專利名稱：鹽地堿蓬谷胱甘肽轉移酶(GST)全長cDNA的制作方法
這項發明是從耐海水的鹽地堿蓬中克隆分離的一個編碼谷胱甘肽轉移酶(GST)的全長cDNA(Genbank登錄號為AF321437)，該發明屬于植物分子生物學領域，更確切的說，是編碼堿蓬GST的核苷酸，該基因片段長891個堿基對，其開放讀碼框架(Open ReadingFrame,ORF)為708個堿基對。GST在植物的解毒系統和抗氧化系統中都具有重要的作用。
GST是一個復雜的家族，在細菌、真菌、動物和植物中以多基因家族存在。植物GSTs主要包括Phi、Zeta、Tau、Theta四個家族。GSTs由2個亞基構成，一般形成異源二聚體或同源二聚體行使功能。每個亞基的N端有一個GSH結合位點(G-site),C端有一個底物結合位點(H-site)，與疏水復合物的親電中心結合。植物中還原型谷胱甘肽(GSH)的量很豐富，胞質中可超過1mM。GST(EC2.5.1.18)可催化谷胱甘肽(GSH)中的硫氫鍵發生親核攻擊，與不同的疏水復合物結合，然后由ABC(ATP-binding cassette)轉運蛋白介導運至液泡中，使其變為親水性物質或使其降解，減少有毒物質對細胞造成的傷害。GST同時還具有谷胱甘肽過氧化物酶(GPOX)活性，幾乎所有的脅迫環境均可導致氧脅迫，從而在體內產生大量的活性氧(Reactive Oxygen Species,ROS),ROS會損傷細胞中的生物大分子，造成脂類和蛋白質代謝異常。GST的GPOX活性能使氧脅迫產生的氫過氧化物還原成相應的醇類。研究表明，鹽脅迫可導致氧脅迫，致使細胞中ROS量急劇增加，從而誘導GST的表達量增高，激活脅迫保護反應。另外，氧化型谷胱甘肽(GSSG)的大量積累也可作為信號分子提高了植物的抗逆性。
GSTs大部分存在于胞質中，少量分布在核和質外體中，它廣泛分布在植物發育的不同階段和不同組織中。GST組成了植物蛋白總量的重要部分，約占可溶蛋白總量的1％-2％。至今，已在大豆(Edwards R.,Physiologia Plantarum 98(3)(1996)594-604)、玉米(Wosnick etal.,Gene(Amst)76(1)(1989)153-160；Rossini et al.,Plant Physiology(Rockville)112(4)(1996)1595-1600；Holt et al.,Planta(Heidelberg)196(2)(1995)295-302)、小麥(Edwards et al.,Pestic.Biochem Physiol.(1996)54(2),96-104)、高粱(Hatzios et al.,J.Environ.Sci.Health,Part B(1996),B31(3),545-553)、擬南芥(Van Der Kop et al.,Plant Molecular Biology 30(4)(1996))、甘蔗(Singhal et al.,Phytochemistry(OXF)30(5)(1991)1409-1414)和豌豆(Flury etal.,Physiologia Plantarum 94(1995)594-604)等多種高等甜土植物中分離純化得到谷胱甘肽轉移酶(GST)。玉米中有3個GST基因GST29(Shah et al.,Plant Mol Biol 6,203-211(1986))、GST27(Jepson et al.,Plant Mol Biol 26:1855-1866,(1994))、GST 26(Moore et al.,NucleicAcids Res 14:7227-7235(1986))，其中GST27在煙草中的過量表達使轉基因煙草具有除草劑抗性，該基因已于2000年8月申請了美國專利(專利號為6096504)；之后，在大豆中也分離出具有除草劑抗性的GST酶，并于2001年1月申請了美國專利(專利號為6171839)。在煙草中克隆的編碼GST的cDNA Nt107，該基因在煙草中的過量表達表現出對冷凍和鹽脅迫的抗性。通過基因工程技術可以使植物或動物GST基因在特定的啟動子控制下過量表達以改變植物的表型。例如，Helmer et al.(美國專利號為5073677)利用一個強啟動子在煙草中過量表達小鼠的GST基因；Jepson et al.在玉米的一個強啟動子下表達GST基因，轉基因植物表現出除草劑抗性。
