一種混合標記物質和標記方法及其應用的制作方法
【專利摘要】一種混合標記物質和標記方法及其應用。本發明涉及一種混合標記物質，包括標記物和被標記物，標記物包括選自膠體金顆粒，乳膠顆粒，水溶性標記物之中的至少兩種。優選的，標記物包括其中兩種物質，如膠體金顆粒和乳膠顆粒。本發明還涉及了一種標記混合標記物質的方法，包括標記物和被標記物的結合。不同的標記物可以和相同的被標記物共同標記，也可以和相同的標記物分別標記再混合，不同的標記物還可以和不同的被標記物分別標記。另外，本發明還涉及一種檢測試劑條，這種檢測試劑條上包括如上所述的混合標記物質。本發明取得的有益效果是：通過混合標記物質在檢測試劑條中的應用，可以有效提高檢測的靈敏度和特異性。
【專利說明】一種混合標記物質和標記方法及其應用
[0001]本申請是中國專利申請，申請號200910102207.9，申請日:2009年09月03日的分案申請。

【技術領域】
[0002]本發明涉及一種混合標記物質和標記混合標記物質的方法以及其應用，屬于免疫領域中所用的標記物質，尤其是快速診斷領域中應用于檢測樣本中是否含有被分析物質的檢測試劑條。

【背景技術】
[0003]快速診斷領域內，用于檢測樣本中是否含有被分析物質的工具，常常首選檢測試劑條。檢測試劑條可以包括樣本接受區域，標記區域，檢測區域和吸收區域。一般來說，可以直觀顯示檢測結果的帶顏色顆粒會和特定的抗原或者抗體標記并固定在標記區域上。在檢測過程中，這種標記結合物可以和樣本中的物質結合(如果有)，然后順著樣本到達檢測區域，并和檢測區域中的和特定的抗原或者抗體對應的抗體或者抗原結合，并且通過顯示是否有顏色來判斷樣本中是否含有被分析物。
[0004]1971年Faulk和Taytor將膠體金引入免疫化學，此后免疫膠體金技術作為一種新的免疫學方法，在生物醫學各領域得到了日益廣泛的應用。而今，膠體金是一種常用的標記技術，是以膠體金作為示蹤標志物應用于抗原抗體的一種新型的免疫標記技術，有其獨特的優點。近年已在各種生物學研究中廣泛使用。在臨床使用的免疫印跡技術幾乎都使用其標記。目前在醫學檢驗中的應用主要是免疫層析法(immunochromatogra-phy)和快速免疫金滲濾法(Dot-1mmuogold filtrat1n assay DIGFA),用于檢測 HBsAg、HCG 和抗雙鏈 DNA抗體等，具有簡單、快速、準確和無污染等優點。同樣，乳膠標記也具有相類似的功能，不同的是，乳膠和抗原或抗體之間的結合是依靠偶聯作用的共價鍵作用而非靜電作用的。


【發明內容】

[0005]本發明涉及一種混合標記物質，包括標記物和被標記物。優選的，標記物包括選自膠體金顆粒，乳膠顆粒，水溶性標記物之中的至少兩種。優選的，標記物包括其中兩種物質，如膠體金顆粒和乳膠顆粒。其中優選的，這兩種標記物可以分別標記被標記物，然后按照比例混合在一起。這種形式的混合標記物，可以在檢測中互不干擾，增加樣本中被分析物質的結合位點，提高檢測的特異性。另外優選的，這兩種標記物可以先后標記同一種被標記物，形成膠體金-被標記物-乳膠這樣的結合物。這種結合物，可以具有較高的靈敏度，既在弱陽性的情況下可以顯示較強的信號，在弱陰性的情況下也可以顯示陰性，因此在cut-off值附近具有較好的分辨作用。另外優選的，標記物還可以包括其中另外兩種標記物或者三種標記物。
