一種竹黃菌漆酶的制作方法
【專利摘要】一種竹黃菌漆酶，屬于工業微生物領域。本發明公開了一種竹黃菌漆酶的基因的核苷酸序列SEQIDNO.1及其所編碼的漆酶蛋白氨基酸序列如SEQIDNO.2，本發明進一步闡明了該漆酶的性質及用途，該漆酶在工業染料脫色方面的應用及在氨基酸轉化方面的應用。
【專利說明】一種竹黃菌漆酶
【技術領域】
[0001]本發明一種竹黃菌漆酶，特別是一種竹黃菌漆酶基因的核苷酸序列和氨基酸序列、漆酶的酶學性質以及該漆酶的應用，屬于工業微生物領域。
【背景技術】
[0002]漆酶(EC 1.10.3.2)是一種含銅離子的多酚氧化酶，屬于銅藍氧化酶蛋白家族。漆酶的分布非常廣，在植物，細菌和一些昆蟲中都有發現，尤其在高級真菌里分布最多。在真菌中，漆酶的主要生產者有半知菌、擔子菌、云芝菌、毛殼菌、側耳菌、木霉菌等。
[0003]漆酶是一種多銅酶，可以催化氧化一系列底物，例如鄰位和對位二元酚、多酚、二元胺、芳香胺、酚醛、苯硫酚、酚酸和其他的衍生物等，利用一電子氧化機制把分子氧還原成水。如果存在合適的氧化還原介質，漆酶可以氧化的底物范圍還會有很大的增加。由于廣泛的底物特異性，漆酶可以用于藥物分析，酒的澄清，紙漿漂白、合成染料脫色、污水的生物治理、生物傳感器以及化學合成，還有報道指出漆酶還可以抑制HIV-1病毒的逆轉錄酶。同時漆酶的催化特性也得到了很多領域的關注，主要涉及生物燃料電池的氧陰極、免疫標簽以及生物催化的有機合成等方面。漆酶已成為一種重要的、與工業相關的酶，越來越受到人們的重視。
[0004]竹黃(Shiraia bambusicola p.Henn.)又名天竹花、竹三七、赤團子等,是我國一種傳統的藥用真菌，隸屬于子囊菌亞門，核菌綱，球殼目，肉座菌科，竹黃屬。特異寄生于某些竹子的嫩枝上，其子實體稱為竹黃。竹黃是一種民間藥材，常用其泡酒，治療坐骨神經痛、風濕性關節炎、跌打損傷、虛寒胃痛、氣管炎和小兒驚風等癥。前期我們發明了“一種竹黃菌發酵生產漆酶的方法(ZL 201010501212.X)”，本發明進一步闡明了該漆酶的性質及用途。

【發明內容】

[0005]本發明目的是提供一種竹黃菌漆酶，進一步闡明了該漆酶的性質及用途。
[0006]本發明的技術方案:一種竹黃菌漆酶，其相關蛋白基因的核苷酸序列如SEQ IDN0.1所示。
[0007]該竹黃菌漆酶對應的氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示。
[0008]該竹黃菌漆酶的分子量按MALDI/T0F-MS所確定的為70.78 kDa。
[0009]其反應溫度為20-65°C相對酶活大于50%，反應溫度為50°C時相對酶活接近100%，及溫度穩定性為40-50°C。
[0010]其反應pH及pH穩定性:以DMP、愈創木酚、丁香醛連氮或ABTS為底物其反應pH值分別為4-5、5.5、6或3-4 ;以DMP為底物時，將漆酶分別置于pH值為3_9的緩沖液中處理96小時測定剩余酶活，pH值在6-7時酶活比較穩定，pH值低于5或高于8時剩余酶活不足起始的50%。[0011]金屬離子對其作用:金屬離子Fe2+，Ag+及Fe3+對其作用10分鐘后，酶活損失較大，剩余酶活分別為0%, 8.13%及67.50%。[0012]酶抑制劑對其作用:酶抑制劑SDS及NaN3對其作用10分鐘的剩余酶活分別為
10.22%及7.86%，其它抑制劑NaF、DTT、L_cys、EDTA及EGTA相對來說對其抑制作用較弱。
