表達9家族糖苷水解酶基因CtAA9b的畢赤酵母工程菌株的制作方法
【專利摘要】本發明是一種表達嗜熱毛殼菌Chaetomium?thermophilum熱穩定熱穩定9家族糖苷水解酶基因CtAA9b的畢赤酵母工程菌Pichia?pastoris?GS-CT-9B。通過RT-PCR方法從嗜熱毛殼菌Chaetomium?thermophilum獲得糖苷水解酶基因CtAA9b，將其克隆并插入到畢赤酵母整合表達載體pPIC9K中，然后將得到的糖苷水解酶基因CtAA9b表達載體pPIC9K/CtAA9b導入到畢赤酵母GS115中，再從中篩選出一種表達糖苷水解酶基因CtAA9b的酵母工程菌GS-CT-9B。該工程菌表達的糖苷水解酶CtAA9B對內切纖維素酶的活性具有明顯的促進作用，混合酶比原始內切酶N24的降解纖維素的活性提高1.7倍。在Mn2+條件下，CtAA9B和CtAA9B+N24的纖維素酶活性可分別提高15倍和2.54倍。CtAA9B具有良好的熱穩定性和提高纖維素酶活力的能力，可廣泛用于纖維廢料及其它工業領域，具有重大經濟價值和社會價值。
【專利說明】表達9家族糖苷水解酶基因CtAA9b的畢赤酵母工程菌株(-)【技術領域】
[0001]本發明涉及生物工程，具體地說是一種表達具體地說是以嗜熱毛殼菌Chaetomiumthermophilum9家族糖苷水解酶基因CtAA9b的畢赤酵母工程菌株Pichia pastorisGS-CT-9B。
(二)【背景技術】
[0002]糖苷水解酶(英語:Glycoside hydrolases,又稱糖苷酶)是一種專門水解配糖鍵(glycosidic bond)，并產生兩個較小的糖分子的酵素，也是自然界中的常見酵素之一。這類蛋白質在人類的產業上也有所應用，例如用來將纖維素與半纖維素等生物質能降解成可用的小分子。糖苷水解酶具有多個家族。
[0003]嗜熱毛殼菌Chaetomium thermophilum是一種廣泛分布于土壤中的嗜熱真菌。該菌在微晶纖維素為唯一碳源的培養基中50°C條件下可以產生熱穩定的纖維素酶和9家族糖苷水解酶。
[0004]嗜熱毛殼菌產生的9家族糖苷水解酶CtAA9B具有微弱的纖維素酶活性，但對該菌株產生的內切纖維素酶N24的酶活性具有明顯的促進作用，可使其活性提高1.7倍。在不同金屬離子如Mn2+的作用下，CtAA9B和CtAA9B+N24的活性可分別提高15倍和2.54倍。
(三)
【發明內容】

[0005]本發明從嗜熱毛殼菌Chaetomium thermophilum獲得內切β -1，4_葡聚糖酶基因的cDNA序列全長，命名為CtAA9b，CtAA9b基因DNA全長1041bp，包括信號肽序列，起始密碼子和終止 密碼子，編碼322個氨基酸，具有信號肽序列(l-24aaMVKAKKSAFLATVAGASLVAAHGY)。將CtAA9b編碼的氨基酸序列在國際基因庫中進行檢索，發現屬于糖苷水解酶第9家族。
[0006]構建重組表達質粒載體pPIC9K/CtAA9b，利用電轉儀進行電擊轉化Pichiapastoris GSl 15，在MD和麗培養基上篩選，經PCR鑒定篩選陽性轉化子，G418篩選多拷貝轉化子，然后進行甲醇誘導表達，獲得畢赤酵母工程菌株GS-CT-9B。該工程菌株接種于含BMGY培養基中，在28°C 200rpm/min搖床培養6d后，糖苷水解酶的表達量為3.16mg/ml，分子量為55KDa，酶活力為0.0365U/ml,CtAA9b在65°C下是穩定的，處理60min后仍有95%以上的酶活性；70°C處理30min后仍保持64%的活性；80°C處理30min后保持13.5%的活性；90°C處理30min活性幾乎完全喪失。
[0007]9家族糖苷水解酶CtAA9B對嗜熱毛殼菌Chaetomium thermophilum內切纖維素酶N24的酶活性具有明顯的促進作用，混合酶比原始酶N24的降解纖維素的能力提高1.7倍。不同金屬離子對CtAA9B和CtAA9B+N24混合酶活性具有促進或抑制作用，其中在Mn2+條件下，CtAA9B和CtAA9B+N24的纖維素酶活性可分別提高33倍和2.54倍。
