一種高通量多樣本多靶點單堿基分辨率的甲基化水平檢測方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種高通量多樣本多靶點單堿基分辨率的甲基化水平檢測方法。本發(fā)明還提供了適用于進(jìn)行人基因組CpG甲基化水平測序的BSP引物。本發(fā)明的方法適用于微量樣品的基因組DNA檢測，本發(fā)明的方法不僅可實現(xiàn)高通量檢測，而且檢測效率高、成本低廉，并能與最新高通量測序技術(shù)銜接。
【專利說明】一種高通量多樣本多靶點單堿基分辨率的甲基化水平檢測 方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及分子生物學(xué)的DNA甲基化分析領(lǐng)域；更具體地，本發(fā)明涉及一種高通 量多樣本多靶點單堿基分辨率的甲基化水平檢測方法。

【背景技術(shù)】
[0002] DNA序列改變以外的調(diào)控機(jī)制異常在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中更為普通和重要， 這種不依賴于DNA序列變化的可遺傳的調(diào)控機(jī)制被稱為表觀遺傳學(xué)機(jī)制，包括組蛋白乙酰 化、DNA甲基化、MicoRNA、非編碼長RNA等。其中以DNA甲基化研究最為深入，無論在針對 個別基因、還是在新興的全基因組學(xué)層面以及功能調(diào)控領(lǐng)域都被廣泛研究，并且在腫瘤臨 床實踐的診斷和治療中的DNA甲基化的應(yīng)用前景也受到了很大的重視。在腫瘤細(xì)胞中，一 些原本在正常細(xì)胞中處于低甲基化狀態(tài)的基因呈現(xiàn)出高甲基化的狀態(tài)并轉(zhuǎn)錄失活，受累基 因包括抑癌基因、DNA修復(fù)基因、細(xì)胞周期控制基因和抗凋亡基因等，由此促進(jìn)了腫瘤的發(fā) 生發(fā)展。DNA甲基化的研究不僅可以從新的角度使人們進(jìn)一步了解腫瘤的發(fā)生發(fā)展機(jī)制，腫 瘤細(xì)胞DNA呈現(xiàn)出的異常甲基化譜式已經(jīng)成為一個新的腫瘤生物標(biāo)志物的研究領(lǐng)域，而且 由于DNA甲基化修飾的可逆性，使其也具有成為分子治療靶點的可能。
[0003] 當(dāng)今DNA甲基化研究的主要方法分為全基因?qū)用婧突驅(qū)用妗Ｔ谌蚪M 層面包括以DNA雜交為基礎(chǔ)的芯片技術(shù)，有用特定蛋白富集基因組中甲基化DNA片段 后再與芯片雜交的CHIP-chip技術(shù)和將基因組DNA進(jìn)行亞硫酸修飾后與芯片雜交的 methylation array技術(shù)；以高通量為基礎(chǔ)的下一代測序技術(shù)，其中同樣包括用特定蛋 白富集基因組中甲基化DNA片段后進(jìn)行測序的方法如MethylCap-seq、MeDIP-seq和將 基因組DNA進(jìn)行亞硫酸修飾后進(jìn)行高通量測序的方法如Genome-wide Bisulfite-seq、 Reduced Representation Bisulfite Sequencing(RRBS)。需要說明的是只有Genome-wide Bisulfite_seq、Reduced Representation Bisulfite Sequencing(RRBS)這 2 種方法是單 堿基分辨率的DNA甲基化檢測方法，其他組學(xué)研究方法都需后續(xù)的單基因單位點層面的甲 基化狀況檢測驗證。在特定基因?qū)用娴臋z測方法包括以PCR(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)）為基礎(chǔ)對特 定DNA序列的MSP (甲基化特異性PCR)、qMSP (熒光定量甲基化特異性PCR)、MSRE_qPCR (甲 基化敏感內(nèi)切酶酶切定量PCR);以測序為基礎(chǔ)的BSP (亞硫酸處理PCR產(chǎn)物測序）、焦磷酸 測序。以PCR為基礎(chǔ)的技術(shù)方法簡便，但僅對引物或探針退火的幾個CpG(CG二核苷酸）位 點進(jìn)行檢測。