[0013]所述的竹黃菌漆酶的應用，在工業染料脫色方面的應用，對蒽醌類色素200mg/L的AB129，具有很強的脫色能力，反應2小時，脫色率達到66.60% ;而處理偶氮類色素20mg/L的ARl及50mg/L的RB5時需要小分子介體HOBT終濃度2 μ M的加入，2小時脫色率分別為 26.50% 及 26.55%。
[0014]所述的竹黃菌漆酶的應用，在氨基酸轉化方面的應用，催化鄰苯二酚與賴氨酸相結合，形成新的賴氨酸衍生物。
[0015]1、生產菌株
本發明生產漆酶的菌株為竹黃菌株SAiraia sp.SUPER-H168，保藏號為CCTCC M207104，已在 ZL 200710132510.4 中公開。
[0016]2、漆酶純化` 根據專利ZL 201010501212.X的方法發酵得到發酵液離心得到粗酶液，粗酶液進一步利用陽離子柱進行層析，純化倍數為2.12，酶的回收率為24.16%，去除了大部分的雜質。陽離子交換層析后收集到的酶液利用分子篩凝膠層析純化倍數為2.14，酶的回收率為
12.98%，得到了純漆酶。
[0017]3、漆酶分子量
將步驟2得到的純漆酶通過MALDI/T0F-MS技術測得其分子量為70.78 kDa。
[0018]4、漆酶的最適溫度及溫度穩定性
將本發明所述的漆酶分別在20-70°C下測定其酶活，在50°C下其酶活最高，說明酶的最適溫度為50°C。酶活的測定方法見ZL 201010501212.X。
[0019]將本發明所述的漆酶置于40、50、60與70°C下處理3小時，發現40和50°C條件下酶活基本沒有損失，當溫度達到60°C時，3小時后剩余酶活僅為開始時的40%，溫度高于70°C后，酶在短時間內就完全失活。
[0020]5、漆酶的最適pH值及pH穩定性
分別以12-1-53-乙酸基高碘酸鹽(DMP)、愈創木酚、丁香醛連氮和2，2’氨基-二(3-乙基-苯并噻唑啉磺酸-6)銨鹽(ABTS)為底物研究pH對本發明所述漆酶酶活的影響，發現漆酶在不同的底物條件下其最適pH值也不同，以DMP、愈創木酚、丁香醛連氮和ABTS為底物其最適PH值分別為4-5、5.5、6和3-4。
[0021]以DMP為底物研究pH對本發明所述漆酶穩定性的影響，將漆酶分別置于pH值為3-9的緩沖液中處理96小時測定剩余酶活發現pH值在6-7時酶活比較穩定，pH值低于5或高于8時剩余酶活不足起始的50%。
[0022]6、不同金屬離子與抑制劑對酶活的影響
將本發明所述的漆酶置于濃度為IOmM的不同金屬離子與抑制劑溶液中處理10分鐘測定其剩余酶活發現Fe2+，Ag+和Fe3+離子作用10分鐘后，酶活損失較大，剩余酶活分別為0%，8.13%和67.50%。被酶的抑制劑SDS和NaN3作用10分鐘的剩余酶活分別為10.22%和
7.86%，其它抑制劑NaF、DTT、L_cys、EDTA和EGTA相對來說抑制作用較弱。
[0023]7、漆酶基因的克隆 (I)中間片段的克隆采用常規的方法提取竹黃菌SP.SUPER-H168)中的DNA。根據已測得的N端序列(SSTGNGNGP)設計PCR引物I。從NCBI數據庫中比對已知真菌漆酶的蛋白序列，找出其保守序列來設計PCR引物2。用以上合成的兩條引物，以竹黃菌SP.SUPER-H168)的基因組DNA為模板進行PCR擴增，用0.8%的瓊脂糖凝膠電泳對PCR產物進行檢測，將得到的目的條帶采用常規方法測序。