[0006]本發明還涉及了一種標記混合標記物質的方法，包括標記物和被標記物的結合。優選的，標記物至少包括選自膠體金顆粒，乳膠顆粒，以及水溶性標記物的兩種或者三種。不同的標記物可以和相同的被標記物共同標記，也可以和相同的標記物分別標記再混合，不同的標記物還可以和不同的被標記物分別標記。在具體的優選的實施例中，將膠體金顆粒和被標記物集合在一起形成膠體金-被標記物結合物；乳膠顆粒和被標記物結合在一起形成乳膠-被標記物結合物；最后將這兩種結合物混合在一起。在另外一個優選的實施例中，標記混合標記物質的方法包括，將膠體金顆粒和被標記物結合形成膠體金-被標記物結合物；將乳膠顆粒和膠體金-被標記物結合物結合形成膠體金-被標記物-乳膠結合物。另外，本發明還涉及一種檢測試劑條，這種檢測試劑條上包括如上所述的混合標記物質。
[0007]本發明取得的有益效果是:通過混合標記物質在檢測試劑條中的應用，可以有效提高檢測的靈敏度和特異性。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0008]圖1是本發明一個實施例標記物和被標記物的結合示意圖，其中，?表示一種標記物，ο表示另一種標記物，一^表示被標記物。
[0009]圖2是本發明另一個實施例標記物和被標記物的結合示意圖。
[0010]圖3是本發明一個實施例的實驗結果比較圖。其中，C表示控制線，T表示測試線。I是將膠體金-Str印A抗體置于標記墊上得到的結果；II是將乳膠-Str印A抗體置于標記墊上得到的結果；III是將膠體金-str印A抗體和乳膠-str印A抗體共同置于標記墊上得到的結果；IV是將膠體金-strep A抗體-乳膠置于標記墊上得到的結果。

【具體實施方式】
[0011]下面對混合標記物質涉及的概念或這些所使用的技術術語做進一步的說明。
[0012]樣本
[0013]本發明所指的樣本指那些可以用來檢測、化驗或診斷是否存在感興趣的被分析物質的物質。樣本可以是，例如，液體樣本，液體樣本可以包括血液、血漿、血清、尿液、唾液和各種分泌液,還可以包括固體樣本和半固體樣本經過預先處理后形成的液體溶液。收集來的樣本可以用于免疫檢測、化學檢測、酶檢測等方法來檢測是否存在被分析物質。
[0014]被標記物
[0015]本發明中的被標記物是指免疫領域內可以和其他物質通過物理或者化學方式結合的蛋白質類，包括抗原和抗體，以及抗體片段等。
[0016]抗原是指能夠刺激機體產生(特異性)免疫應答，并能與免疫應答產物抗體和致敏淋巴細胞結合，發生免疫效應的物質，如病原體、異種動物血清等。在快速診斷領域內，如測定丙肝病毒抗體(HCV)，就可以采用雙抗原夾心的方法，測定樣本中抗HCV總抗體。
[0017]“抗體”是指免疫球蛋白，無論是天然的還是部分或者全部合成的。這個術語還包括其中保持結合能力的抗體的衍生物，也包括任何含有與免疫球蛋白的結合域同源的或者很大程度上同源的結合域的蛋白質。這些蛋白質可能是源自天然物質，也可能是部分或者全部合成的。一種抗體可能是單克隆的或者是多克隆的。一種抗體可能是任何免疫球蛋白類型中的一員，包括任何人類的免疫球蛋白類型:IgG，IgM, IgA, IgD, IgG和IgE。“抗體片段”是抗體的衍生物或者抗體的小于全長的一個部分。抗體片段能夠保留至少一個全長抗體的結合能力的顯著位點。在一個具體的流感檢測的實施例中，通常可以采用雙抗體夾心的方法，即被標記物為流感抗體，可以給合標記物，當樣本中含有流感病毒時，流感抗體-標記物結合物可以很快將流感病毒抗原捕捉到，并在檢測區域以陽性有線的方式直觀顯示出來。在另一個具體的實施例中，被分析物質是HCG，可以采用HCG抗體和標記物質的標記，來顯示婦女的體液樣本，如尿液或者血液中是否含有HCG抗體，可以判斷婦女是否懷孕。
[0018]標記物
