一種蛋白功能結(jié)構(gòu)域鉸鏈肽及其用途
【專利摘要】本發(fā)明提供了蛋白功能結(jié)構(gòu)域鉸鏈肽氨基酸序列，及由該鉸鏈肽連接蛋白功能結(jié)構(gòu)域組成的多功能結(jié)構(gòu)域重組蛋白的氨基酸序列、表達基因，以及表達制備方法及其用途。本發(fā)明設(shè)計制備的多功能結(jié)構(gòu)域重蛋白具有每個功能結(jié)構(gòu)域發(fā)揮功能效率高的優(yōu)點。
【專利說明】-種蛋白功能結(jié)構(gòu)域絞鏈化及其用途

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬生物工程領(lǐng)域，具體涉及一種連接蛋白功能結(jié)構(gòu)域的較鏈膚，W及由該 較鏈膚連接蛋白功能結(jié)構(gòu)域組成的多功能結(jié)構(gòu)域重組蛋白的氨基酸序列、表達基因，及其 表達制備方法及用途。

【背景技術(shù)】
[0002] 功能結(jié)構(gòu)域是生物大分子中具有特異結(jié)構(gòu)和獨立功能的區(qū)域。天然蛋白的功能結(jié) 構(gòu)域之間較鏈區(qū)膚段長短不等，在某些用途中不能保證結(jié)構(gòu)域高效發(fā)揮生物功能。如蛋白A 是A型金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus)的一種細胞壁蛋白，能特異性地結(jié)合人 和哺乳動物抗體（主要是IgG)。理論上天然蛋白A所含5個功能結(jié)構(gòu)域都能獨立結(jié)合抗體 化區(qū)。但在溶液中每個天然蛋白A平均只能結(jié)合2. 1個抗體分子（用ITC200量熱滴定測 定），相當于每個結(jié)構(gòu)域只能結(jié)合0.4個抗體分子，而當?shù)鞍譇固定在瓊脂糖球上時，平均每 個結(jié)構(gòu)域結(jié)合的抗體降低到0. 12個分子；分析蛋白A結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)天然蛋白A結(jié)構(gòu)域之間的較 鏈膚最長只有13個氨基酸（結(jié)構(gòu)域E-D主體結(jié)構(gòu)之間的氨基酸序列；APKADAQQNNFNK)，最 伸展構(gòu)象的N-C端距離只有2日A。蛋白A每個結(jié)合域的主體幾何性質(zhì)約為長巧A、直徑約20A 的圓柱；即使在最伸展的情況下，蛋白A分子結(jié)合域的間隔約為50A (相當于結(jié)合域的長度 25A加上伸展較鏈長度25A之和）。而抗體分子化和兩個F油結(jié)構(gòu)域的立體結(jié)構(gòu)相當于3 個栓在一起的長約90A、直徑60A的卵形體。即使抗體分子W最緊密排列方式排列厚度也有 60A，顯然超出了蛋白A分子結(jié)構(gòu)域間隔的50A。任何一個結(jié)構(gòu)域結(jié)合了抗體分子所占空間都 會阻礙相鄰的兩個結(jié)構(gòu)域再結(jié)合抗體分子，降低了蛋白A分子結(jié)合抗體的效率。日本專利 JP2009 / 066553和美國專利US2006019495等用生物工程改造蛋白A增強了耐堿能力和純 化性能。美國專利US2006019495中的四結(jié)構(gòu)域蛋白A結(jié)構(gòu)域間最長較鏈膚（氨基酸序列： APKQAPKVDAKFTVDNK)構(gòu)象的N-C端距離都在27-37A之間；日本專利JP2009 / 066553中的 四結(jié)構(gòu)域蛋白A的結(jié)構(gòu)域間最長較鏈膚（氨基酸序列；APTGSSGTATAQQNNF)，構(gòu)象的N-C端 距離都在17-41A之間，長度大于35AW上的幾率占1 / 4,反過來看就是3 / 4的蛋白A分子 構(gòu)象中結(jié)構(gòu)域間隔小于60A，任何一個結(jié)構(gòu)域結(jié)合了抗體分子所占空間都會阻礙相鄰的兩 個結(jié)構(gòu)域再結(jié)合抗體分子。所W該些專利的蛋白A分子結(jié)合抗體的效率仍然有待于提高， 從而提高抗體藥物的核也純化效率，降低抗體藥物生產(chǎn)成本，促進抗體藥物產(chǎn)業(yè)發(fā)展，讓更 多病人用得起抗體藥物。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明的目的之一是提供一種人工設(shè)計的蛋白結(jié)構(gòu)域較鏈膚，用于連接蛋白中 多個結(jié)構(gòu)域，使每個結(jié)構(gòu)域都能有效發(fā)揮生物功能。人工設(shè)計蛋白中功能結(jié)構(gòu)域的大小 和發(fā)揮功能時所結(jié)合祀蛋白的大小決定著所需要的結(jié)構(gòu)域較鏈膚的長短。如蛋白A分 子中每個結(jié)構(gòu)域的主體幾何性質(zhì)約為長25A、直徑約I 20A的圓柱；結(jié)合抗體時既是抗體分 子W最薄60A的厚度密集排列，要求蛋白A分子結(jié)構(gòu)域間隔是60-25=35A。需要在蛋白A結(jié) 構(gòu)域主體之間插入一定長度的較鏈膚才能將蛋白A結(jié)構(gòu)域主體間距延長到對相鄰結(jié)構(gòu) 域同時結(jié)合抗體沒有不利影響的程度。廣泛的研究發(fā)現(xiàn)抗體分子Fab和Fc之間的較鏈 膚具有比較理想的功能。公開文獻報道了不同類型和亞型抗體分子F油和化間較鏈膚 長度，如3x15個氨基酸巧PKSCDTPPPCPRCP)3,富含甘氨酸和脯氨酸[TAN，et. al.，Proc. 化tl.Acad. Sci.USA(1990)，87 ;162-166 ;Prorein Science(1997)，6 ;407415. ;Roux， et. al.，JImmunol 1998 ; 161 ;4083-4090 ;Zhao, et.al.，Proc.化1:1. Acad. Sci. USA (2006)， 103; 12087-12092;蛋白結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫 // WWW.pdb.org / ;uniprot蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫： http: // www.uniprot.org /]，常見的抗體較鏈膚如表1所示，使用該些較長的較鏈膚 能夠使得某些蛋白的每個結(jié)構(gòu)域可W獨立完成生物功能。
[0004] 表1抗體來源的較鏈膚氨基酸序列
[0005]

