產(chǎn)油單針藻lb59的獲得及應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種產(chǎn)油單針藻LB59的獲得及應(yīng)用，涉及產(chǎn)油微藻的篩選和培養(yǎng)技術(shù)；自野外環(huán)境分離獲得的藻種經(jīng)18SrDNA序列分析和形態(tài)鑒定，確定該藻為單針藻屬（Monoraphidium）成員，其序列為SEQ?ID?NO.1。本產(chǎn)油單針藻LB59能夠耐受高濃度碳酸氫鈉，易于進(jìn)行開放式培養(yǎng)，富含油脂，在維持23.6g/m2d的生長(zhǎng)和收集速率的情況下，油脂含量可達(dá)到細(xì)胞干重的30.2%，脂肪酸中含有20%以上的18碳3烯酸和18碳4烯酸。
【專利說(shuō)明】產(chǎn)油單針藻LB59的獲得及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及產(chǎn)油微藻的篩選和培養(yǎng)技術(shù)，尤其涉及一種產(chǎn)油單針藻LB59的獲得及應(yīng)用。具體地說(shuō)，本發(fā)明是從野外采集水樣，通過(guò)分離純化得到一種可作為生產(chǎn)油脂原料的產(chǎn)油藻株。
【背景技術(shù)】
[0002] 地球上被鑒定的藻類大約超過(guò)40000種，其中一些種類富含油脂。從油藻提取的油脂可以經(jīng)過(guò)與甲醇反應(yīng)轉(zhuǎn)化為生物柴油，被認(rèn)為最有可能替代日漸枯竭的石油來(lái)源的柴油。其含有的16碳和18碳的脂肪酸對(duì)于生物柴油的生產(chǎn)最為有利。藻類的油脂也含有不飽和脂肪酸，可以添加到動(dòng)物飼料中促進(jìn)生長(zhǎng)。篩選獲得容易培養(yǎng)、生長(zhǎng)快、產(chǎn)油高的藻種是生產(chǎn)出具有市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)力的油藻生物質(zhì)的關(guān)鍵。早在上世紀(jì)70年代，美國(guó)國(guó)家可再生能源實(shí)驗(yàn)室的水生物種計(jì)劃，就開始利用藻類提取油脂、制備生物柴油的研發(fā)工作，從海洋和湖泊中分離了 3000多種藻類，從中篩選出300多種生長(zhǎng)快、含油高的硅藻、綠藻和藍(lán)藻等藻種，但當(dāng)時(shí)未解決成本問(wèn)題。世界上其它各國(guó)的研究者也都利用各種手段積極地篩選尋找能適應(yīng)商業(yè)化生產(chǎn)的優(yōu)良藻種。
[0003]當(dāng)前需要亟待解決以下問(wèn)題:對(duì)生長(zhǎng)速率快、油脂含量高的微藻藻株的篩選和遺傳改良；低成本、高密度培養(yǎng)體系的建立；高效、低成本光生物反應(yīng)器的開發(fā)；高效率、低成本的采收技術(shù)；微藻的高效能源轉(zhuǎn)化技術(shù)等。從以上可以看出，對(duì)于生長(zhǎng)快、容易大量培養(yǎng)、油脂含量高的微藻的選育是當(dāng)前需要解決的首要問(wèn)題。近幾年，國(guó)內(nèi)多家實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)開始分別在科技部、自然科學(xué)基金委以及大型企業(yè)的資助下，開展大規(guī)模采集和篩選高產(chǎn)油藻株的工作，并且取得了一些進(jìn)展。選自自然生境的微藻往往在溫度、光照和鹽度適應(yīng)方面具有一定的抗逆性，適于在開放的跑道池中大量培養(yǎng)生產(chǎn)。
[0004]本發(fā)明就是基于以上背景從內(nèi)蒙野外水體采集、分離和純化而得到的一個(gè)優(yōu)良的
產(chǎn)油藻株。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的就在于克服現(xiàn)有技術(shù)中用于生產(chǎn)微藻油脂的優(yōu)良藻株不足的問(wèn)題，提供一種產(chǎn)油單針藻LB59的獲得及其應(yīng)用，即在內(nèi)蒙野外水域采集水樣，分離純化獲得的了一種具有抗逆性、易開放培養(yǎng)的產(chǎn)油微藻，并建立培養(yǎng)和收集等方法。
[0006]一、單針藻LB59的獲得
①樣品采集
水樣采自內(nèi)蒙古錫林格勒盟錫林浩特市桃林塔拉分場(chǎng)G303國(guó)道水洼，精確位置為北緯43°54’4.85”，東經(jīng)116。19’32.71”。采樣時(shí)間是2011年7月29日，當(dāng)天的水溫為28.1。。，水樣的電導(dǎo)率為0.392 ms/cm, pH為7.45。