焦磷酸測序一個反應(yīng)只能對60bp左右的特定序列中的CpG位點進(jìn)行甲基化 檢測，檢測1個樣本需200元，當(dāng)需檢測大樣本受檢樣本和多區(qū)域甲基化水品時，價格極其 昂貴，如需檢測100個樣本中5個區(qū)域的甲基化水平，大致費用為：100*5*200=10萬元。而 BSP方法是最為常用的特定位點單堿基分辨率的甲基化檢測，可對500bp內(nèi)的PCR產(chǎn)物中的 多個CpG檢測，但一個PCR反應(yīng)只能檢測一個樣品的一個特定位點，且需對PCR產(chǎn)物進(jìn)行復(fù) 雜的連接克隆轉(zhuǎn)化，并對克隆進(jìn)行5個以上的一代測序（每個測序成本最少30元），無法進(jìn) 行多樣本多位點的甲基化檢測，特別是微量DNA樣本的多特定位點甲基化檢測，當(dāng)檢測大 樣本，多區(qū)域甲基化水平時，同樣價格昂貴，同樣如需檢測100個樣本中5個區(qū)域的甲基化 水平，大致費用為：100*5*5*30=75, 000元。
[0004] 綜上所述，當(dāng)今的甲基化組學(xué)研究都需要在后續(xù)的試驗中，在多樣本（臨床樣本 或細(xì)胞樣本）中對批量的來自于甲基化組學(xué)中特定位點進(jìn)行驗證，但上述的基因?qū)用娴募?術(shù)都無法勝任這種多樣本多位點的高通量單堿基分辨率甲基化檢測。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于提供一種高通量多樣本多靶點單堿基分辨率的甲基化水平檢 測方法。
[0006] 在本發(fā)明的第一方面，提供一種高通量檢測目的基因組的甲基化水平的檢測方 法，所述方法包括：
[0007] (1)提取n個受試樣本的目的基因組DNA;其中n為彡10的正整數(shù)（較佳地，n為 10-500 的正整數(shù)；如 15, 20, 50,100,140,150, 200, 300,400);
[0008] (2)對來自n個受試樣本的目的基因組DNA分別用重硫酸鹽、重亞硫酸鹽、亞硫酸 氫鹽或重亞硫酸氫鹽處理，分別獲得n種處理產(chǎn)物；
[0009] (3)分別以⑵的n種處理產(chǎn)物為模板，分別用BSP引物組擴(kuò)增含有CpG位點的序 列，獲得--對應(yīng)每一受試樣本的n種擴(kuò)增產(chǎn)物；

【權(quán)利要求】
1. 一種高通量檢測目的基因組的甲基化水平的檢測方法，其特征在于，所述方法包 括： ⑴提取η個受試樣本的目的基因組DNA;其中η為彡10的正整數(shù)； (2) 對來自η個受試樣本的目的基因組DNA分別用重硫酸鹽、重亞硫酸鹽、亞硫酸氫鹽 或重亞硫酸氫鹽處理,分別獲得η種處理產(chǎn)物； (3) 分別以（2)的η種處理產(chǎn)物為模板，分別用BSP引物組擴(kuò)增含有CpG位點的序列， 獲得--對應(yīng)每一受試樣本的η種擴(kuò)增產(chǎn)物； ⑷分別提供(ΙΝΤ(?種IlluminaIndexadapter正向接頭和相同數(shù)量反向 接頭，每一正向接頭和一反向接頭編成一組，形成(INT(?/_IT)+丨)2個不同組；選擇其中的 η個組，每組中對正向接頭與反向接頭退火形成雙鏈IlluminaIndexadapter,獲得的η組 退火形成雙鏈IlluminaIndexadapter與（3)獲得的η種擴(kuò)增產(chǎn)物分別連接；獲得各自連 接有不同組的接頭的η種連接產(chǎn)物； (5)將⑷中獲得的各自連接有不同組的接頭的η種連接產(chǎn)物進(jìn)行混合，用針對Illumina Index adapter接頭的引物序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增，進(jìn)行高通量測序。