【權(quán)利要求】
1. 一種連接蛋白質(zhì)功能結(jié)構(gòu)域的鉸鏈肽，所述鉸鏈肽伸展構(gòu)象的長度大于結(jié)構(gòu)域所結(jié) 合靶蛋白幾何寬度與結(jié)構(gòu)域幾何長度的差值，其特征在于所述的鉸鏈肽氨基酸序列選自動 物抗體分子鉸鏈區(qū)的一部分、單拷貝和多拷貝及其組合。
2. 如權(quán)利要求1所述的鉸鏈肽，其特征在于所述的鉸鏈肽氨基酸序列選自SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO :2、SEQ ID NO :3、SEQ ID NO :4、SEQ ID NO :5、SEQ ID NO :6、SEQ ID NO :7、 SEQ ID N0:8、SEQ ID N0:9、SEQ ID N0:10、SEQ ID N0:11、SEQ ID N0:12、SEQ ID N0:13、 SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 16、SEQ ID NO: 17、SEQ ID NO: 18、SEQ ID NO: 19、SEQ ID NO :20、SEQ ID NO :21、SEQ ID NO :22、SEQ ID NO :23、SEQ ID NO :24、SEQ ID NO ：25, SEQ ID NO ：26, SEQ ID NO ：27, SEQ ID NO ：28, SEQ ID NO ：29, SEQ ID NO ：30, SEQ ID NO :31、SEQ ID NO :32、SEQ ID NO :33、SEQ ID NO :34、SEQ ID NO :35、SEQ ID NO :36、 SEQ ID N0：37,SEQ ID N0：38,SEQ ID N0：39,SEQ ID N0：40,SEQ ID NO ：4U SEQ ID NO： 42、SEQ ID N0:43、SEQ ID N0:44、SEQ ID N0:45、SEQ ID N0:46。
3. 如權(quán)利要求2所述的鉸鏈肽，其特征在于所述的鉸鏈肽中半胱氨酸殘基用小側(cè)鏈氨 基酸取代，小側(cè)鏈氨基酸選自甘氨酸、丙氨酸、絲氨酸、蘇氨酸和天冬氨酸。
4. 一種權(quán)利要求3所述鉸鏈肽組成的，其功能結(jié)構(gòu)域數(shù)目由2-6個組成并具有結(jié)合抗 體功能的重組蛋白，其特征在于所述功能結(jié)構(gòu)域選自金黃色葡萄球菌蛋白A的天然蛋白A 結(jié)構(gòu)域A、B、C、D、E和人工改造的結(jié)構(gòu)域Z，蛋白G的Bl、B2和蛋白L的B1結(jié)構(gòu)域及其衍 生物、類似物或其任意組合。
5. 如權(quán)利要求4所述重組蛋白，其特征在于所述重組蛋白的N-末端加一段權(quán)利要求1 所述鉸鏈肽連接有賴氨酸和/或半胱氨酸。
6. 如權(quán)利要求5所述重組蛋白，其特征在于所述重組蛋白的C-末端加一段權(quán)利要求1 所述鉸鏈肽連接有賴氨酸和/或半胱氨酸。
7. -種權(quán)利要求6所述重組蛋白固定化的親和介質(zhì)，其特征在于，所述的親和介質(zhì)用 于免疫球蛋白的分離和純化。
8. -種多核苷酸，其特征在于，所述的多核苷酸編碼權(quán)利要求4所述的重組蛋白A。
9. 一種表達載體，其特征在于，所述的表達載體含有權(quán)利要求8所述的多核苷酸。
10. -種宿主細胞，其特征在于，所述的宿主細胞含有權(quán)利要求9所述的表達載體，或 者在基因組中整合有權(quán)利要求8所述的多核苷酸。
【文檔編號】C12N15/70GK104513309SQ201310444846
【公開日】2015年4月15日 申請日期:2013年9月26日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月26日
【發(fā)明者】李榮秀, 陳揚揚, 盧悟廣, 李靈舒, 陳磊 申請人:上海亨臻實業(yè)有限公司