堿蓬基因組DNA的Southern雜交結果表明，GST在堿蓬基因組中至少存在2個以上的拷貝(

圖1)；用400mM的NaCL溶液處理堿蓬48小時后，進行Northern印跡雜交，其GST的表達量明顯高于對照(即不用鹽處理)(圖2)。目前，國內外對GST的研究基本上限于其在解毒系統中的重要作用，本發明主要是體現堿蓬GST基因在耐鹽脅迫中的重要作用，它能夠有效的清除脅迫條件下植物體內產生的自由基，使植物細胞免受其傷害。雖然在多種植物中已分離得到GST酶，但在堿蓬這種耐海水的鹽生植物中克隆分離出GST cDNA尚屬首次。植物GST基因在Genbank中已注冊的有149個(至2000年7月為止)，沒有檢索到堿蓬的GST基因。
在已知該cDNA序列的情況下，可根據該序列設計引物從其它物種中克隆分離GST基因，用GST基因進行轉化得到的轉化體能表現出一系列的表型。有的GST蛋白的產生可以被鹽脅迫、臭氧、SO2、工業污染劑誘導，這說明在植物體中表達外源GST基因可以產生耐逆的轉基因植物。在異源宿主細胞中產生GST蛋白，尤其在微生物中，其獨特的表達系統和有調控序列的表達載體能使該基因進行高水平的表達，在細胞中過量表達該基因可用來制備抗體，這可有效的對生物體中的GST進行原位雜交檢測，也可在離體細胞的提取液中檢測GST的存在。用該基因轉化高等植物，將大大降低環境中的有毒物質對植物體造成的毒害，同時也能明顯提高植物在脅迫條件下的生長能力，增強了植物的耐逆性。另外，谷胱甘肽轉移酶(GST)在醫藥中也具有極其重要的作用，GST是一種能對致癌物去毒的酶，如果其產生變異的話，女性就增加了患乳腺癌的危險。GST基因產生的蛋白質幫助機體把化學反應分子恢復正常，這些化學反應分子可損傷細胞的DNA并啟動癌變之路。
這項發明涉及到的基本的DNA重組技術和分子克隆技術的具體實驗方法可參見《分子克隆》(Sambrook等，1989)，所涉及到的堿蓬中編碼GST的核苷酸片段的序列及相關的多肽已在序列表中列出，其中SEQ ID NO:1是編碼GST cDNA的全長核苷酸序列；SEQ ID NO:2是編碼GST cDNA中開放閱讀框架的一段核苷酸序列；SEQ ID NO:3是SEQ ID NO:2中核苷酸序列的氨基酸序列；SEQ ID NO:4是在原核表達載體中插入的一段含有GST cDNA的核苷酸序列；SEQ ID NO:5是在植物雙元表達載體中插入的一段含有GST cDNA的核苷酸序列。為了明確的進行說明，本說明書帶有附圖，以下是附圖的簡要說明圖1表示以該發明得到的基因片段為探針與基因組DNA的Southern雜交結果；圖2表示以該發明得到的基因片段為探針與不同處理的堿蓬RNA的Northern雜交結果；圖3表示原核表達載體pBV221的多克隆位點；圖4表示真核表達載體pROKⅡ的多克隆位點；圖5表示克隆載體KS的多克隆位點。以下是本發明的實施實例實施例1 堿蓬cDNA文庫的構建及cDNA克隆的分離與測序本發明是以鹽地堿蓬幼苗為材料進行cDNA文庫的構建，堿蓬幼苗用400mM的NaCL溶液處理48小時后，用RNAgent Kit(Promega)提取其地上部分組織的總RNA，用MESSAGEMAKER Kit(GIBCO BRL)分離其mRNA，用cDNA Synthesis Kit(Stratagene)提供的帶有XhoⅠ克隆位點的Oligo-dT引物合成cDNA第一鏈，然后合成第二鏈，cDNA的5’端經RnaseH消化后，用pfu DNA聚合酶削平或補平，與帶有EcoRⅠ克隆位點的adapter連接，然后裝入噬菌體λ-ZAP表達載體的EcoRⅠ和XhoⅠ克隆位點之間，構建噬菌體文庫。文庫由GigapackⅢ Gold(Stratagene)的包裝提取物包裝后，感染大腸桿菌(Escherichia.coli)菌株XLOLR,λ-ZAP表達載體經剪切后得到pBluescript KS質粒，將噬菌體文庫轉化為質粒文庫。從含有四環素(10mg/L)和卡那霉素(25mg/L)的培養基上隨機挑取單克隆提質粒DNA，用標準的T3測序引物進行測序，得到cDNA 5’端的序列，即ESTs(Expressed Sequence Taqs)。通過構建cDNA文庫，得到1000余個ESTs。實施例2 GST cDNA克隆的分離及鑒定采用BLAST同源性分析，分離出編碼堿蓬GST的cDNAs。