[0024](2) 3，RACE
采用通用的RNA提取與純化方法從竹黃菌(SP.SUPER-H168)中提取得到總RNA。將得到的RNA反轉錄得到cDNA，根據上述步驟(I)中得到的片段序列，設計并合成基因特異性上游引物SI，以TaKaRa提供的3’ RACE Outer Primer為下游引物，以cDNA為模板，利用上游引物SI和下游引物3’RACE Outer Primer進行PCR擴增；擴增得到完整的3’端，測序得到3’端序列。
[0025](3) 5，RACE
采用通用的RNA提取與純化方法從竹黃菌(SP.SUPER-H168)中提取得到總RNA。使用TaKaRa試劑盒中的藥品與方法進行以下操作，Alkaline Phosphatase對TotalRNA中裸露的5’憐酸基團進行去憐酸 反應。使用Tobacco Acid Pyrophosphatase (TAP)去掉mRNA的5’帽子結構，保留一個磷酸基團，然后進行RNA的反轉錄得到cDNA。
[0026]根據上述步驟(I)中得到的片段序列，設計并合成基因特異性下游引物S2，以TaKaRa提供的5’ RACE Outer Primer為上游引物，以cDNA為模板，利用上游引物S2和下游引物5，RACE Outer Primer進行PCR擴增；擴增得到完整的5，端，測序得到5，端序列。
[0027]8、漆酶在染料脫色方面的應用
本發明所述的漆酶對蒽醌類色素AB129 (200mg/L)具有很強的脫色能力，反應2小時，脫色率可達到66.60%,而處理偶氮類色素ARl (20mg/L)和RB5 (50mg/L)時需要小分子介體HOBT的加入，2小時脫色率分別為26.50%和26.55%。
[0028]9、漆酶轉化氨基酸的應用
本發明所述漆酶可催化鄰苯二酚與賴氨酸相結合，形成新的賴氨酸衍生物。其催化反應體系為:2mL 20mM磷酸緩沖液、ImL IOmM的賴氨酸、ImL IOmM的鄰苯二酚、ImL 5U/mL的漆酶。在恒定PH為7，不同的溫度條件(20-70°C)下分別反應2小時，利用HPLC檢測反應產物發現在溫度為50°C條件下氨基酸轉化率最高。在溫度為50°C，不同的pH值(3-8)條件下分別反應2小時，利用HPLC檢測反應產物發現pH為6時氨基酸轉化率最高。在50°C、PH6的條件下漆酶催化賴氨酸與鄰苯二酚反應2小時，賴氨酸的轉化率高達86%。
[0029]本發明的有益效果:本發明進一步闡明了該漆酶的性質及用途，該漆酶在工業染料脫色方面的應用及在氨基酸轉化方面的應用。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0030]圖1漆酶的分離純化，陽離子交換層析譜圖。
[0031]圖2漆酶的分離純化，分子篩凝膠層析譜圖。
[0032]圖3漆酶純化電泳圖，M:marker、l:粗酶液、2:陽離子交換層析、3:分子篩凝膠層析。
[0033]圖4純漆酶的MALD1-T0F圖。[0034]圖5漆酶的最適溫度。
[0035]圖6漆酶的熱穩定性。
[0036]圖7漆酶的最適pH值。
[0037]圖8漆酶的pH穩定性。
【具體實施方式】
[0038]下面用實施例對本發明做進一步說明。
[0039]以下實施例中所使用的實驗材料，如無特殊說明，均為可購買到的生化試劑。其中真菌DNA與RNA提取試劑盒購自北京天恩澤基因科技有限公司，PCR所用試劑及其試劑盒均購自寶生物工程(大連)有限公司。
