGAAACTCCTCATC ACTAAGCCCCTCCTCCTCCTGTTCCCCTTCGCTGTTACTTTCTTCCTTGTAGCTGACTTTTGAGGCGATGCTGCGAC G(SEQ ID NO ：1) 〇
[0008] 發明人發現，該SNP標記的位點處基因型為純合TT的斜帶石斑魚的全長顯著高于 此處基因型為純合CC或雜合TC的斜帶石斑魚。進而，根據本發明的實施例，通過檢測斜帶 石斑魚的上述SNP，能夠有效地確定其全長性狀，具體地，如前所述，該SNP位點為純合TT的 斜帶石斑魚的全長顯著高于此處基因型為純合CC或雜合TC的斜帶石斑魚，例如該SNP位 點的基因型為TT時，則能夠確定待測斜帶石斑魚的屬于生長速度快的個體。由此，發明人 確定，本發明的SNP標記與斜帶石斑魚的全長性狀緊密相關，能夠有效用于斜帶石斑魚的 分子標記輔助育種。進而能夠根據實際育種需求選擇生長速度對斜帶石斑魚育種材料進行 早期選擇，進一步能夠有效提高育種的效率和準確性，提高斜帶石斑魚繁殖群體的遺傳水 平，從而能夠準確、高效地選育出斜帶石斑魚優良品種。此外，根據本發明的一些實施例，利 用本發明的SNP標記進行斜帶石斑魚分子標記輔助育種，具有早期篩選、節省時間、成本低 廉、準確性高的優點。
[0009] 根據本發明的另一方面，本發明還提供了一種用于檢測前面所述的本發明的SNP 標記的引物對。根據本發明的實施例，所述引物對具有SEQ ID NO :2-3所示的核苷酸序列。 具體地，本發明的引物對的序列如下所示：
[0010] 上游引物：AGGTCCTTCACAAAGCCGTCAC(SEQ ID NO :2);
[0011] 下游引物：CGTCGCAGCATCGCCTCAAA(SEQ ID NO :3)。
[0012] 根據本發明的實施例，利用本發明的引物對能夠有效地對待測斜帶石斑魚的上述 與全長性狀相關的SNP標記所在的片段進行PCR擴增，進而通過測序能夠有效實現對該SNP 標記的檢測，確定待測斜帶石斑魚該SNP標記位點的基因型，進而能夠有效確定待測斜帶 石斑魚的全長性狀。具體地，該SNP標記位點處基因型為純合TT的斜帶石斑魚的全長顯著 高于此處基因型為純合CC或雜合TC的斜帶石斑魚，例如該SNP位點的基因型為TT時，則 能夠確定待測斜帶石斑魚的屬于生長速度快的個體。由此，用于檢測前面所述的本發明的 SNP標記的引物對，能夠有效用于斜帶石斑魚的分子標記輔助育種，進而能夠輔助早期實現 短時間、低成本、高準確性地選育斜帶石斑魚優良品種。
[0013] 根據本發明的又一方面，本發明還提供了一種用于檢測前面所述的SNP標記的試 齊?盒。根據本發明的實施例，該試劑盒包含：前面所述的用于檢測本發明的SNP標記的引物 對。即本發明的試劑盒中包含具有SEQ ID NO :2-3所示的核苷酸序列的引物對。根據本發 明的實施例，利用本發明的試劑盒中所包含的引物對，能夠有效實現對待測斜帶石斑魚的 上述與全長性狀相關的SNP標記的多態性檢測，確定待測斜帶石斑魚該SNP標記位點的基 因型，進而能夠有效確定待測斜帶石斑魚的全長性狀。具體地，該SNP標記位點處基因型為 純合TT的斜帶石斑魚的全長顯著高于此處基因型為純合CC或雜合TC的斜帶石斑魚，例如 該SNP位點的基因型為TT時，則能夠確定待測斜帶石斑魚的屬于生長速度快的個體。由此， 本發明的用于檢測前面所述的本發明的SNP標記的試劑盒，能夠有效用于斜帶石斑魚的分 子標記輔助育種，進而能夠輔助早期實現短時間、低成本、高準確性地選育斜帶石斑魚優良 品種。
[0014] 根據本發明的再一方面，本發明還提供了前面所述的本發明的SNP標記、引物對 或試劑盒，在斜帶石斑魚選育中的用途。如前所述，通過能夠用于檢測本發明的與斜帶石斑 魚全長性狀相關的SNP標記的試劑例如前述的引物對或包含該引物對的試劑盒等，能夠有 效地檢測確定待測斜帶石斑魚的上述SNP標記的基因型，進而基于獲得的基因型能夠有效 確定待測斜帶石斑魚的全長性狀，從而能夠有效輔助斜帶石斑魚選育。