BLAST(網址為www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)是在BLAST“nr”數據庫中(包括所有非冗余GenBank CDS、具有三維結構的蛋白質數據庫的序列、SWISS-PROT蛋白質序列數據庫、EMBL及DDBJ數據庫)進行同源性搜尋的一種方式。BLASTX(Gish,W.and States,D.J.(1993)Nature Genetics3:266-272)是NCBI(National Center of Biology Information)提供的一種將核甘酸序列的6種翻譯序列與蛋白質數據庫進行比較的一種方式。P值(probability)是被查尋cDNA序列與數據庫中的某一序列相比較的同源性程度，P值越大，其二者的同源性就越大。所有的比較都是由BLASTXnr完成的，通過比較得知，該序列與大豆(Glycine max)中的GST基因的同源性最高。從BLAST結果分析，得知這是一個全長cDNA，并且是正向插入載體的。BLASTX比較結果見表1表1 BLAST結果gb｜AAG34802.1｜AF243367_1(AF243367)glutathione S-transfera… 157 1e-37gh｜AAF15930.1｜AC011765_26(AC011765)putative glutathione S… 150 8e-36gb｜AAG30128.1｜AF288179_1(AF288179)glutathione S-transfera… 148 5e-35gb｜AAG16758.1｜(AY007560)putative glutathione S-transferas… 145 2e-34emb｜CAA09188.1｜(AJ010449)glutathione transferase[Alopecu… 138 4e-32emb｜CAA09187.1｜(AJ010448)glutathione transferase[Alopecu… 135 3e-31＞gb｜AAG34802.1｜AF243367_1(AF243367)glutathione S-transferase GST 12[Glycine max]Length=235Score=157bits(396),Expect=1e-37Identities=78/140(55％),Positives=100/140(70％)Frame=+1Query:43 MAEERSVKLYGTWSSPYVLRVKLALKIKGIEYDYFEEDLANKSELLLQYNPVYKRVPVLV 222MAE+ V L+G W+SPY RV+LAL KGI Y+Y EEDL NKS+LLL+YNPV+K+VPVLVSbjct:1 MAEQDKVILHGMWASPYAKRVELALNFKGIPYEYVEEDLRNKSDLLLKYNPVHKKVPVLV 60Query:223 HNGLPISESSVILEYIDETWTDPPHLLPKDPYLRAKHRFWAAYLQQVAEMFGTSLVLKSQ 402HNG I+ES VILEYIDETW D P LLP D Y RA+ RFW ++QM T LV+K+Sbjct:61 HNGKAIAESMVILEYIDETWKDGPKLLPSDSYKRAQARFWCHFIQDQL-MESTFLVVKTD 119Query:403 GKDIEDVVNEYWNKMDVAEE 462G+ + ++ + K+ V E+Sbict:120 GEAQQKAIDHVYEKLKVLED 139實施例3嵌合基因在微生物中的表達在微生物細胞中過量表達原核表達框架嵌合基因，可以得到大量的GST蛋白。首先應構建原核表達框架，對該基因所在的原始質粒選擇合適的酶切位點，同時對原核表達載體也進行同樣的酶切消化，將基因片段正向插入消化后的載體，用連接酶連接。連接產物用來轉化大腸桿菌菌株XLI-Blue(Escherichia.coli XLI-Blue,Stratagene)，轉化體用相同的限制性內切酶進行酶切驗證，或者用合適的引物進行PCR驗證。本發明所涉及到的原核表達載體是pBV221熱激表達載體(多克隆位點圖譜見圖3)，先用BamHⅠ單切pBV221載體，用T4 DNA聚合酶將其削為平端，再用EcoRⅠ酶切，回收載體大片段，對克隆到的含GST基因的重組質粒用EcoRⅠ和SmaⅠ雙酶切，回收900bp左右的小片段，用T4 DNA連接酶于16℃連接過夜，轉化大腸桿菌菌株XLI-Blue，得到pBV221重組質粒。