一種堿性熱穩定酯酶K91 Est8及其基因的制作方法
【專利摘要】本發明提供了一種來源于耐熱芽孢桿菌（Bacillussp.）的酯酶K91Est8，本發明還提供了上述酯酶的編碼基因K91Est8及其重組載體和重組菌株。本發明的酯酶具有以下性質：最適溫度50℃；最適pH9.0；在37℃和50℃下保溫60min，酶活分別保持在85%和40%以上；經pH9.5的硼砂-NaOH緩沖液在37℃下處理60min后，仍能保持40%以上的活性；具有良好的熱穩定性和耐堿性。除乙酸-4-硝基苯酯為其最適水解底物外，還可以水解α-乙酸萘酯、β-乙酸萘酯、4-硝基苯丁酸酯、己酸4-硝基苯酯和4-硝基苯基辛酸酯，可應用于農藥殘留或農藥污染治理等方面。
【專利說明】—種堿性熱穩定酯酶K91 Est8及其基因
【技術領域】
[0001]本發明涉及基因工程【技術領域】，具體地說是一種耐熱芽孢桿菌來源的酯酶K91Est8及其基因。
【背景技術】
[0002]酯酶(esterase, EC 3.1.1.1)是一類能夠催化酯鍵水解和形成的酶類，廣泛分布于動物、植物和微生物中(Melloney J, et al., Journal of Molecular CatalysisB: Enzymatic.2005, 32: 261-270)。酯酶能夠水解或者合成酰基鏈長度小于10的水溶性的甘油酯類，而脂肪酶一般以酰基鏈長度大于等于10個碳原子的甘油酯為底物，不過大多數脂肪酶也能水解酯酶的底物。大部分酯酶屬于典型的α/β水解酶超家族，含有典型的GxSxG的保守序列，其中在S(serine)位點構成了一個serine-aspartate-histidine的催化三聯體結構(Kakugawa S，et al., Appl Microbiol Biotechnol.2007, 74: 585 -591)。此外，還有一類酯酶序列中含有不同于傳統GxSxG的保守序列、其含有獨特的GDSL的保守序列，是一類新家族的酯酶。⑶SL家族的酯酶含有5段保守序列區(five consensussequence blocks I_V),在5段保守序列區中含有4個較保守的催化位點Ser, Gly, Asn和His,因此又可以分為 SGNH 亞家族酯酶(John M, et al., The Journal of BiologicalChemistry.·2013, 288: 2605-2613)。本發明的酯酶K91 Est8 屬于⑶SL 酯酶家族中 SGNH亞家族酯酶。
[0003]酯酶是一種重要的工業酶類，在催化酯水解、酯合成、酯交換等過程中有重要應用價值，具有良好的區域選擇性和立體選擇性(Ramos Tombo, et al., Agricultural andBiological Chemistry.1987, 51: 1833-1838)。目前已從鏈霉菌屬(Sire/--ο焊cessp.)、假單胞菌屬 iPseudomonas sp.)、乳桿菌屬(Xactobacillus sp.)、微球菌屬{Micrococcus sp.)等微生物中克隆到酯酶基因，已經應用于食品、化工、洗漆、皮革、紙張等工業中，主要用于水解反應。此外，酯酶還被應用于制藥、染料、殺蟲劑和殺菌劑等工農業廢水中硝基苯酚類毒性污染物的降解，在生物【技術領域】扮演著極其重要的角色(JaegerK.E, et al., Trends in Biotechnology.1998, 16(9): 396-403)。
[0004]然而，天然菌株產酶低、難以大量生產，生產成本高，限制了其推廣應用，且從微生物中克隆到的酯酶也仍然較少，難以滿足食品、化工等工業快速發展，以及環境可持續、健康發展的需求。此外，一般酯酶由于穩定性差，易失活，也限制了其廣泛利用。嗜熱及耐熱菌來源的酯酶由于在高溫和有機溶劑中很好的穩定性，不僅可以延長酯酶的使用時間，還能擴大其應用范圍，已成為生物技術應用領域關注的焦點。因此，開發在高溫環境下具有較高催化活力的酯酶應用于工業領域，有很好的前景和價值，也有利于研究酯酶的催化機制。

