專利名稱：抗人磷酸二酯酶4d相互作用蛋白變體5的單克隆抗體及其應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及含有抗體的醫藥配制品，或單克隆抗體的制備，具體是一種抗人磷酸二酯酶4D相互作用蛋白變體5的單克隆抗體及其應用。
背景技術：
Myomegalin(MMG/MMGL/PDE4DIP, phosphodiesterase 4D interacting protein, 磷酸二酯酶4D相互作用蛋白)是一種嶄新的蛋白，它分布于胞漿中，并在高爾基體和中心體處聚集，提示該分子的主要功能涉及這兩個細胞器的cAMP信號轉導。Myomegalin基因很長，約15萬堿基對,但是其每個外顯子都很小,大約只有30-40氨基酸，因此Myomegalin的變體很多。目前尚不清楚具體有多少個Myomegalin的變體存在。Myomegalin蛋白結構中含有α螺旋和coiled-coil結構，以及微管相關蛋白結合域和亮氨酸拉鏈模式。Myomegalin還被稱作Η)Ε40ΙΡ,這是由于該蛋白可以結合循環中的 TOE4D(核苷酸磷酸二酯酶)。在腫瘤性疾病中能夠見到Myomegalin的異常表現。骨髓增生異常的病人中可以檢測出PDE4DIP-PDGFRB融合基因。在食管腫瘤中可以見到Myomegalin 變體5蛋白的高表達。變體I蛋白則在大多數的腫瘤細胞中缺失。由此可見，Myomegalin 變體與腫瘤的關系尚未完全闡明，值得進一步研究。1975年，Kohler和Milstein發現將小鼠骨髓瘤細胞和綿羊紅細胞免疫的小鼠脾細胞進行融合，形成的雜交細胞既可產生抗體，又可無限增殖，從而創立了單克隆抗體雜交瘤技術。這一技術上的突破不僅為醫學與生物學基礎研究開創了新紀元，也為臨床疾病的診斷、預防、治療提供了新的工具。單克隆抗體是研究蛋白質表達和分布的主要工具之一， 針對Myomegalin的單克隆抗體可以檢測細胞和組織,尤其是腫瘤組織中Myomegalin的表達水平和定位情況，有助于深入研究Myomegalin的細胞學功能及在腫瘤中的生物學作用。

發明內容
本發明是為了解決Myomegalin在細胞生物功能中的作用，以及Myomegalin與腫瘤之間的關系，應用于基礎醫學研究和臨床檢測問題，而提供一種抗人磷酸二酯酶4D相互作用蛋白變體5蛋白的單克隆抗體及其應用。本發明是按以下技術方案實現的。—種抗人磷酸二酯酶4D相互作用蛋白變體5蛋白的單克隆抗體,特點是該抗體特異性識別人磷酸二酯酶4D相互作用蛋白變體5蛋白1103-1116位點氨基酸；該抗體由保藏號為CGMCC No. 5078的雜交瘤細胞株產生，氨基酸序列為序列表所示的氨基酸序列。一種雜交瘤細胞，該雜交瘤細胞株產生抗人磷酸二酯酶4D相互作用蛋白變體5蛋白單克隆抗體，該雜交瘤細胞株保藏號為CGMCC No. 5078。所述抗人磷酸二酯酶4D相互作用蛋白變體5蛋白的單克隆抗體在制備免疫組化檢測試劑中的應用，用來檢測人體組織及細胞中磷酸二酯酶4D相互作用蛋白變體5的表達與定位。以此原核表達多肽免疫BALB/c小鼠，取小鼠脾臟與小鼠骨髓瘤細胞(SP2/0)細胞融合，用上述原核表達多肽進行篩選，獲得陽性克隆，亞型鑒定及小鼠腹腔注射制備腹水， 腹水抗體進行細胞和組織的免疫組化，觀察Myomegalin變體5蛋白的表達和定位檢測。這樣設計的本發明，其抗體與Myomegalin變體5蛋白具有特異性結合能力，制備人Myomegalin變體5蛋白的免疫組化檢測試劑,用來檢測人體組織特別是腫瘤組織細胞中 Myomegalin變體5的表達與定位。雜交瘤細胞株由中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏；
地址北京市朝陽區北辰西路I號院3號中國科學院微生物研究所。
保藏號為CGMCC No. 5078，保藏日期:2011年7月22日。