[0007]②藻種的分離、18S rDNA序列分析和形態(tài)鑒定
水樣通過(guò)稀釋涂平板法在補(bǔ)加8.4g/L碳酸氫鈉的BGll培養(yǎng)、分離出單藻落，各藻落少量培養(yǎng)提取總脂在薄層層析板上比較。選含油量較高的一株，通用引物擴(kuò)增18S rDNA,經(jīng)克隆后送測(cè)序，其序列為SEQ N0.1 (見序列表)；通過(guò)系統(tǒng)關(guān)系樹構(gòu)建確定該藻為單針藻屬(Monoraphidium)成員(圖1);在顯微鏡下觀察其形態(tài)符合單針藻屬特征，具有片狀葉綠體，命名為單針藻LB59 (Monoraphidium sp.LB59)(圖2);與同屬的LB50藻株(另一專利申請(qǐng))相比，細(xì)胞較小，18S rDNA有8個(gè)堿基不同(見序列表中方框中的堿基);2013年7月17日將該藻株保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(中國(guó)武漢武漢大學(xué))，保藏編號(hào)為CCTCC NO:M2013349。
[0008]二、單針藻LB59的培養(yǎng)收集方法
①培養(yǎng):采用降低硝酸鈉含量的BGlI，補(bǔ)加高濃度碳酸氫鈉進(jìn)行培養(yǎng)，培
養(yǎng)基全部成分見表1 ;
通過(guò)試驗(yàn)比較，建立了單針藻LB59培養(yǎng)條件，單針藻LB59培養(yǎng)條件是:光照強(qiáng)度200μΕ/m2.S，溫度條件30-35°C，培養(yǎng)基為具有0.75 g/L硝酸鈉的BG11，補(bǔ)加12.6 g/L碳酸氫鈉(培養(yǎng)基全部成分見表1)。以圓形開放式光反應(yīng)器進(jìn)行培養(yǎng)(見圖3)，每天通入二氧化碳I小時(shí)，每5天收集1/2的培養(yǎng)細(xì)胞，并補(bǔ)充等體積的新鮮培養(yǎng)基，其生長(zhǎng)速率能夠達(dá)到23.6 g/m2d(每天每平米獲得的干物質(zhì))，這樣可以長(zhǎng)時(shí)間持續(xù)培養(yǎng)和收集；由于其光合放氧活性在2000 μ E/m2.s達(dá)到飽和，還可以進(jìn)一步提高光照強(qiáng)度促進(jìn)其生長(zhǎng)和產(chǎn)油。
[0009]表1培養(yǎng)基成分
【權(quán)利要求】
1.一種產(chǎn)油單針藻LB59，其特征在于: 用含有碳酸氫鈉的BGll中培養(yǎng)、分離獲得的一種綠藻，在顯微鏡下察其形態(tài)符合單針舊MMonoraphidiuni特篆;其18S rDNA序列SEQ N0.1,經(jīng)系統(tǒng)關(guān)系分析證明屬于一種單針藻，命名為單針藻LB59,即sp.LB59 ;該藻種能夠耐受高濃度碳酸氫鈉，易于進(jìn)行開放式培養(yǎng)，在維持23.6 g/m2d的生長(zhǎng)和收集速率的情況下，油脂含量可達(dá)到細(xì)胞干重的30.2%，脂肪酸中有20%以上的18碳3烯酸和18碳4烯酸；2013年7月17日將該藻株保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)為CCTCC NO:M 2013349。
2.按權(quán)利要求1所述的一種產(chǎn)油單針藻LB59的培養(yǎng)收集方法，其特征在于: ①單針藻LB59的培養(yǎng):采用降低硝酸鈉含量的BG11，補(bǔ)加高濃度碳酸氫 鈉進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)基全部成分見表1 ; ②單針藻LB59的絮凝采收:在大量培養(yǎng)后用稀鹽酸調(diào)節(jié)培養(yǎng)液pH，加殼聚糖絮凝沉淀細(xì)胞。
3.按權(quán)利要求2所述的培養(yǎng)收集方法的應(yīng)用，其特征在于: ①其大量培養(yǎng)獲得的含油藻細(xì)胞用于油脂提取； ②其藻細(xì)胞直接添加到動(dòng)物飼料中增加不飽和脂肪酸營(yíng)養(yǎng)； ③其藻細(xì)胞的大量培養(yǎng)可 吸收工業(yè)排放的二氧化碳。
【文檔編號(hào)】C12R1/89GK103540533SQ201310428561
【公開日】2014年1月29日 申請(qǐng)日期:2013年9月18日 優(yōu)先權(quán)日:2013年6月26日
【發(fā)明者】孔任秋, 徐旭東, 席瑋芳, 高宏, 方仙桃 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院水生生物研究所, 中國(guó)石油化工股份有限公司