【發明內容】

[0005]本發明的目的是提供一種堿性熱穩定酯酶K91 Est8。
[0006]本發明的再一目的是提供編碼上述酯酶的基因。[0007]本發明的另一目的是提供包含上述基因的重組載體。
[0008]本發明的另一目的是提供包含上述基因的重組菌株。
[0009]本發明從耐熱芽孢桿菌K91基因組中克隆到酯酶基因似7 訪，屬于⑶SL酯酶家族中的SGNH-serine水解酶亞家族。K91 Est8與表達載體pEASY?_E2連接后，轉化到大腸桿菌BL21(DE3)中誘導表達并對其酶學性質進行了初步研究，為進一步研究酯酶K91 Est8對農藥的降解奠定了理論基礎。
[0010]本發明所述酯酶K91 Est8可得自芽抱桿菌sf)，如Bacillus sp.ATCC 31072，K91 Est8的氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示。
[0011]本發明的酯酶K91 Est8總共含有217個氨基酸，理論分子量為24.52kDa，包含其C端的6個HIS組氨酸標簽，總分子量大小約為25.35kDa。以乙酸-4-硝基苯酯(pNPC2)S底物:最適溫度50°C ;最適pH 9.0 ;在37°C和50°C下保溫lh，酶活分別保持在85%和40%以上；在？117.5 - pH9.5的范圍內處理Ih后，仍能保持40%以上的活性；具有很好的堿耐受性和熱穩定性。
[0012]本發明提供了編碼上述酯酶的基因K91 Est8,該基因序列如SEQ ID N0.2所示。
[0013]本發明通過PCR方法克隆了熱穩定性酯酶基因似7 &訪，其全長654bp，起始密碼為ATG，終止密碼為TGA。經BLAST 比對，該酯酶基因似2 &訪編碼的氨基酸序列與GeneBank 中 Clostridium thermocellum ATCC27405 來源的酯酶(ΥΡ_001039529.I)具有最高的一致性，為 61% ?，與Acetivibrio cellulolyticus 來源的酯酶(WP_010243524.1)有55% 一致性；與 Streptomyces sp.PAMC26508 來源的酯酶(YP_007863706.1)有 44% 的一致性。說明堿性熱穩定酯酶Κ91 EstS是一種新的酯酶。
[0014]本發明還提供了包含上述熱穩定性酯酶基因似2 &訪的重組載體，優選為pEASY?-E2-7 Est8。將本發明的酯酶基因與pEASY?_E2進行T-A連接，使其核苷酸序列與表達調控序列相連接，得到重組大腸桿菌表達質粒pEASY?-E2- K91 Est8。
[0015]本發明還提供了包含上述酯酶基因似2 &訪的重組菌株，優選所述菌株為大腸桿菌、酵母菌、芽孢桿菌或乳酸桿菌，優選為重組菌株BL21 (DE3)/ K91 Est8。
[0016]本發明制備酯酶K91 EstS的方法按以下步驟進行:
1)用上述的重組載體轉化宿主細胞，得重組菌株；
2)培養重組菌株，誘導重組酯酶表達；
3)回收并純化所表達的酯酶K91Est8。
[0017]其中，優選所述宿主細胞為大腸桿菌細胞，優選將重組大腸桿菌表達質粒轉化大腸桿菌細胞BL21 (DE3)，得到重組菌株BL21 (DE3)/ K91 Est8。
[0018]本發明提供了一個新的酯酶基因，其編碼的酯酶以PNPC2為底物:最適溫度50°C ；最適pH 9.0 ;在37°C和50°C下保溫lh，酶活分別保持在85%和40%以上；在ρΗ7.5 - pH9.5的范圍內處理Ih后，仍能保持40%以上的活性；具有很好的堿耐受性和熱穩定性。此外，酯酶Κ91 EstS也能夠水解α -乙酸萘酯、β -乙酸萘酯、4-硝基苯丁酸酯(pNPC4)、己酸4_硝基苯酯(PNPC6)和4-硝基苯基辛酸酯(PNPC8)等；可應用于農藥殘留或農藥污染治理方面。在高溫環境下具有較高催化活力的酯酶應用于工業領域，有很好的前景和價值。
【專利附圖】