(四)【專利附圖】

【附圖說明】:[0008]圖19家族糖苷水解酶CtAA9B的SDS-PAGE分析
[0009]泳道1:低分子量蛋白標準
[0010]泳道2:純化的9家族糖苷水解酶CtAA9B
[0011]圖2A: 9家族糖苷水解酶CtAA9B的最適溫度
[0012]B: 9家族糖苷水解酶CtAA9B的熱穩定性測定
[0013]圖39家族糖苷水解酶CtAA9B對內切纖維素酶N24活性的促進作用
[0014]圖4金屬離子Mn2+對CtAA9B纖維素酶及混合酶活性的影響
(五)【具體實施方式】
[0015]實施例1:嗜熱毛殼菌Chaetomium thermophilum的分離鑒定
[0016] (I)標本采集:從堆肥中采集。
[0017](2)分離培養:將采集標本取0.5克放置在PDA平板上50°C培養3天后，進行分離純化。操作步驟參考Cooney and Emerson (1964)文獻。
[0018](3)鑒定:參考 Cooney and Emerson (1964)和 LaTouche (1950)文獻。
[0019]實施例2:糖苷水解酶基因CtAA9b的克隆
[0020](I)嗜熱毛殼菌Chaetomium thermophilum總RNA的提取:參照Trizol試劑盒說明。
[0021](2)cDNA 第一條鏈的合成:按照 Takara 公司的 TaKaRa RNA PCR kit (AMV) Ver3.0試劑盒說明書進行:取I~2 μ g總RNA，加RNase Free ddH20至9.5 μ L，將RNA樣品在75°C變性5min，立即在冰浴中冷卻5min，然后稍微離心一下，在冰浴中依次加入以下各種成分:10mmol/L dNTP Mixture2 μ L, IOXRT Buffer (Mg2+) 2 μ L，25mmol/L MgCl24 μ L, Oligod(T)-Adaptor Primerl μ L, RNase Inhibiter0.5 μ L, AMV Reverse Transcriptasel μ L(Final Volume20 μ L),將反應液混合后，室溫下放IOmin,然后42°C溫育60min,再煮沸5min以滅活反轉錄酶。加入180 μ L DEPC處理的ddH20，稀釋至200 μ L，混勻，稍微離心，保存于-20°C，備用。
[0022](3)PCR 反應(25μ L):cDNA2y L, 10XBuffer2.5 μ L, IOmmoI/L dNTP2 μ L, 25mmol/LMgC122y L，上、下游引物各 2μ L，Taq DNA 聚合酶 0.5 μ L (5U/μ L)，ddH2012 μ L。反應條件為 94°C 5min 預變性；94°C 40s, 57°C 40s, 72°C lmin,共 32 個循環，72°C延伸 10min,4°C保存。
[0023]上游引物:5’ -ATGGTCAAGGCTAAGAAGTC-3 ’
[0024]下游引物:5’ -TTAGACGCACTGGTGGTACC-3 ’
[0025](4)基因克隆:取0.5μ I PCR產物與pMD18-T載體進行連接，操作步驟按照TAKARA公司產品說明書進行。然后連接產物轉化大腸桿菌DH5ci菌株，在表面涂有氨卞青霉素(100 μ g/mL)的LB平板上生長過夜。挑取白色菌落，在LB液體培養基中培養過夜。
[0026](5)質粒DNA的提取:堿法提取質粒DNA。
[0027](6)序列測定:DNA雙脫氧法測定核苷酸序列，在上海生物工程有限公司進行。序列引物為M13啟動子引物。嗜熱毛殼菌CtAA9b基因cDNA全長1041bp，包含起始密碼子和終止密碼子，無內含子，編碼322個氨基酸。將此氨基酸序列在國際基因庫中進行檢索，發現屬于糖苷水解酶第9家族。該序列如下:[0028]⑷SEQ ID NOl 的信息
[0029](a)序列特征:*長度:1041堿基對；*類型:核酸；*鏈型:雙鏈；*拓撲結構:線性
[0030](b)分子類型:DNA
[0031](C)假設:否[0032](d)反義:否
[0033](e)最初來源:嗜熱毛殼菌 Chaetomium thermophilum