[0019]本發明中的標記物質可以是酶，非水溶性顆粒，例如金屬膠體顆粒(膠體金顆粒)，乳膠顆粒等等，或者一些水溶性標記物質，還可以熒光標記物質。
[0020]混合標記物質
[0021]本發明中的混合標記物質，是指標記物和被標記物之間通過物理或者化學結合產生的結合物。這種混合標記物質中的標記物質，優選的，在本發明中，至少包括兩種標記物，以更加靈敏得捕捉信號。這兩種或者兩種以上的標記物，可以是選自以上所述的任意兩種標記物。如選擇熒光標記物質和膠體金顆粒作為標記物，形成的混合標記物質可以包括以下幾種情況，一種是熒光物質-被標記物結合物和膠體金-被標記物質結合物的混合物，另一種是熒光物質-被標記物-膠體金結合物。
[0022]一個較佳的選擇是選用膠體金顆粒和乳膠顆粒作為標記物膠體金具有很高的動力學穩定性，在穩定因素不受破壞時自身凝聚極慢，可放置數年不發生凝聚。膠體金在弱堿環境下帶負電荷，可與蛋白質分子的正電荷基團形成牢固的結合，由于這種結合是靜電結合，所以不影響蛋白質的生物特性。根據膠體金的一些物理性狀，如高電子密度、顆粒大小比較均勻、形狀及顏色(紫紅色)反應，故是免疫反應的一種較佳標記物。同樣，乳膠顆粒也是作為標記物質較優選擇，這是因為，乳膠分子相對其他標記物質比較大，帶有乳膠顆粒的特異結合被分析物質的分子在經過阻攔區域時，大顆粒的物質速度比小顆粒物質慢，這樣可以讓帶有標記物質的特異結合被分析物質的分子在阻攔區域上作稍長停留與阻攔分子進行充分反應，有利于減少檢測結果的“假陽性”。
[0023]在一個優選的實施例中，混合標記物質包括膠體金-被標記物結合物，以及乳膠-被標記物結合物的混合物。具體的說，是將膠體金顆粒和乳膠顆粒分別和被標記物標記，然后根據一定的比例混合在一起。優選的，混合標記物質為膠體金-抗體結合物和乳膠-抗體結合物的混合物。另外優選的，混合標記物質為膠體金-抗原結合物和乳膠-抗原結合物的混合物。在具體的例子中，如流感檢測中，如圖1所示，可以將膠體金顆粒和流感抗體在一定條件下分別標記，然后將已得到的流感抗體乳膠結合物和流感抗體膠體金結合物共同處理到檢測試劑條的標記區域上，并干燥，組裝成相關產品進行試驗。標記膠體金和乳膠的方法，在現有技術中均有述及，這里不多累贅。采用這樣方式得到的混合標記物質，在技術上比較容易掌握，在試驗過程中取得了相當顯著的效果。這種方式發揮了膠體金標記和乳膠標記各自的優點，可以有效得提高產品的靈敏度和特異性，這在后面的實施例中將具體體現。
[0024]在另一個優選的實施例中，混合標記物質包括膠體金-被標記物-乳膠結合物。優選的，將被標記物和膠體金顆粒先標記，得到膠體金-被標記物結合物，然后，乳膠顆粒去標記膠體金-被標記物結合物，可以得到膠體金-被標記物-乳膠這樣雙重標記的結合物。另外優選的，將被標記物和乳膠顆粒先標記，得到乳膠-被標記物結合物，然后，用膠體金顆粒去標記乳膠-被標記物結合物，理論上也可以得到膠體金-被標記物-乳膠這樣雙重標記的結合物。這種混合標記物質包含了兩種不同特性的標記物，相當于在檢測過程中起到了雙保險的作用，可以更加完全得參與免疫反應，因為，得到的結果是比較理想的，同樣可以將產品的靈敏度和特異性提升一個層次。在一個具體的判斷婦女是否懷孕的快速診斷檢測中，采用膠體金顆粒和HCG抗體在一定的PH等合適環境下進行標記，形成膠體金-HCGAb結合物(膠體金-HCG抗體結合物)，然后，再用乳膠顆粒標記膠體金-HCGAb結合物，得到膠體金-HCGAb-乳膠結合物。將這種混合標記物質應用于檢測樣本中是否含有HCG抗體的檢測試劑條中，優選的，這種混合標記物(膠體金-HCGAb-乳膠結合物)被處理在檢測試劑條的標記區域上。這種混合標記物質取得的效果由于帶有更多的標記物質，而且發揚了不同標記物質的長處，規避了這些標記物質的不足之處，可以比較明顯得改善檢測的效果，如，不采用混合標記物質的檢測試劑條在cut-off值附近出現的陽性或者陰性不確定的情況，在使用了帶有混合標記物質的檢測試劑條之后，情況得到了很好的改進，用cut-off陽性溶液實驗得到較明顯的陽性結果，而用cut-off陰性溶液實驗得到明顯的陰性結果，這說明檢測的靈敏度大大提高。