【附圖說明】[0019]圖1:在大腸桿菌中表達的重組酯酶K91 Est8的SDS-PAGE分析，其中，M:低分子量蛋白質Marker ；1:BL21 (DE3)/似7 誘導后表達的總蛋白；2:純化前的重組酯酶K91Est8 ；3:純化后含6個HIS標簽的重組酯酶K91 Est8。
[0020]圖2:重組酯酶K91 Est8的最適溫度。
[0021]圖3:重組酯酶K91 Est8的熱穩定性。
[0022]圖4:重組酯酶K91 Est8的最適pH。
[0023]圖5:重組酯酶K91 Est8的pH穩定性。
[0024]圖6:lmM金屬離子及部分化學試劑對重組酯酶K91 Est8活性的影響。
[0025]圖7 =IOmM金屬離子及部分化學試劑對重組酯酶K91 Est8活性的影響。
[0026]圖8: 1%和5%終濃度有機溶劑對酶活的影響。
[0027]圖9:重組酯酶K91 Est8以pNPC2為底物時的動力學。
【具體實施方式】
[0028]實驗材料和試劑
1、菌株及載體:芽孢桿菌(也sp.)同文獻報道菌種性質，如sp.ATCC31072 ;大腸桿coli BL21 (DE3)購于Novagen公司；表達載體pEASY?_E2購于全式金生物有限(TransGen)公司。
[0029]2、酶類及其它生化試劑:限制性`內切酶、DNA聚合酶和dNTP購自TaKaRa公司；T4連接酶購自PiOmega公司；堅固藍B、α -乙酸萘酯、β -乙酸萘酯、4_硝基苯丁酸酯(PNPC4),己酸4-硝基苯酯(PNPC6)和4-硝基苯基辛酸酯(PNPC8)購自Sigma公司；其它試劑均購自國藥集團。
[0030]3、培養基:
LB培養基:胰蛋白胨1%，酵母粉0.5%，氯化鈉1%，pH自然(約為7.0)。固體培養基在此基礎上加2.0% (w/v)瓊脂。
[0031]說明:以下實施例中未作具體說明的分子生物學實驗方法，均參照《分子克隆實驗指南》(第三版)J.薩姆布魯克一書中所列的具體方法進行，或者按照試劑盒和產品說明書進行。
[0032]實施例1:酯酶基因K91 Es訪的克隆
采用天根細菌基因組提取試劑盒(DP302)提取芽孢桿菌K91基因組DNA。
[0033]根據芽孢桿菌K91全基因組測序及基因注釋分析酯酶基因似2 訪并設計表達引物CarF和CarR:
上游引物 CarF: 5，-GCAAATCATATTTATCTTGC - 3，
下游引物 CarR: 5’ -CCTTTCTTTG ATGATCGATT C-3’
上游引物 17: 5 ’ -TAATACGACTCACTATAGGG -3，
下游引物 17 ter: 5’-TGCTAGTTATTGCTCAGCGG-3’
T7和T7 ter為PCR檢測陽性克隆子引物。
[0034]以耐熱芽孢桿菌K91基因組DNA為模板進行PCR擴增，PCR反應參數為:95°C預變性5 min ;然后95°C變性30 sec ；57 °C退火(每個循環降0.5°C )30 sec ；72 °C延伸I min ;30個循環后95°C變性30 sec ；43 °C退火30sec ;72°C延伸I min ;7個循環后72 °C保溫IOmin0取4yL PCR產物與I μ L表達載體pEASY?_E2進行T-A連接，25°C連接lOmin，連接產物全部轉入Trans-1感受態細胞中，37 1:溫箱過夜培養。從轉化板上挑取幾株單菌落，使用引物(本基因上游引物，T7ter)進行菌落PCR擴增篩選正向連接的陽性克隆子。對菌落PCR驗證正確的克隆子采用T7和T7 ter引物測序，由北京華大基因測序完成。測序正確的陽性克隆子接種提取質粒pEASY?-E2-似7 &訪，取0.0luL pEASY?-E2-似7 訪質粒轉化到100 uL BL21(DE3)表達感受態細胞中，涂布于含Amplr的LB固體平板上，37 °C溫箱過夜培養，從轉化板上挑取幾株單菌落，進行菌落PCR擴增篩選陽性克隆子，從而獲得重組大腸桿菌菌株BL21(DE3)/似7 Est8。