[0034](f)序列描述:
[0035]I ATGGTCAAGG CTAAGAAGTC TGCTTTTCTC GCCACCGTCG CTGGTGCCAG CCTCGTTGCT
[0036]61 GCCCACGGCT ATGTCAACGG AATCGTCGTC AACGGCGTCT ACTACAGGAA CTACAACCCC
[0037]121 TCGGTCGACT GGTACCGTGG CAACAACCAG GAGACTCTGA TCGGCTGGAG GGCTGAGAAC
[0038]181 ACGGACAACG GCTTCGTCGA GCCCAACAAG TTCAACACTG CTGACATCAT CTGCCACCGC
[0039]241 CAGGCCGTCA ATGCCAAGGG CTATGCCACC GTCAAGGCCG GCGACAAGAT TAATATCAAG
[0040]301 TGGGACCCAA TCTGGCCTGA GAGCCACGTC GGTCCCGTCA TCGACTACCT TGCCGACTGC
[0041]361 AACGGCGACT GCTCTACAGT CTCCAAGAAC TCCCTTCGGT TCTTCAAGAT CGACGGTGCC
[0042]421 GGCTACGACA AGGCCAAGGG CAAGTGGGCT GCCGATGTCC TCCGTGAAAA TGGCAACAGC
[0043]481 TGGATGGTCC AGATCCCGGC TGACCTGAAG CCCGGTCACT ACGTCCTTCG CCATGAGATC
[0044]541 ATCGCCCTCC ACGGTGCTGC CAACCCCAAT GGCGCTCAGG CCTATCCTCA GTGCATCAAC
[0045]601 ATCAAGGTTG AGGGCAGCGG CAGCAACTCG CCTTCCGGCG TTGCCGGCAC CTCTCTCTAT
[0046]661 ACCGCCMCG ACCCGGGCAT CCTCTTCAAC CCTTGGGTCA GCAACATCGA CTACCCGGTT
[0047]721 CCGGGCCCTG CTCTGATCCC CGGTGCTGTC AGCTCCATCC AGCAGAGCAC CTCGGCCGCT
[0048]781 ACCAGAACCG CCTCAGCCAC CCCTTACGCG GGCGGCGCTG TTCCAACCAC CACTCAGGGC
[0049]841 GGCAGCCAGC CCACTACCAC GGCTCTCCCG ACCACTACCC TCGTCACCAC CACTGCTGTC
[0050]901 CCGATCACCA CTGCTCCTCC GGCTGGCCCT ACTCAGAGCA AGTGGGGACA GTGCGGTGGC
[0051]961 AGCGGCTACA CCGGCCCGAC TCTCTGCGCT CCTGGCTCGA ACTGCCAGGT CATCAACCCC
[0052]1021 TGGTACCACC AGTGCGTCTA A
[0053](B) SEQ ID N02 的信息
[0054](a)序列特征:*長度:322氨基酸；*類型:氨基酸；*鏈型:單鏈；*拓撲結構:線性
[0055](b)分子類型:蛋白質
[0056](C)序列描述:
[0057]I VNGIVVNGVY YRNYNPSVDff YRGNNQETLI GffRAENTDNG FVEPNKFNTA DIICHRQAVN
[0058]61 AKGYATVKAG DKINIKffDPI WPESHVGPVI DYLADCNGDC STVSKNSLRF FKIDGAGYDK
[0059]121 AKGKffAADVL RENGNSWMVQ IPADLKPGHY VLRHEIIALH GAANPNGAQA YPQCINIKVE
[0060]181 GSGSNSPSGV AGTSLYTAND PGILFNPffVS NIDYPVPGPA LIPGAVSSIQ QSTSAATRTA