圖I是Hela細胞的Myomegalin變體5蛋白免疫熒光染色圖2顯示Myomegalin變體5蛋白在乳腺導管內癌中的表達與定位；
圖3顯示Myomegalin變體5蛋白在正常乳腺中的表達。
具體實施例方式下面結合附圖及實施例對本發明做詳細的說明。—、Myomegalin變體5 (磷酸二酯酶4D相互作用蛋白變體5)的單克隆抗體的制備
I.實驗材料來源
BALB/c小鼠由天津腫瘤醫院提供，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司；Hela細胞、小鼠骨髓瘤細胞(SP2/0)由天津腫瘤醫院提供，購自中科院血研所。福氏完全佐劑及福氏不完全佐劑、HAT、HT條件培養基成分購自Invitrigen公司。DMEM培養基、聚乙二醇 (PEG)、RPMI 1640培養基購自Hyclone公司。辣根過氧化物酶(HRP)標記的山羊抗鼠Ig、 鄰苯二胺(OPD)、二氨基聯苯胺(DAB)、8_氮鳥嘌呤(8-AG)購自Sigma公司。2.動物免疫
取7 10周齡BALB/c雌性小鼠4只，將IOOug Myomegalin變體5蛋白多肽(1103-1116 氨基酸，帶有GST標簽)(香港科技大學齊眾教授提供)溶于O. 2ml O. IM PBS (pH7. 2)，與等體積弗氏完全佐劑(Sigma)充分混勻，腹部皮下多點注射。第I次免疫后第15和29天， 分別用IOOug多肽/ 0.2ml PBS與等體積弗氏不完全佐劑(Sigma)充分混勻后加強免疫， 融合前3d由尾靜脈強化免疫注射50ug多肽/ O. 2ml PBS I次。3.細胞融合
取經加強免疫的BALB/c小鼠I只，放血處死后，無菌條件下取脾，制備脾細胞懸液。取 2X IO7個骨髓瘤細胞(SP2/0)，于37°C水浴中加50%PEG (MW 4000)1 ml融合，將融合細胞接種于96孔培養板內，分別采用HAT和HT培養基進行選擇性培養。待雜交瘤細胞長至培養孔底面1/3時，用Myomegalin變體5蛋白多肽作包被抗原，以ELISA法篩選抗體，選擇抗體分泌陽性孔，采用有限稀釋法，將雜交瘤細胞稀釋為5-10個/ml，接種于96孔培養板內， 選擇單個細胞集落孔的培養上清作抗體檢測，陽性者用同樣方法再次克隆，直至克隆后有雜交瘤細胞生長的抗體分泌陽性率為100%。4.陽性雜交瘤腹水單克隆抗體的制備
BALB/c小鼠腹腔注射PristaneO. 5ml /只，I周后腹腔注射生長良好的雜交瘤細胞 IO7, 10 d左右，小鼠腹部脹大至其活力極差時，處死小鼠，抽取其腹水，離心去沉淀，收集上清測定效價。5.間接ELISA法檢測抗體效價
以Myomegalin變體5蛋白多肽包被酶標板，設空白對照組，37 °C包被過夜。用O. 25%BSA 37°C封閉I h。加入腹水抗體，以封閉液作系列梯度稀釋，37°C孵育lh，PBS-T洗5次。加辣根過氧化物酶(HRP)標記的山羊抗鼠Ig，37°C孵育lh，PBS-T洗5次。OPD底物顯色系統顯色5-10 min，測定0D492值。6.抗體亞型鑒定
以羊抗鼠Ig包被酶標板，37°C包被過夜。用O. 25%BSA 37°C封閉I h。加入雜交瘤培養上清，37°C孵育lh，PBS-T洗5次。分別加辣根過氧化物酶(HRP)標記的山羊抗鼠IgGl、 IgG2a、IgG2b、IgG3、IgM、IgA，37°C孵育 lh, PBS-T 洗 5 次。OPD 底物顯色系統顯色 5-10 min，測定 0D492 值。7.結果
細胞融合后，以重組Myomegalin變體5蛋白多肽為檢測抗原，間接ELISA篩選獲得一株單抗，亞型鑒定為IgGl，小鼠腹水效價為I :8000。二、Myomegalin變體5單抗的特異性檢測
I.實驗方法