[0035]實施例2:重組酯酶K91 Est8的制備
取含有重組質粒pEASY?-E2-似7 Est8的BL21 (DE3)菌株和只含有pEASY?_E2的空質第LBL210E3)菌株，以0.1%的接種量接種于LB (含100 ug/mL Amplr)培養液中，37 °C快速振蕩16 h。然后將此活化的菌液以1%接種量接種到新鮮的LB (含100ug/mL Amplr)培養液中，快速振蕩培養約2 - 3 h(OD6tltl達到0.4-0.7)后，加入終濃度0.7 mM的IPTG進行誘導，于20°C繼續振蕩培養約20 h。12000 rpm離心10 min，收集菌體。用適量的pH 7.0檸檬酸-Na2HPO4緩沖液懸浮菌體后，于低溫水浴下超聲波破碎菌體。以上胞內濃縮的粗酶液經12, 000 rpm離心10 min后，吸取上清并用Nickel-NTA Agarose純化目的蛋白。SDS-PAGE結果(圖1)表明，重組酯酶在大腸桿菌中得到了表達，經Nickel-NTA Agarose純化后為單一條帶。
[0036]實施例3:純化的重組酯酶K91 Est8的性質測定 1、重組酯酶K91 Est8的活性分析
純化的重組酯酶K91 Est8采用對硝基苯酹法(/7-nitrophenol)進行活性測定:取4只
·1.5mL離心管,分別編號1、2、3、4，其中1、2、3號試管為實驗組(3個重復),4號為對照組。向四只離心管中分別加入420 μ L ρΗ8.0的50mM Tris-HCL緩沖液和30 μ L IOmM底物pNPC2,37°C預熱5min后，每隔IOs分別向1、2和3號管中加入50 μ L稀釋適當倍數的酶液，4號對照管加等量水，37°C反應5min后每隔IOs向1、2、3實驗管中加入50 μ L 0.1M Na2CO3終止反應，4號對照管同樣加入等體積終止液后立即將4只離心管插到冰上，酶標儀405nm讀取OD值。I個酶活單位(U/mL)定義為一定條件下，每分鐘分解底物PNPC2生成I μ moL對硝基苯酚所需要的酶量。以pNPC4、pNPC6、pNPC8、α -乙酸萘酯和β -乙酸萘酯為底物測定方法及酶活力計算同PNPC2。
[0037]2、重組酯酶Κ91 Est8的最適溫度和熱穩定性的測定
酶的最適溫度測定:將重組酯酶K91 Est8在50mM pH9.0的Tris-HCL緩沖液條件下，分別在 20 0C >30 °C、37°C、40 °C >45 °C >50 °C、55°C、60 °C、70°C、80°C、90°C、95°C下進行酶促反應。溫度穩定性的測定:將重組酯酶K91 Est8在50mM pH9.0的Tris-HCL緩沖液條件下,在37°C、50°C和60°C三個溫度下分別保溫5min、10 min,20 min,30 min和60 min后進行酶促反應，以未處理的酶液作為對照。以PNPC2為底物，反應5 min,測定重組酯酶K91Est8的酶學性質。結果表明:K91 Est8的最適溫度50°C，但此酶在37°C時也具有80%以上的活性(圖2) ；37 °C下保溫Ih后，酶活性保持在85%以上，50°C和60°C保溫lh，酶活仍保持在35%以上(圖3)。
[0038]3、重組酯酶K91 Est8的最適pH和pH穩定性的測定酶的最適pH的測定:將酯酶K91 Est8在37°C，分別在1/15 mo I/L磷酸氫二鈉-磷酸二氫鉀緩沖液不同 ρΗ6.5、7.0、7.5 ；50mM Tris-HCL 緩沖液不同 ρΗ7.5、8.5、8.8、9.0、9.3、9.5 ；50mM硼砂-NaOH緩沖液不同pH9.5、10.0、11.0、12.0條件下進行酶促反應。pH穩定性的測定:將重組酯酶K91 Est8用ρΗ2.0、4.0、5.0的0.1M檸檬酸-Na2HPO4緩沖液；ρΗ6.5、