提取蛋白，經10％SDS-PAGE凝膠電泳分析，結果表明有一條特異的50Kda左右的蛋白條帶，推測該帶為表達的外源GST蛋白。在該項實施中，也可利用其它的原核表達載體進行重組轉化，均可獲得大量表達的GST蛋白，可以用來制備抗體，可有效的對生物體中的GST進行原位雜交檢測；同時，GST蛋白也可應用到制藥中。實施例4 嵌合基因在雙子葉植物中的表達面對目前地球上可耕地面積的逐漸減少，而不利于作物生長的鹽堿地卻在日益增加，為充分利用大面積的鹽堿地，就要求有耐鹽堿的轉基因植株培育成功。植物雙元表達載體包括右邊界區、nos啟動子、NPTⅡ報告基因、nos終止子、35S啟動子、左邊界區，外源基因與花耶菜花葉病毒的35S啟動子相連。本實驗所涉及到的植物表達載體為pROKⅡ(多克隆位點圖譜見圖4)，為使外源基因正向插入pROKⅡ載體，先將基因片段以XhoⅠ和EcoRⅠ克隆位點插入KS載體(多克隆位點圖譜見圖5)中，再利用KS多克隆位點上的KpnⅠ和XbaⅠ位點雙切下外源片斷，正向插入pROKⅡ載體的相應位點，連接在16℃下反應過夜，連接產物用相應的限制性內切酶進行酶切驗證。將pROKⅡ重組質粒用三親雜交法(Ruvkin andAusubel,Nature 289:85-88,(1981))轉化農桿菌(Agrobacterium)菌株LBA4404(Hoekema et al.Nature 303:179-180,(1983)，在28℃YEB培養基中培養農桿菌細胞，37℃在LB培養基中培養供體細胞，然后在沒有抗生素的YEB中混合這兩種細胞，于28℃過夜培養，在有抗生素的LB平板上劃板，用堿裂解法提質粒驗證。另外，也可用葉盤轉化法(Horsch et al.Science227:1229-1231,(1985)或原生質體轉化法(van den Elzen et al.Plant Mol.Biol,5:149-154(1985)進行轉基因植株的構建。利用這些方法使GST cDNA轉入黃瓜、番茄等蔬菜及其它雙子葉植物，通過篩選抗卡那霉素轉化體得到具有一定抗逆性的轉基因植株，使其在鹽堿地帶或用海水灌溉的土壤中能夠正常生長。實施例5 嵌合基因在單子葉植物中的表達單子葉植物的轉化體系不同于雙子葉植物，常采用基因槍直接注射法將基因擊到植物的葉片里，也可利用pCAMBIA 1300載體系統通過農桿菌介導的直接轉化體系進行轉化，它具有雙元載體的一切優點。用EcoRⅠ和XbaⅠ分別酶切原始質粒和pCAMBIA 1300載體，T4DNA連接酶將外源片段與載體片段于16℃下反應過夜，連接產物轉化農桿菌LBA4404。這樣構建的重組體包括目的片段和相應的啟動子，利用葉盤轉化法，將GST cDNA轉化一些農作物如水稻、玉米、小麥等谷類作物，可以得到耐逆的轉基因植株作物；另外，冬季里由于大量降雪，公路上噴灑大量的鹽水，可能會導致附近土壤的鹽度增大，影響了草坪類植物的種植，因此，可以將GST cDNA直接進行基因槍轉化，能夠獲得抗鹽脅迫的草坪種類。序列表(1)一般信息(a)申請人山東師范大學(b)發明人趙彥修 王麗萍 張慧(c)發明名稱鹽地堿蓬谷胱甘肽轉移酶(GST)全長cDNA(d)序列數目891堿基對(e)通信地址*地址山東師范大學生物系*街道文化東路88號*城市濟南*國家中國*郵編250014(f)本申請數據*申請日2001.2*分類C07K(g)通訊信息*電話0531-2960864*傳真0531-2966954(2)SEQ ID NO:1的信息(a)序列特征*長度891堿基對*類型核酸*鏈型雙鏈*拓撲結構線性(b)分子類型cDNA(c)最初來源鹽地堿蓬(d)序列描述SEQ ID NO:11 ggcacgaggg agagagagag caactaactg tctaacagag gaatggcaga ggagaggtca61 gtgaagctat atggaacgtg gtcaagtcct tatgtgttga gggtaaaact tgcccttaaa121 ataaagggta ttgagtatga ttatttcgag gaagatctag ccaacaaaag cgagttactc181 ttacaataca accctgtata caagagagtt cctgtacttg tgcataatgg