將Hela細胞胰酶消化，取適量細胞點于載玻片上，37°C培養8小時后，冷甲醇固定， 2%BSA封閉Ih,加Myomegalin變體5單抗、微管蛋白(Y -tubulin)抗體孵育37°C 2h, PBS 洗滌后加不同熒光素標記的二抗室溫閉光孵育lh，熒光顯微鏡下觀察。見附圖I。2.結果判定
微管蛋白(Y-tubulin)作為在細胞中心體和高爾基體上均有染色，以中心體為強； Myomegalin變體5主要在高爾基體上有明顯熒光顯色，中心體處略弱，說明該抗體對于 Myomegalin蛋白具有明顯的特異性,特異性識別人Myomegalin蛋白變體5的1103-11160
位點氨基酸。三、Myomegalin變體5蛋白的單克隆抗體在制備免疫組化檢測試劑中的應用
I.乳腺癌切片制備
乳腺癌切片取自天津腫瘤醫院病理室，常規脫蠟。2.免疫組化步驟
將載玻片取出置于500ml甲醇+15ml 3% H202溶液中，浸泡15分鐘，去除內源性過氧化物酶。浸入檸檬酸緩沖液(PH=6. O)中，微波爐抗原修復12分鐘。每片點I滴正常羊血清，37°C溫浴20分鐘。應用Myomegalin變體5單抗I :800稀釋，4°C過夜。PBS漂洗3遍， 加辣根過氧化物酶(HRP)標記的山羊抗鼠IgG，37°C孵育15分鐘，DAB顯色，常規復染與封片。3.結果判定
乳腺浸潤性導管癌染色顯示，Myomegalin變體5蛋白在陽性細胞胞漿內呈均勻著色的棕/黃色顆粒，或(和)密集散在分布，纖維間質細胞，淋巴細胞等不著色，背景清晰。正常乳腺很少著色，見附圖2、3。因此,該抗體制備的人Myomegalin變體5蛋白的免疫組化檢測試劑，用來檢測人體組織及細胞中Myomegalin變體5的表達與定位。
SEQUENCE LISTING <110>天津市腫瘤醫院
〈120〉抗人磷酸二酯酶4D相互作用蛋白變體5的單克隆抗體及其應用 〈130〉 I 〈160〉 I
<170> PatentIn version 3. 3 〈210〉 I 〈211〉 14 〈212〉 PRT
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum 〈220〉
<221> protein 〈222〉 (I).· (14)
〈400〉 I
Gly Glu Leu Glu Ser Val Arg lie His His Lys His Ala Tyr I510
權利要求
1.一種抗人磷酸二酯酶4D相互作用蛋白變體5的單克隆抗體，其特征是該抗體特異性識別人磷酸二酯酶4D相互作用蛋白變體5的1103-1116位點氨基酸；該抗體由保藏號為 CGMCC No. 5078的雜交瘤細胞株產生，氨基酸序列為序列表所示的氨基酸序列。
2.一種雜交瘤細胞，其特征在于該雜交瘤細胞產生抗人磷酸二酯酶4D相互作用蛋白變體5單克隆抗體，該雜交瘤細胞株保藏號為=CGMCC No. 5078。
3.根據權利要求I所述抗人磷酸二酯酶4D相互作用蛋白變體5的單克隆抗體在制備免疫組化檢測試劑中的應用，用來檢測人體組織及細胞中磷酸二酯酶4D相互作用蛋白變體5的表達與定位。
全文摘要
本發明公開了一種抗人磷酸二酯酶4D相互作用蛋白變體5的單克隆抗體及其應用，屬于含有抗體的醫藥配制品，或單克隆抗體的制備。該抗體特異性識別人磷酸二酯酶4D相互作用蛋白變體5的1103-1116位點氨基酸；該抗體由保藏號為CGMCCNo.5078的雜交瘤細胞株產生，氨基酸序列為GELESVRIHHKHAY。本發明的單克隆抗體與磷酸二酯酶4D相互作用蛋白變體5具有特異性結合能力，用來檢測人體組織及細胞中磷酸二酯酶4D相互作用蛋白變體5的表達與定位，用作為人磷酸二酯酶4D相互作用蛋白變體5的免疫組化檢測試劑。
文檔編號C07K16/18GK102584995SQ20111029724
公開日2012年7月18日 申請日期2011年9月29日 優先權日2011年9月29日
發明者張霖, 楊毅, 牛瑞芳, 羅藝, 魏熙胤, 齊眾 申請人:天津市腫瘤醫院