[0025]另外優選的，在一個具體的實施例中，混合標記物質還可以包括膠體金-被標記物結合物，以及水溶性標記物-被標記物結合物。在另一個具體的實施例中，混合標記物質包括膠體金-被標記物-水溶性標記物結合物。在另一個實施例中，混合標記物質包括乳膠-被標記物結合物，以及水溶性標記物-被標記物結合物。在另外的具體的實施例中，混合標記物質包括乳膠-被標記物-水溶性標記物結合物。在另外優選的方式中，混合標記物質還可以包括兩種以上的標記物質，如選用乳膠顆粒，磁性顆粒以及膠體金顆粒進行標記。這種方式的混合標記物質，可以在應用到產品之后，除了免疫直觀得得到定性的結果，還可以在精密儀器下得到定量的結果。更為優選的實施例中，混合標記物質的被標記物上標記了三種標記物，膠體金顆粒，乳膠顆粒和水溶性標記物共同被標記在同一種被標記物上。
[0026]本發明還涉及了一種標記混合標記物質的方法，包括標記物和被標記物的結合。優選的，標記物至少包括膠體金顆粒和乳膠顆粒。在具體的優選的實施例中，將膠體金顆粒和被標記物集合在一起形成膠體金-被標記物結合物；乳膠顆粒和被標記物結合在一起形成乳膠-被標記物結合物；最后將這兩種結合物混合在一起。在另外一個優選的實施例中，標記混合標記物質的方法包括，將膠體金顆粒和被標記物結合形成膠體金-被標記物結合物；將乳膠顆粒和膠體金-被標記物結合物結合形成膠體金-被標記物-乳膠結合物。此外優選的的實施例中，標記混合標記物質的方法包括:將被標記物和乳膠顆粒先標記，得到乳膠-被標記物結合物，然后，用膠體金顆粒去標記乳膠-被標記物結合物，理論上也可以得到膠體金-被標記物-乳膠這樣雙重標記的結合物。
[0027]本發明還涉及一種檢測樣本中是否含有被分析物質的檢測試劑條。優選的，這種檢測試劑條包括如上所述的混合標記物質。檢測試劑條可以包括一些組件或部件，如順次包括樣本接受區域，標記區域和檢測區域以及吸收區域，檢測區域上通常可以有檢測線。這些部件或者組件是現有【技術領域】內技術人員所公知的。優選的，混合標記物質位于檢測試劑條的標記區域上。
[0028]“被分析物質”在本發明中包括一些半抗原物質，這些半抗原包括毒品(如濫用藥物)。“濫用藥物”(DOA)是指非醫學目的地使用藥品(通常起麻痹神經的作用)。藥物濫用的例子包括可卡因；安非他明等。這些藥品被人體吸收后會分解成不同的小分子物質，這些小分子物質存在于血液、尿液、唾液、汗水等體液中或部分體液存在上述小分子物質。被分析物質還可以是人絨毛膜促性腺激素(hCG)，黃體生成素(LH)，卵巢刺激素(FSH)，丙肝病毒(HCV)，乙肝病毒(HBV)，乙肝表面抗原，艾滋病病毒和任何濫用的藥物。被分析物能夠在任何的液體或者液化樣本中檢測到，例如尿液，唾液，口水，血液，血漿，或者血清。
[0029]下面結合具體附圖對本發明的實施例子來進行詳細的說明。這些具體的實施例子僅僅是在不違背本發明精神下的有限列舉，并不排除本領域的一般技術人員把現有技術和本發明結合而產生的其他具體的實施方案。
[0030]實施例1