[0015] 進而，根據本發明的另一方面，本發明還提供了一種檢測斜帶石斑魚全長性狀的 方法。根據本發明的實施例，該方法通過對待測斜帶石斑魚進行前面所述的SNP標記的檢 測，確定所述待測斜帶石斑魚的全長性狀。具體地，可以通過能夠用于檢測本發明的與斜帶 石斑魚全長性狀相關的SNP標記的試劑例如前述的引物對或包含該引物對的試劑盒等，對 待測斜帶石斑魚進行PCR擴增、測序，以便檢測確定待測斜帶石斑魚的上述SNP標記的基因 型，進而基于獲得的基因型能夠有效確定待測斜帶石斑魚的全長性狀。其中，如前所述，該 SNP標記位點處基因型為純合TT的斜帶石斑魚的全長顯著高于此處基因型為純合CC或雜 合TC的斜帶石斑魚，例如當該SNP位點的基因型為TT時，則待測斜帶石斑魚的屬于生長速 度快的個體。由此，本發明的檢測斜帶石斑魚全長性狀的方法，能夠快速、高效、準確地檢測 斜帶石斑魚全長性狀，進而能夠有效用于斜帶石斑魚的分子標記輔助育種，從而能夠輔助 早期實現短時間、低成本、高準確性地選育斜帶石斑魚優良品種。
[0016] 另外，根據本發明上述實施例的檢測斜帶石斑魚全長性狀的方法還可以具有如下 附加的技術特征：
[0017] 根據本發明的實施例，對待測斜帶石斑魚進行SNP標記檢測的方法不受特 別限制。測序、單鏈構象多態性聚合酶鏈式反應（PCR single strand conformation po Iymorphi sm，PCR-SSCP )、限制性片段長度多態性聚合酶鏈式反應（PCR-restriTCion fragment length polymorphism, PCR-RFLP)及飛行時間質譜等技術均可以實現SNP的檢 測。其中，測序是一種準確性最高、靈活性強，通量大、檢測周期短的檢測技術。只需在SNP 位點的兩側設計一對引物，擴增200-1000bp的產物，再通過測序即可直接檢測SNP位點的 基因型。因而，本發明采用測序的方法進行SNP標記檢測。根據本發明的一些具體示例，通 過對待測斜帶石斑魚進行前面所述的SNP標記的檢測，確定所述待測斜帶石斑魚的全長性 狀，進一步包括：提取待測斜帶石斑魚的基因組DNA ;利用前面所述的引物對，將所述待測 斜帶石斑魚的基因組DNA進行PCR擴增，以便獲得PCR擴增產物；對所述PCR擴增產物進行 測序，以便獲得測序結果；基于所述測序結果，確定所述待測斜帶石斑魚的所述SNP標記的 基因型；以及基于所述待測斜帶石斑魚的所述SNP標記的基因型，確定所述待測斜帶石斑 魚的全長性狀。由此，能夠有效提高檢測斜帶石斑魚全長性狀的效率。
[0018] 根據本發明的實施例，提取待測斜帶石斑魚的基因組DNA的方法不受特別限制， 可以采用任何已知的基因組DNA提取方法或試劑盒進行。根據本發明的一些具體示例，采 用常規酚氯仿方法抽提待測斜帶石斑魚的基因組DNA。由此，能夠有效獲得質量好、純度高 的基因組DNA，便于后續步驟進行。
[0019] 根據本發明的實施例，將所述待測斜帶石斑魚的基因組DNA進行PCR擴增的條 件不受特別限制。根據本發明的一些具體示例，該PCR擴增的擴增體系以25 μ 1計為： 50-100ng/y 1 的模板 DNAl μ 1，lOpmol/μ 1 的 SEQ ID NO :2-3 所示的上下游引物各 1 μ 1， lOmmol/L 的 dNTP π?χ2·0μ1，5υ/μ1 的 Taq DNA 聚合酶 0.125yl，10XPCR 反應緩沖液 2. 5 μ 1，余量為雙蒸水；該PCR擴增的反應條件為：94°C 5分鐘；94°C 30秒，53°C 30秒， 72°C 30秒，30個循環；72°C 5分鐘。由此，能夠快速、高效、準確地擴增本發明的SNP標記 所在的片段，獲得目標擴增產物，便于后續步驟的進行。
[0020] 根據本發明的實施例，對所述PCR擴增產物進行測序的方法不受特別限制，只要 能夠有效獲得PCR擴增產物即SNP標記所在的片段的序列即可。根據本發明的一些具體示 例，可以采用選自HISEQ2000、S0LiD、454和單分子測序方法的至少一種對所述PCR擴增產 物進行測序。由此，能夠高通量、快速、高效、準確地獲得測序結果。
[0021] 根據本發明的實施例，基于測序結果，通過比對石斑魚參考基因組序列，能夠有效 確定待測斜帶石斑魚的所述SNP標記的基因型為TT、CC還是TC。