[0040]本發明中所使用的漆酶生產菌——竹黃菌株sp.SUPER-H168已在專利ZL 200710132510.4中公開，漆酶的發酵培養方法在專利ZL 201010501212.X中公開。
[0041]本發明中所用漆酶酶活的測定方法是用分光光度計檢測漆酶與底物反應后吸光度，計算漆酶活性。以上所說的底物為DMP。酶活定義為每分鐘氧化I μ mo I底物為產物所需的酶量為一個酶活力單位。酶活測定以DMP為底物，反應溫度為50°C，反應體系為3mL，包括 0.5mL IOmmoI/L 的 DMP、2.4mL 磷酸-檸檬酸緩沖溶液(20mmol/L，pH3.0)和 0.1mL 酶液。
[0042]實施例1
本實施例為本發明所述漆酶的分離純化，其純化步驟為:
1、竹黃菌產漆酶的發酵液10000g、4°C離心20分鐘收集上清得到粗酶液。
[0043]2、將步驟I得到的粗酶液進行冷凍干燥濃縮，將干燥得到的酶粉用少量的緩沖液A(20mM NaAc-HAc,pH 4.5)溶解過陽離子交換柱(HiPrep 16/10 CM FF)。陽離子柱首先用20mL的緩沖液B(1M NaCl溶解在20mM NaAc-HAc,pH 4.5)預洗，洗掉柱子里帶有的雜蛋白，再用40mL的緩沖液A平衡柱子，然后上樣用緩沖液溶解的粗酶粉，最后用40mL的緩沖液A洗脫漆酶蛋白，將未結合到離子柱上的雜質洗脫掉，用4個梯度的緩沖液洗脫(四個梯度的NaCl濃度分別為0.05,0.07,0.15及0.30M)流速為2mL/min，總共洗脫240mL，將吸附在離子柱上的蛋白洗脫下來，收集有酶活的洗脫液用超濾管(30-kDa)進行濃縮。這一步的純化倍數為2.12，酶的回收率為24.16%，去除了大部分的雜質。
[0044]3、將第二步濃縮的酶液過凝膠柱G200。首先，用含有0.2M NaCl的10 mMTris-HCl緩沖液(pH 7.0)平衡凝膠柱同時除掉柱子中帶有的雜蛋白，上樣濃縮的酶液，用相同的緩沖液0.5mL/min洗脫酶液，最后收集有酶活的洗脫液。這一步純化倍數為2.14，酶的回收率為12.98%，得到了純漆酶。
[0045]實施例2
本實施例為利用質譜測定實施例1中得到的本發明所述純漆酶的分子量大小。將實施例I中得到的純酶用超濾管(30kDa)濃縮至終濃度為l_2mg/mL。質譜測定基質為:戒子酸(SA)飽和溶解在TA30 (30%ACN, 0.1%TFA)中。取上述濃縮純酶液和SA基質各I μ L混合，取I μ L混合液于不銹鋼靶中，干燥后在線性正離子模式LP30-21OkDa下上MALD1-TOF (Bruker公司)。得到漆酶蛋白的質譜圖，確定漆酶的分子量為70.78 kDa。
[0046]實施例3本實施例為本發明所述漆酶的最適溫度及溫度穩定性。如圖5、圖6所示，以DMP為底物，將底物與pH為3.5的磷酸緩沖液在20-70°C不同的溫度條件下水浴10分鐘測定漆酶的酶活，結果發現在50°C條件下測得的漆酶酶活最高，可以確定酶的最適溫度為50°C。將本發明所述的漆酶置于40、50、60與70°C下處理3小時，發現40和50°C條件下酶活基本沒有損失，當溫度達到60°C時，3小時后剩余酶活僅為開始時的40%，溫度高于70°C后，酶在短時間內就完全失活。
[0047]實施例4