[0061]241 SATPYAGGAV PTTTQGGSQP TTTALPTTTL VTTTAVPITT APPAGPTQSK WGQCGGSGYT
[0062]301 GPTLCAPGSN CQVINPffYHQ CV
[0063]實施方式3:表達載體的構建
[0064](I)根據分離出的CtAA9b基因的核苷酸序列設計表達引物，在引物的5’端分別引入Ecor I和Not I酶切位點，下游引物引入6個組氨酸序列，作為純化標簽:上游引物:5，-CCGGAATTCCACCACCACCACCACCACGTCAACGGAATCGTCG-3，
[0065](EcorI);下游引物:5’ -TTGCGGCCGCTTAGACGCACTGGTGGTACC-3’
[0066](Not I )(組氨酸序列)
[0067](2)嗜熱毛殼菌總RNA的提取:利用Trizol試劑提取。
[0068](3)反轉錄合成cDNA第一條鏈:取2 μ g總RNA，加入5 X反應緩沖液4 μ L，IOmMdNTP 2 μ L，核糖核酸酶抑制劑(40 — 200ιι/μυ0.5μ?3_ο1?8ο(1Τ(1μ8/μυ?μ?，β轉錄酶(lOu/μ L) 2μ L，42°C反應60min，然后85°C IOmin終止反應，稀釋至200 μ L。
[0069](4)PCR 反應(25 μ L):cDNA2 μ L, 10 X Buffer 2.5 μ L, lOmmol/LdNTP2 μ L, 25mmol/LMgCl2 2 μ L，上、下游弓丨物各 2 μ L，TaqDNA 聚合酶 0.5 μ L (5U/μ L)，ddH20 12 μ L。反應條件為 94°C 5min 預變性；94°C 40s, 57°C 40s, 72°C Im 共 32 個循環，72°C延伸10min，4°C保存。
[0070](5)基因克隆:取2yL PCR產物與pMD18 — T載體進行連接，獲得重組質粒pMD18T/CtAA9b操作步驟按TAKARA公司產品說明書進行。然后連接產物轉化大腸桿菌DH5 α，在涂有AMP的LB平板上生長過夜。挑取白色菌落，在LB液體培養基中培養過夜。
[0071](6)質粒DNA提取:堿法提取質粒DNA。
[0072](7)用Ecor I和Not I對重組質粒pMD18_T/CtAA9b產物進行雙酶切，同時用EcorI和Not I雙酶切酵母表達質粒pPIC9K，DNA膠回收試劑盒回收純化CtAA9b基因及載體PPIC9K片斷。然后進行體外連接，獲得重組質粒pPIC9K/CtAA9b，重組質粒轉化大腸桿菌JM109，在含Amp的LB轉化平板上挑選單菌落，提取質粒DNA，進行PCR和酶切鑒定，測序確認重組質粒的讀碼框正確。
[0073]實施例4.表達糖苷水解酶基因CtAA9b的酵母工程菌株的構建及篩選
[0074](I)重組表達質粒的線性化:將重組表達質粒pPIC9K/CtAA9b用限制性內切酶Sac I線性化。
[0075](2)轉化:電擊轉化酵母菌株Pichia pastoris GS115酵母感受態細胞,轉化方法參見Invitrogen公司畢赤酵母操作手冊。
[0076](3)篩選:用滅菌牙簽挑取轉化子對應點種在麗和MD平板上，30°C培養2 — 4d,挑取在MD/MM平板上均生長良好的轉化子為陽性轉化子。挑取陽性轉化子分別點種于250 μ g/mL,300 μ g/mL,400 μ g/mL,500 μ g/mL,600 μ g/mLG418 的 YPD 平板上篩選多拷貝轉化子。
[0077]實施方式5:畢赤酵母Pichia pastoris GS115的誘導表達和活性檢測
[0078](I)將陽性轉化子接種于含25mL BMGY培養基中，30 °C 250rpm/min搖床培養24h(OD600達2 — 6)，離心收集菌體，將細胞重懸于適當體積的BMMY培養基中，至0D_值為1.0，300C 250rpm/min繼續培養，每24h補充甲醇至終濃度為0.5%，每24h取樣，室溫10，OOOg離心5min，取上清進行SDS-PAGE分析。