[0022] 根據本發明的實施例，所述SNP標記的TT基因型個體的全長顯著高于CC和TC基 因型個體。即本發明前面所述的SNP標記與斜帶石斑魚的全長性狀緊密相關。由此，基于 確定的待測斜帶石斑魚的該SNP標記的基因型，能夠準確有效地確定待測斜帶石斑魚的全 長性狀即生長速度性狀，例如該SNP位點的基因型為TT時，則待測斜帶石斑魚的屬于生長 速度快的個體。進而本發明的方法能夠有效用于斜帶石斑魚的分子標記輔助育種，從而能 夠輔助早期實現短時間、低成本、高準確性地選育斜帶石斑魚優良品種。
[0023] 需要說明的是，本發明的與斜帶石斑魚全長相關的SNP標記及其應用具有如下優 占·
[0024] (1)本發明提供的SNP標記不受斜帶石斑魚的年齡、性別等限制，可用于斜帶石斑 魚的早期選育，可顯著促進斜帶石斑魚的育種進程；
[0025] (2)檢測斜帶石斑魚如SEQ ID NO. 1所示自5'端起第251位SNP位點的方法，準 確可靠，操作方便；
[0026] (3)斜帶石斑魚如SEQ ID NO. 1所示自5'端起第251位的SNP位點的檢出，為斜 帶石斑魚生長性狀的標記輔助選擇提供了科學依據。
[0027] 本發明的附加方面和優點將在下面的描述中部分給出，部分將從下面的描述中變 得明顯，或通過本發明的實踐了解到。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0028] 本發明的上述和/或附加的方面和優點從結合下面附圖對實施例的描述中將變 得明顯和容易理解，其中 ：
[0029] 圖1顯示了根據本發明一個實施例，本發明的SNP標記位點處CC、TC和TT三種基 因型的測序峰圖。

【具體實施方式】
[0030] 下面詳細描述本發明的實施例。下面通過參考附圖描述的實施例是示例性的，僅 用于解釋本發明，而不能理解為對本發明的限制。
[0031] 實施例1與斜帶石斑魚全長相關的SNP標記的獲得
[0032] I. 1斜帶石斑魚群體的獲得
[0033] 所采用的群體為海南某石斑魚養殖場2010年11月10日孵化的斜帶石斑魚，2010 年12月10日，15, 000尾魚苗被轉移至一個網箱繼續飼養。2011年8月8日，從該網箱隨 機選出199個個體，剪取魚體背鰭鰭條于95%乙醇-20°C保存，用于基因組DNA提取。
[0034] 1 · 2斜帶石斑魚基因組DNA提取
[0035] 本試驗采用常規酚氯仿方法抽提斜帶石斑魚鰭條中的基因組DNA，具體步驟如 下：
[0036] (I)取0· 3?0· 5g鰭條于I. 5ml Eppendorf管中，剪碎，在超凈工作臺上開蓋干燥 20min ；
[0037] (2)待乙醇基本揮發后，TE 緩沖液（lOmmol/ml Tris、lmmol/ml EDTA、SDS5%， ρΗ=8· 0)洗滌 1 ?2 次，再加入 600μ I DNA 抽提液（0· OOlmol/L Tris-Cl、0. lmol/L EDTA、 SDS5%，pH=8. 0)和 3μ I 蛋白酶 k (200mg/ml)，55°C水浴消化 3h 左右，前 30min 每 IOmin 輕 搖離心管1次，消化至管內液體澄清；
[0038] (3)加入自配酚氯仿溶液(酚：氯仿：異戊醇=25 :24 :1)600 μ 1，輕輕來回顛倒離心 管lOmin，12000r離心10min。取上層水相用等體積上述酚氯仿再抽提，直至水相與有機相 之間沒有白色沉淀；
[0039] (4)再用氯仿抽提1次，取出上清液，加入2倍體積已預冷的無水乙醇沉淀DNA， 顛倒混勻，4°C靜置30min，12000r離心lOmin，沉淀再用70%乙醇洗滌，離心晾干沉淀后加 50 μ 1無菌水溶解。4°C保存備用或_20°C長期保存。
[0040] 1. 3采用基因組重測序獲得斜帶石斑魚全長相關的SNP標記