7.0,7.5 的 1/15 mo I/L 磷酸氫二鈉-磷酸二氫鉀緩沖液；pH7.5,8.5,8.8,9.0,9.3,9.5 的50mM Tris-HCL緩沖液；pH9.5,10.0,11.0,12.0的50mM硼砂-NaOH緩沖液稀釋適當倍數后分別在37°C下耐受60 min后進行酶促反應，以未處理的酶液作為對照。以pNPC2為底物，反應5 min，測定純化的重組酯酶K91 Est8的酶學性質。結果表明:K91 Est8的最適pH為9.0 (圖 4) #5ρΗ7.5、8.5、8.8、9.0、9.3、9.5 的 50mM Tris-HCL 緩沖液；ρΗ9.5 硼砂-NaOH緩沖液37°C條件下處理60min后仍然保持40%以上的活性(圖5)，說明重組酯酶K91 EstS具有很好的堿耐受性。
[0039]4、不同金屬離子及化學試劑對重組酯酶K91 Est8活性的影響
在酶促反應體系中加入終濃度I mM和10 mM的金屬離子及化學試劑，研究其對酶活性的影響。以PNPC2為底物，在50°C，pH9.0條件下，反應5 min，測定純化的重組酯酶K91Est8的酶活力。結果(圖6)表明，終濃度I mM的金屬離子Co2+、K1+、Na1+、Al3+、Li2+、Ba2+、Zn2+、Ca2+、Cu2+、終濃度I mM化學試劑EDTA、CTAB, urea、終濃度1%的有機溶劑Tween-80、TritonX-100、ethanol、cyclohexane、n-hexane、isopropanol 和終濃度 5% 的 Tween-80 對酶有較強的激活作用；Fe3+對酶有輕微的促進作用；1 mM的Ni2+、Mn2+、Fe2+、Ag+、DTT、SDS’終濃度 10 mM 的 K1+、Na1+、Li2+、Mg2+、Ni2+、SDS、urea，終濃度 1% 的 DMS0、methanol 和終濃度5% 的 DMS0、methanol、ethanol、cyclohexane、isopropanol 對酶有一定的抑制作用；10 mM的Hg2+、CTAB、DTT和終濃度5%的TritonX-100、n-propanol對酶有較強的抑制作用(圖7);ImM 的 Mg2+、Hg2+、urea, 10 mM 的 EDTA, 1% 的 n_propanol、5% 的 n-hexane、n-propanol 對酶幾乎無影響(圖8)。
.[0040]5、重組酯酶K91 Est8的動力學參數的測定
在50°C，pH9.0條件下，以PNPC2為底物，依次在酶促反應的1_10 min內終止反應并測定酶活性，計算出酶活性與反應時間的比值，若在一定時間內該比值保持穩定，則此時間為一級反應時間。用0.1mM-L 2mM的PNPC2為底物([S])，在50°C，pH9.0和一級反應時間下測定酶活，計算出相應的反應速度(V )，如圖9,根據Lineweaver-Burk方法測定心?和Vmax0經測定，在50°C，pH9.0條件下，重組酯酶K91 Est8對乙酸_4_硝基苯酯(pNPC2)的心?和Vmax 分別為 0.1882mM 和 117.647U/mg。
[0041]6、重組酯酶 K91 Est8 對底物 pNPC2、pNPC4、pNPC6、pNPC8 水解
在 50°C，ρΗ9.0 條件下，重組酯酶 Κ91 Est8 對 IOmM 的 pNPC2、pNPC4、pNPC6、pNPC8 的比活力分別為 45.382U/mg、l.317U/mg、0.131U/mg、0.033U/mg。
【權利要求】
1.一種堿性熱穩定酯酶K91 Est8，其特征在于:它具有SEQ ID N0.1所示的氨基酸序列。
2.—種編碼權利要求1所述的酯酶基因似2 &訪，其特征在于其核苷酸序列如SEQ IDN0.2所示。
3.一種包含權利要求2所述酯酶基因似7 的重組載體。
4.一種包含權利 要求2所述酯酶基因似7 的重組菌株。
【文檔編號】C12N1/19GK103436506SQ201310426998
【公開日】2013年12月11日 申請日期:2013年9月18日 優先權日:2013年9月18日
【發明者】黃遵錫, 丁俊美, 于婷婷, 謝振榮, 李俊俊, 周峻沛 申請人:云南師范大學