gctaccgatt241 tcagagtcat cagtcattct tgaatacatc gatgagactt ggactgaccc tccacatctc301 ttgcctaagg atccatacct aagggctaaa catcgcttct gggctgccta cttacaacag361 gtagcagaga tgttcggtac ttcattagtg ctaaagtcac aaggtaaaga catagaggat421 gtcgtgaatg agtactggaa caagatggat gtagctgaag aattgataag ggaaacattc481 ccatacaatg aaattccatg tttcaaagac actataaagc ctggatactt ggacataata541 ctatattctc tggtgggaac ctctgatgct tcagaagaac tattcgggtt taagcctttt601 attcctgaaa ggtatccact attggcatca tggaccaagg cattgagtga agttcctgag661 gtcaaagaag tgactccacc taaggataag ttgattgagc ttcttcgtac tattcgccaa721 atgtaccttc catcggcacc taaggcttag agttgtgctg cttgaataaa gcccctggtg781 ctatgttatt atgggtggca cttgtacaat aataatcatg tttagaaaat ttcaacatca841 ttcgctggta tgaaaattta aacttctgtc ctgaaaaaaa aaaaaaaaaa a(3)SEQ ID NO:2的信息(a)序列特征*長度708堿基對*類型核酸*鏈型雙鏈*拓撲結構線性(b)分子類型cDNA(c)最初來源鹽地堿蓬(d)序列描述SEQ ID NO:21 atggcagagg agaggtcagt gaagctatat ggaacgtggt caagtcctta tgtgttgagg61 gtaaaacttg cccttaaaat aaagggtatt gagtatgatt atttcgagga agatctagcc121 aacaaaagcg agttactctt acaatacaac cctgtataca agagagttcc tgtacttgtg181 cataatgggc taccgatttc agagtcatca gtcattcttg aatacatcga tgagacttgg241 actgaccctc cacatctctt gcctaaggat ccatacctaa gggctaaaca tcgcttctgg301 gctgcctact tacaacaggt agcagagatg ttcggtactt cattagtgct aaagtcacaa361 ggtaaagaca tagaggatgt cgtgaatgag tactggaaca agatggatgt agctgaagaa421 ttgataaggg aaacattccc atacaatgaa attccatgtt tcaaagacac tataaagcct481 ggatacttgg acataatact atattctctg gtgggaacct ctgatgcttc agaagaacta541 ttcgggttta agccttttat tcctgaaagg tatccactat tggcatcatg gaccaaggca601 ttgagtgaag ttcctgaggt caaagaagtg actccaccta aggataagtt gattgagctt661 cttcgtacta ttcgccaaat gtaccttcca tcggcaccta aggcttag(4)SEQ ID NO:3的信息(a)序列特征*長度235氨基酸*類型氨基酸*鏈型單鏈*拓撲結構線性(b)分子類型肽(c)最初來源鹽地堿蓬(d)序列描述SEQ ID NO:3Met Ala Glu Glu Arg Ser Val Lys Leu Tyr Gly Thr Trp Ser Ser510 15Pro Tyr Val Leu Arg Val Lys Leu Ala Leu Lys Ile Lys Gly Ile20 25 30Glu Tyr Asp Tyr Phe Glu Glu Asp Leu Ala Asn Lys Ser Glu Leu35 40 45Leu Leu Gln Tyr Asn Pro Val Tyr Lys Arg Val Pro Val Leu Val50 55 60His Asn Gly Leu Pro Ile Ser Glu Ser Ser Val Ile Leu Glu Tyr65 70 75Ile Asp Glu Thr Trp Thr Asp Pro Pro His Leu Leu Pro Lys Asp