本實施例為本發明所述漆酶的最適pH值及pH穩定性。如圖7、圖8所示，分別將DMP、愈創木酚、丁香醛連氮和ABTS置于pH2.5-9.0的磷酸緩沖液中50°C水浴10分鐘，發現漆酶在不同的底物條件下其最適pH值也不同，以DMP、愈創木酚、丁香醛連氮和ABTS為底物其最適PH值分別為4-5、5.5、6和3-4。以DMP為底物研究pH對本發明所述漆酶穩定性的影響，將漆酶分別置于PH值為3-9的緩沖液中處理96小時測定剩余酶活發現pH值在6-7時酶活比較穩定，PH值低于5或高于8時剩余酶活不足起始的50%。
[0048]實施例5
本實施例為不同金屬離子與抑制劑對本發明所述漆酶酶活的影響。將本發明所述的漆酶置于濃度為IOmM的不同金屬離子與抑制劑溶液中處理10分鐘測定其剩余酶活發現Fe2+，Ag+和Fe3+離子作用10分鐘后，酶活損失較大，剩余酶活分別為0%，8.13%和67.50%。被酶的抑制劑SDS和NaN3作用10分鐘的剩余酶活分別為10.22%和7.86%，其它抑制劑NaF、DTT,L-cys,EDTA及EGTA相對來說抑制作用較弱。下表I和表2分別為金屬離子與抑制劑對酶活性的影響。
[0049]表I金屬離子對酶活性的影響
【權利要求】
1.一種竹黃菌漆酶，其特征在于其相關蛋白基因的核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示。
2.根據權利要求1所述的竹黃菌漆酶，其特征在于該竹黃菌漆酶對應的氨基酸序列如SEQ ID N0.2 所示。
3.根據權利要求1所述的竹黃菌漆酶，其特征在于該竹黃菌漆酶的分子量按MALDI/TOF-MS所確定的為70.78 kDa。
4.根據權利要求1所述的竹黃菌漆酶，其特征在于其反應溫度為20-65°C相對酶活大于50%，反應溫度為50°C時相對酶活接近100%，及溫度穩定性為40-50°C。
5.根據權利要求1所述的竹黃菌漆酶，其特征在于其反應pH及pH穩定性:以DMP、愈創木酚、丁香醛連氮或ABTS為底物其反應pH值分別為4-5、5.5、6或3-4 ;以DMP為底物時，將漆酶分別置于PH值為3-9的緩沖液中處理96小時測定剩余酶活，pH值在6-7時酶活比較穩定，PH值低于5或高于8時剩余酶活不足起始的50%。
6.根據權利要求1所述的竹黃菌漆酶，其特征在于金屬離子Fe2+，Ag+及Fe3+對其作用10分鐘后，酶活損失較大，剩余酶活分別為0%，8.13%及67.50%。
7.根據權利要求1所述的竹黃菌漆酶，其特征在于酶抑制劑SDS及NaN3對其作用10分鐘的剩余酶活分別為10.22%及7.86%，其它抑制劑NaF、DTT、L-cys、EDTA及EGTA相對來說對其抑制作用較弱。
8.權利要求1-7任一項所述的竹黃菌漆酶的應用，其特征在于在工業染料脫色方面的應用，對蒽醌類 色素200mg/L的AB129，具有很強的脫色能力，反應2小時，脫色率達到66.60% ;而處理偶氮類色素20mg/L的ARl及50mg/L的RB5時需要小分子介體HOBT終濃度2μ M的加入，2小時脫色率分別為26.50%及26.55%。
9.權利要求1-7任一項所述的竹黃菌漆酶的應用，其特征在于在氨基酸轉化方面的應用，催化鄰苯二酚與賴氨酸相結合，形成新的賴氨酸衍生物。
【文檔編號】C12N9/02GK103451160SQ201310414078
【公開日】2013年12月18日 申請日期:2013年9月12日 優先權日:2013年9月12日
【發明者】蔡宇杰, 楊玉春, 丁彥蕊, 金大勇, 朱建航, 廖祥儒, 張大兵, 李枝玲 申請人:江南大學