專利名稱：磷酸三酯酶突變體及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)，具體涉及一種磷酸三酯酶突變體及其制備方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
磷酸三酯酶(Phosphotriesterase, EC 3. I. 8. I)可以水解廣譜的有機(jī)磷化合物，后者被廣泛的用于農(nóng)業(yè)殺蟲劑和化學(xué)戰(zhàn)神經(jīng)毒劑，磷酸三酯酶能夠催化斷裂有機(jī)磷化合物的磷酯鍵而使其脫毒。如下式所示
... gj . ...+ HOZ H2O、oh
R2、ZR2
R1/R2:焼基Z:釀.脂肪族.芳香族S味壞基團(tuán)有機(jī)磷化合物對人及家畜具有極強(qiáng)的毒副作用。一些比較常見的有機(jī)磷化合物及其毒性見表I。至今有超過100種有機(jī)磷殺蟲劑在世界各地廣泛使用，約占?xì)⑾x劑種類的38%。僅在美國每年大約有5萬噸有機(jī)磷殺蟲劑用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)，除此每年通過“牛蚤根除計(jì)劃”大約產(chǎn)生40萬升蠅毒磷(coumaphos)廢液；而一些歐盟國家生產(chǎn)數(shù)百萬升地亞農(nóng)(diazinon)用于清洗羊毛藥水。由于過量和連續(xù)的使用，許多土地和水資源遭到了嚴(yán)重的污染，對人類健康構(gòu)成了巨大威脅(Singh, B. K. Organophosphorus-degrading bacteria ecology and industrial applications. Nat. Rev. Microbiol. 2009,7 (2) :156-164.)。世界上每年大概有三百萬人由于有機(jī)磷攝入中毒，其中約二十萬人死亡(Karalliedde，L. , Senanayake, N. , Organophosphorus insecticide poisoning.J. Int.Fed.Cl in.Chem. 1999,11(2) :4_9.)。另一方面，世界上用于軍事儲備的化學(xué)戰(zhàn)神經(jīng)毒劑約為20萬噸，根據(jù)國際化學(xué)武器條約這些化學(xué)武器在2023年前需要全部銷毀。因此磷酸三酯酶在有機(jī)磷污染物的降解、除污、生物傳感器、醫(yī)藥研發(fā)等領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用潛力。表I幾種常見的有機(jī)磷化合物及其毒性
權(quán)利要求
1.一種磷酸三酯酶突變體，其特征在于，所述突變體的氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示，其中包含以下8個(gè)氨基酸突變Phe28Ile、Tyr99Leu、Thrl71Ser、Phe228Leu、Asn269Ser、Val270Gly、Trp271Cys、Gly273Asp。
2.如權(quán)利要求I所述的磷酸三酯酶突變體的制備方法，其特征在于由來源于G. kaustophilus HTA426的磷酸三酯酶基因進(jìn)行分子進(jìn)化，以構(gòu)建好的含有磷酸三酯酶基因的表達(dá)質(zhì)粒為模板，運(yùn)用易錯(cuò)PCR的方法，經(jīng)過多輪的突變和篩選，最終獲得磷酸三酯酶突變體；所述磷酸三酯酶野生型的氨基酸序列如SEQ ID NO. I所示。
3.編碼權(quán)利要求I所述磷酸三酯酶野生型基因，其特征在于所述磷酸三酯酶野生型基因的核苷酸序列如SEQ ID NO. 3所示。
4.編碼權(quán)利要求I所述磷酸三酯酶突變體基因，其特征在于所述磷酸三酯酶突變體基因的核苷酸序列如SEQ ID NO. 4所示。
5.如權(quán)利要求I所述磷酸三酯酶突變體在降解有機(jī)磷毒物中的應(yīng)用。
6.表達(dá)權(quán)利要求I所述磷酸三酯酶突變體的大腸桿菌工程菌，其特征在于所述大腸桿菌工程菌命名為pET28a-GkaP(8M)，保藏編號為CGMCC No. 5597。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種磷酸三酯酶突變體及其制備方法和應(yīng)用。本發(fā)明由來源于嗜熱細(xì)菌的Geobacillus kaustophilus HTA426的磷酸三酯酶基因出發(fā)，利用易錯(cuò)PCR的方法，經(jīng)過多輪的突變和篩選，最終獲得一個(gè)磷酸三酯酶活力顯著提高的突變體，在該突變體的氨基酸序列中涉及到的突變?yōu)镻he28Ile、Tyr99Leu、Thr171Ser、Phe228Leu、Asn269Ser、Val270Gly、Trp271Cys、Gly273Asp。突變體對于幾種常見的有機(jī)磷殺蟲劑的比活力相比野生型得到了顯著提高，在有機(jī)磷毒物的生物降解領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。
文檔編號C12R1/19GK102796714SQ20121001519
公開日2012年11月28日 申請日期2012年1月18日 優(yōu)先權(quán)日2012年1月18日
發(fā)明者馮雁, 張宇, 安嬌, 楊廣宇 申請人:上海交通大學(xué)