80 8590Pro Tyr Leu Arg Ala Lys His Arg Phe Trp Ala Ala Tyr Leu Gln95 100 105Gln Val Ala Gln Met Phe Gly Thr Ser Leu Val Leu Lys Ser Gln110 115 120Gly Lys Asp Ile Glu Asp Val Val Asn Glu Tyr Trp Asn Lys Met125 130 135Asp Val Ala Glu Glu Leu Ile Arg Glu Thr Phe Pro Ile Asn Glu140 145 150Ile Pro Cys Phe Lys Asp Thr Ile Lys Pro Gly Tyr Leu Asp Ile155 160 165Ile Leu Tyr Ser Leu Val Gly Thr Ser Asp Ala Ser Glu Glu Leu170 175 180Phe Gly Phe Lys Pro Phe Ile Pro Glu Arg Tyr Pro Leu Leu Ala185 190 195Ser Trp Thr Lys Ala Leu Ser Glu Val Pro Glu Val Lys Glu Val200 205 210Thr Pro Pro Lys Asp Lys Leu Ile Glu Leu Leu Arg Thr Ile Arg215 220 225Gln Met Tyr Leu Pro Ser Ala Pro Lys Ala230 23權利要求
1．一種分離純化的編碼谷胱甘肽轉移酶(GST)cDNA的核苷酸片段，包括(a)編碼氨基酸序列的核苷酸片段，其特征是具有SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ IDNO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5所示的序列，(b)與(a)互補的核苷酸片段；
2．權利要求1中的核苷酸片段與相應的原核表達載體構成的重組質粒；
3．權利要求1中的核苷酸片段與相應的真核表達載體構成的重組質粒；
4．一個大腸桿菌細胞，其特征是，權利要求2中的重組質粒轉化該細胞；
5 一個農桿菌細胞，其特征是，權利要求3中的重組質粒轉化該細胞；
6．一個雙子葉植物細胞，其特征是，權利要求5中的農桿菌細胞轉化該植物細胞；
7．一個單子葉植物細胞，其特征是，權利要求5中的農桿菌細胞轉化該植物細胞，或者利用基因槍直接轉化法轉化該植物細胞；
8．一種使GST在宿主細胞中過量表達的方法，包括(a)宿主細胞直接轉化權利要求2和3中的質粒的方法，(b)一種農桿菌介導的轉化植物細胞的方法，(c)一種利用基因槍的直接轉化法；
9．一種獲得編碼谷胱甘肽轉移酶(GST)的cDNA的核苷酸片段的方法(a)cDNA文庫的構建方法，(b)挑取隨機克隆進行BLAST同源性分析以確定GST的方法，(c)GST cDNA全長序列的測定方法。
全文摘要
該發明名稱是鹽地堿蓬(Suaeda salsa)谷胱甘肽轉移酶(glutathione S－transferase,GST)全長cDNA,本發明屬于植物分子生物學領域。該基因產物在生物體的解毒系統和抗氧化系統中都具有重要的作用。該發明涉及到兩個嵌合基因的構建,分別帶有原核表達啟動子和真核表達啟動子;還涉及到轉化這兩個嵌合基因的宿主細胞及重組轉化的方法;同時,也提供了使GST過量表達的轉基因植株的構建方法。
文檔編號C12N15/70GK1314484SQ0110409
公開日2001年9月26日 申請日期2001年2月23日 優先權日2001年2月23日
發明者趙彥修, 王麗萍, 張慧 申請人:山東師范大學