[0079](2)酶活性檢測:酶活性測定采用DNS法，反應體系及反應條件為100 μ L的酶液，加入200 μ L的0.5%微晶纖維素，100 μ L的醋酸緩沖液(0.4mol/L、pH5.0)60°C反應30min，加入400 μ L DNS試劑，煮沸lOmin，在540nm波長下測定光吸收值。對照組用失活的酶液做對照。以失活酶液的活性定義為100%，測定糖苷水解酶CtAA9B的相對酶活性。重復三次，取平均值。蛋白含量測定采用Bradford法。[0080](3)重組糖苷水解酶CtAA9B的最適反應溫度、pH及熱穩定性:誘導表達的重組糖苷水解酶經過GE公司的HisTrap FF crude金屬配體親和層析柱純化帶有組氨酸標記的重組蛋白質，獲得電泳均一的純化蛋白，用純化的重組糖苷水解酶測定其性質。在不同溫度和PH條件下分別測定重組糖苷水解酶的對纖維素的酶活力，將最高的酶活力定義為100%，分別計算不同溫度條件下糖苷水解酶的相對酶活性；將重組糖苷水解酶在不同的溫度下保溫30min，檢測剩余酶活力。重復三次，取平均值。
[0081]實施方式6:9家族糖苷水解酶對內切纖維素酶N24活性的促進作用及不同金屬離子對其活性的影響
[0082](I)糖苷水解酶對內切纖維素酶N24活性的促進作用
[0083]采用DNS法，分別測定CtAA9B、N24及混合酶在N24最適反應條件下的內切纖維素酶活性，混合酶為CtAA9B和N24等體積混合，反應體系為:9Β50 μ L，N2450 μ L，200 μ L的
0.5%CMC-Na, 100 μ L 的醋酸緩沖液(0.4mol/L、pH5.0)50°C反應 30min，加入 400 μ L DNS 試劑，煮沸lOmin，在540nm波長下測定光吸收值。以不加糖苷水解酶CtAA9B的反應體系中的酶活性定義為100%，分別計算糖苷水解酶CtAA9B、內切纖維素酶N24以及混合酶的相對酶活性。重復三次，取平均值。
[0084](2)金屬離子Mn2+對糖苷水解酶CtAA9B纖維素酶活性的影響
[0085]在反應體系中加入不同的金屬離子，使其終濃度為lmmol/L，在糖苷水解酶CtAA9B最適反應條件下測定其內切纖維素酶活性，不加金屬離子反應體系中的酶活性定義為100%，計算不同金屬離子條件下糖苷水解酶CtAA9B的相對酶活性。重復三次，取平均值。
[0086](3)金屬離子Mn2+對混合酶活性的影響
[0087]在反應體系中加入不同的金屬`離子，使其終濃度為lmmol/L，在內切纖維素酶N24最適反應條件下測定混合酶的內切纖維素酶活性，不加金屬離子反應體系中的酶活性定義為100%，計算不同金屬離子條件下混合酶的相對酶活性。重復三次，取平均值。
[0088]實施方式7:表達CtAA9b基因的畢赤酵母工程菌株GS-CT-9B的保藏
[0089]表達CtAA9b基因的畢赤酵母工程菌株GS-CT-9B的保藏單位:中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC);地址:北京市朝陽區大屯路，中國科學院微生物研究所；保藏日期:2013年7月19日；酵母工程菌株編號為=CGMCC N0.7943 ;畢赤酵母工程菌株的分類命名為:巴氏畢赤酵母Pichia pastoris。
【權利要求】
1. 一種表達嗜熱毛殼菌Chaetomium thermophilum9家族糖苷水解酶基因CtAA9b的酵母工程菌株，其特征在于該菌為一種畢赤酵母，通過RT-PCR方法從嗜熱毛殼菌Chaetomiumthermophilum獲得熱穩定9家族糖苷水解酶基因CtAA9b,將該基因克隆到畢赤酵母分泌型表達載體PPIC9K，獲得表達重組質粒pPIC9K/CtAA9b，轉化畢赤酵母GSl 15，從中篩選出表達熱穩定糖苷水解酶基因CtAA9b的畢赤酵母工程菌株GS-CT-9B，該糖苷水解酶CtAA9B對內切纖維素酶的活性具有明顯的促進作用。
【文檔編號】C12N15/81GK103484390SQ201310423132
【公開日】2014年1月1日 申請日期:2013年9月17日 優先權日:2013年9月17日
【發明者】李多川, 韓超 申請人:山東農業大學