[0041] 基于Hiseq2000高通量測序平臺，對上述的199個個體進行重測序，產生0. 5G左 右的數據量，平均覆蓋〇. 5X的斜帶石斑魚基因組。同時還對這199個個體進行全長等生長 性狀表型鑒定。采用PLINK軟件，基于Mixed Liner模型進行GWAS分析，從7. 5萬個SNP 中找到了一個與全長相關的SNP位點。該SNP位點位于SEQ ID NO :1所示序列的251bp位 點處，在SEQ ID NO: 1序列中用Y表示該處位點，且此處位點的堿基為T或C。該位點處基 因型為純合TT的斜帶石斑魚的全長顯著高于此處基因型為純合CC或雜合TC的斜帶石斑 魚。
[0042] 實施例2與斜帶石斑魚全長相關的SNP標記的測序驗證與應用
[0043] 2. 1提取待測斜帶石斑魚鰭條中的基因組DNA
[0044] 待測斜帶石斑魚來自實施例1中的斜帶石斑魚群體，隨機選取70尾魚，按照實施 例1中所述的DNA提取方法抽提基因組DNA。
[0045] 2. 2擴增含SNP位點的核苷酸片段
[0046] 以前述提取獲得的各待測斜帶石斑魚的基因組DNA為模板，利用正 向引物 F:5'-AGGTCCTTCACAAAGCCGTCAC-3'（SEQ ID N0:2)和反向引物 R: 5'-CGTCGCAGCATCGCCTCAAA-3'（SEQ ID N0:3)，擴增出待測SNP所在的核苷酸片段。其中， ?〇?反應體系以25 4 1計為：50-100叩/^1模板0嫩1以1，10?111〇1/^1引物？和1?各14 1， lOmmol/L dNTP π?χ2·0μ1，5υ/μ1 Taq DNA聚合酶0.125yl，10XPCR反應緩沖液2·5μ1， 余量為雙蒸水；PCR反應條件為：94°C 5分鐘；94°C 30秒，53°C 30秒，72°C 30秒，30個循環； 72 °C 5分鐘。
[0047] 2. 3測序識別SNP位點基因型
[0048] 將上述步驟中獲得的各PCR擴增產物于ABI3730測序儀上進行單向測序，識別SEQ ID N0:1序列中251bp處（即本發明的SNP標記）的基因型。其中，CC、TC和TT三種基因型 的測序峰圖如圖1所示。70個待測斜帶石斑魚個體該SNP位點的基因型及其全長如下表1 所示。
[0049] 70個個體該SNP位點的基因型及其全長
[0050]

【權利要求】
1. 一種斜帶石斑魚全長性狀相關的SNP標記，其特征在于，所述SNP標記為SEQ ID NO: 1所示核苷酸序列自5'端起第251位堿基T或C。
2. 根據權利要求1所述的SNP標記，其特征在于，所述SNP標記的TT基因型個體的全 長顯著高于CC和TC基因型個體。
3. -種用于檢測權利要求1或2所述的SNP標記的引物對，其特征在于，所述引物對具 有SEQ ID NO : 2-3所示的核苷酸序列。
4. 一種用于檢測權利要求1或2所述的SNP標記的試劑盒，其特征在于，包含：權利要 求3所述的引物對。
5. 權利要求1或2所述的SNP標記、權利要求3所述的引物對或權利要求4所述的試 劑盒，在斜帶石斑魚選育中的用途。
6. -種檢測斜帶石斑魚全長性狀的方法，其特征在于，通過對待測斜帶石斑魚進行權 利要求1或2所述的SNP標記的檢測，確定所述待測斜帶石斑魚的全長性狀。
7. 根據權利要求6所述的方法，其特征在于，通過對待測斜帶石斑魚進行權利要求1或 2所述的SNP標記的檢測，確定所述待測斜帶石斑魚的全長性狀，進一步包括： 提取待測斜帶石斑魚的基因組DNA ; 利用權利要求3所述的引物對，將所述待測斜帶石斑魚的基因組DNA進行PCR擴增，以 便獲得PCR擴增產物； 對所述PCR擴增產物進行測序，以便獲得測序結果； 基于所述測序結果，確定所述待測斜帶石斑魚的所述SNP標記的基因型；以及 基于所述待測斜帶石斑魚的所述SNP標記的基因型，確定所述待測斜帶石斑魚的全長 性狀。
8. 根據權利要求7所述的方法，其特征在于，所述SNP標記的TT基因型個體的全長顯 著高于CC和TC基因型個體。
【文檔編號】C12Q1/68GK104419705SQ201310411231
【公開日】2015年3月18日 申請日期:2013年9月10日 優先權日:2013年9月10日
【發明者】游欣欣, 石瓊, 張勇, 楊成業, 阮志強, 束禮平, 蒙子寧, 陳國華, 林浩然 申請人:深圳華大基因研究院, 中山大學, 海南大學, 深圳華大水產科技有限公司