[0031]本實施例闡述了流感檢測試劑條。在檢測試劑條的標記區域，共同標記了乳膠-流感抗體結合物和膠體金(也稱金標)_流感抗體結合物。下面是具體的標記過程和采用的物質，原理如圖1所示。
[0032]1.乳膠標記:將流感A抗體如紅色乳膠混合，加入EDC后進行反應，4小時后，加入終止液，停止反應，1000rpm離心去上清液，加入稀釋液，并超聲波破碎，得到流感抗體乳膠結合物，4 °C保存。
[0033]2.金標標記:將40nm膠體金溶液pH調至9.0，將流感A抗體用0.1Mol/L K2C03調pH至9.0，兩者混合，攪拌10分鐘，加入一定量的5 %胎牛血清和I %的聚乙二醇，加入的量:5% BSA使溶液終濃度為1% ;1%聚乙二醇加至總溶液的1/10。繼續攪拌10分鐘。然后在14000g，離心I小時。然后吸出上清，沉淀物用含1% BSA的PBS溶液將沉淀稀釋為為原體積的1/10，得到流感抗體膠體金結合物，4°C保存。
[0034]3.將已得的流感抗體乳膠結合物和金標結合物稀釋到不同濃度，按一定處理到聚脂膜上，并干燥，組裝成相關產品進行試驗。抗體乳膠結合物加上抗體膠體金結合物的靈敏度比單獨的抗體乳膠結合物或抗體膠體金結合物都高，特異性都良好。結果如表一:
[0035]表一:不同濃度流感抗體乳膠結合物和流感抗體金標結合物檢測結果比較表
[0036]

【權利要求】
1.一種混合標記物質，包括標記物和被標記物，其特征在于，所述的標記物包括選自膠體金顆粒，乳膠顆粒，水溶性標記物之中的至少兩種。
2.如權利要求1所述的混合標記物質，其特征在于，所述的被標記物包括至少一種抗體或抗原物質。
3.如權利要求1或2所述的混合標記物質，其特征在于，所述的混合標記物質包括膠體金-被標記物-乳膠結合物。
4.如權利要求1或2所述的混合標記物質，其特征在于，所述的混合標記物質包括膠體金-被標記物結合物，以及水溶性標記物-被標記物結合物。
5.如權利要求1或2所述的混合標記物質，其特征在于，所述的混合標記物質包括膠體金-被標記物-水溶性標記物結合物。
6.如權利要求1或2所述的混合標記物質，其特征在于，所述的混合標記物質包括乳膠-被標記物結合物，以及水溶性標記物-被標記物結合物。
7.如權利要求1或2所述的混合標記物質，其特征在于，所述的混合標記物質包括乳膠-被標記物-水溶性標記物結合物。
8.一種帶有混合標記物質的檢測試劑條，其中混合標記物質包括標記物和被標記物，其特征在于，所述的標記物包括選自膠體金顆粒，乳膠顆粒，水溶性標記物之中的至少兩種。
9.如權利要求8所述的檢測試劑條，其特征在于，所述的被標記物包括至少一種抗體或抗原物質。
10.如權利要求8所述的檢測試劑條，其特征在于，所述的檢測試劑條包括標記區域和檢測區域，所述的混合標記物質位于標記區域。
11.如權利要求8或9所述的檢測試劑條，其特征在于，所述的混合標記物質包括膠體金-被標記物-乳膠結合物。
12.—種標記混合標記物質的方法，包括標記物和被標記物的結合，其特征在于，所述的標記物包括選自膠體金顆粒，乳膠顆粒，水溶性標記物之中的至少兩種。
13.如權利要求12所述的標記方法，其特征在于，包括以下步驟:膠體金顆粒和被標記物結合形成膠體金-被標記物結合物；乳膠顆粒和膠體金-被標記物結合結合形成膠體金-被標記物-乳膠結合物。
14.如權利要求12或13所述的標記方法,其特征在于,所述的被標記物包括抗原或者抗體。
【文檔編號】G01N33/532GK104198692SQ201410366392
【公開日】2014年12月10日 申請日期:2009年9月3日 優先權日:2009年9月3日
【發明者】吳銀飛 申請人:艾博生物醫藥(杭州)有限公司