2. -種構(gòu)建用于高通量檢測目的基因組的甲基化水平的多樣本文庫的方法，其特征在 于，所述方法包括： ⑴提取η個受試樣本的目的基因組DNA;其中η為彡10的正整數(shù)； (2) 對來自η個受試樣本的目的基因組DNA分別用重硫酸鹽、重亞硫酸鹽、亞硫酸氫鹽 或重亞硫酸氫鹽處理,分別獲得η種處理產(chǎn)物； (3) 分別以（2)的η種處理產(chǎn)物為模板，分別用BSP引物組擴(kuò)增含有CpG位點的序 列，獲得一一對應(yīng)每一受試樣本的η種擴(kuò)增產(chǎn)物；所述的BSP引物組的各引物中設(shè)置可與 IlluminaIndexadapter接頭連接的序列； ⑷分別提供([NT(Vtl)+1)種Illumina Index adapter正向接頭和相同數(shù)量反 向接頭，每一正向接頭和一反向接頭編成一組，形成(INTd)+I)2個不同組；選擇其中 的η個組，每組中對正向接頭與反向接頭退火形成雙鏈IlluminaIndexadapter,獲得的η組退火形成雙鏈IlluminaIndexadapter與（3)獲得的η種擴(kuò)增產(chǎn)物分別連接；獲得各自 連接有不同組的接頭的η種連接產(chǎn)物； (5)將⑷中獲得的各自連接有不同組的接頭的η種連接產(chǎn)物進(jìn)行混合，用針對IlluminaIndexadapter接頭的引物序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物即為多樣本文庫。
3. 如權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于，步驟（3)中，所述的BSP引物組包括SEQ IDNO: 1?SEQIDNO:60 的序列。
4. 如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，步驟（3)中，根據(jù)SEQIDNO: 1?SEQID N0:60的引物的退火溫度，分成多個PCR擴(kuò)增系統(tǒng)，分別進(jìn)行擴(kuò)增； 較佳地，SEQIDNO: 1?SEQIDNO: 22的引物退火溫度52°C，在一個PCR擴(kuò)增系統(tǒng)中 擴(kuò)增；SEQIDNO: 23?SEQIDNO: 50的引物退火溫度54°C，在一個PCR擴(kuò)增系統(tǒng)中擴(kuò)增； SEQIDN0:51?SEQIDN0:60的引物退火溫度60°C，在一個PCR擴(kuò)增系統(tǒng)中擴(kuò)增。
5. 如權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于，η為小于144的正整數(shù)，步驟（4)中，所 述的IlluminaIndexadapter正向接頭的核苷酸序列如SEQIDN0:61?SEQIDN0:72 所示； 所述的IlluminaIndexadapter反向接頭的核苷酸序列如SEQIDN0:73?SEQID NO:84所示。
6. 如權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于，步驟（5)中，運用Illuminasolexa，SOLID，IonTorrent或 454 方法測序。
7. 如權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述的方法為非疾病診斷方法。
8. -種用于高通量檢測目的基因組的甲基化水平的檢測試劑盒，其特征在于，所述試 劑盒中包括：SEQIDNO: 1?SEQIDNO:60的BSP引物。
9. 如權(quán)利要求7所述的檢測試劑盒，其特征在于，所述試劑盒中還包括： SEQIDN0:61?SEQIDN0:72所示的IlluminaIndexadapter正向接頭；和SEQID N0:73?SEQIDN0:84 所不的IlluminaIndexadapter反向接頭；或 所述試劑盒中還包括：重硫酸鹽、重亞硫酸鹽、亞硫酸氫鹽或重亞硫酸氫鹽。
10. 如權(quán)利要求9所述的檢測試劑盒，其特征在于，所述試劑盒中還包括： DNA抽提試劑； 熒光定量PCR檢測試劑； PCR擴(kuò)增試劑； PCR純化試劑；和/或DNA連接試劑。
【文檔編號】C12Q1/68GK104450872SQ201310444865
【公開日】2015年3月25日 申請日期:2013年9月25日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月25日
【發(fā)明者】余堅, 高維強, 趙仰星, 孫晉楓, 張紅宇, 顧峻, 何英華, 王韋 申請人:上海市腫瘤研究所