一種適合于二穗短柄草外源基因檢測及拷貝數分析的內標準基因及其應用的制作方法
【專利摘要】本發明公開了一種適合于二穗短柄草外源基因檢測及拷貝數分析的內標準基因及其應用，通過生物信息學分析和分子生物學實驗驗證，在二穗短柄草中尋找到了作為轉基因二穗短柄草定性、定量PCR檢測及拷貝數分析的內標準基因為BDFIM基因，其核苷酸序列如SEQ?ID?NO1所示。該內標準基因可用于定性、定量檢測轉基因二穗短柄草的外源基因，及用于分析外源基因在轉基因二穗短柄草種的拷貝數。
【專利說明】—種適合于二穗短柄草外源基因檢測及拷貝數分析的內標準基因及其應用
【技術領域】
[0001]本發明屬于生物工程【技術領域】，涉及一種適合轉基因二穗短柄草外源基因檢測及拷貝數分析的內標準基因及其應用。
【背景技術】
[0002]所謂的內標準基因，是某種植物中具有種間特異性、種內非特異性、低拷貝數特征的一類基因。種間特異性指的是選定的基因對于此物種是特異的，而在其他物種中具有很低的同源性；種內非特異性指的是內標準基因在同一物種的不同栽培種中具有很高的同源性和相似性。例如，在植物轉基因產品的定量檢測中，內標準基因常被用來作為定量檢測的內對照，要求內標準基因在不同栽培種中具有種內特異性的特點。在對轉基因產品進行定量檢測中，由于定量檢測的外源基因一般是低拷貝的，因此要求內標準基因具有低拷貝數的特點，一般內標準基因為I~3個拷貝，最理想的情況是I個拷貝。
[0003]在植物轉基因及其加工產品的檢測中，內標準基因的首要作用是確定檢測樣品的物種來源。在轉基因檢測中，如果待檢測的樣品是植物原料，那產品的植物來源是可以很容易從外觀知道。但是對于植物加工產品，如面粉、食品、植物油等產品，是很難從外觀上分清植物材料的來源。這時就需要內標準基因來對植物產品的來源進行鑒定。內標準基因是物種特異性的，可以用來將這一物種與其他的物種以至近源種區別開來。因此通過建立內標準基因的PCR檢測系統可以準確的判斷檢測樣品中的植物成分來源，為進一步分析奠定基礎。
[0004]植物內標準基因可以對核酸提取的效果進行評價。在轉基因產品檢測過程中，核酸提取的質量對于PCR結果有非常大的影響。由于植物材料之間有很大的差異，加工程度也不盡相同，因此核酸提`取方法也應根據不同的需要進行改進。在對樣品提取的核酸進行PCR分析之前，有必要對DNA提取的效果進行充分合理的評價，以保證PCR分析的準確性。對于DNA質量的評定可以通過分光光度計法、瓊脂糖凝膠電泳檢測和熒光測定法進行。但是這些方法只能對所抽提的核酸進行數量或質量上的粗略估計，并不能判斷抽提的DNA溶液中是否含有PCR反應的抑止因子。設立內標準基因作為實驗的一個對照是解決這一問題的有效方法。作為對照的內標準基因PCR體系的正常工作與否，可以指示抽提的樣品DNA能否用于進行PCR檢測分析。因此，內標準基因是排除假陰性結果的有效手段。
[0005]內標準基因在植物轉基因產品定量PCR檢測中起到內參照的作用。轉基因植物及其產品的定量PCR檢測可以分為兩種方法，即絕對定量法和相對定量法。簡單來說，絕對定量法獲的結果，是檢測樣品中的植物基因組或外源目的基因的絕對質量或拷貝數。相對定量法獲的結果，是檢測樣品中外源目的基因在樣品基因組DNA中的百分含量，結果用外源目的基因的拷貝數和植物基因組拷貝數的比值表示。在實際轉基因檢測和各國標簽制度實施時，依據的標準是樣品中的具體轉基因相對含量，其必須通過相對定量法分析獲得，而絕對定量在實際檢測中則只能作為相對定量方法的一個過程。內標準基因用于植物基因組DNA的質量或者拷貝數的定量分析。而且內標準基因對于轉基因的定量檢測起著決定性的作用，沒有合適的內標準基因是不可能對于轉基因植物及其加工產品進行定量分析的，也不能確定轉基因植物及其加工產品的準確的轉基因含量。
[0006]轉基因植物中外源基因拷貝數常影響目的基因的表達水平和遺傳穩定性。因此，轉基因研究中關鍵的一步就是檢測外源基因的拷貝數，以篩選出拷貝數少或單拷貝的轉基因植株供進一步的研究或育種利用。傳統的轉基因植株拷貝數檢測主要是Southern雜交法，但該方法工作量大，需要的DNA材料較多，費時費力，并且經常要用到放射性同位素等具有潛在危險的藥品。近年來，利用高通量、快速、靈敏的定量PCR方法檢測轉基因拷貝數逐漸受到科研人員的青睞。該方法根據Ct (cycle thresholds)值與起始模板數的對數值成反比線性關系的原理，制作標準曲線，獲得Ct值與起始模板數的相關性方程，將樣品的Ct值代入該方程就可獲得目的基因的起始模板數，通過與內標準基因起始模板數的比較，就可知道基因組中該外源基因拷貝數。
[0007]內標準基因在植物轉基因產品的定性和定量PCR檢測及拷貝數檢測中都有非常重要的作用，國際上對于植物內標準基因的研究也發展的非常快。到目前為止，文獻報道的用于轉基因檢測中的內標準基因共有27個。其中大豆的Lectin基因是最早用于轉基因抗草苷膦大豆GTS40-3-2檢測的內標準基因，Lectin基因是大豆中特有的凝集素基因，通過對Lectin基因的檢測，確定檢測樣品中是否含有大豆來源和判斷檢測樣品DNA的質量，并在轉基因大豆定量檢測中作為定量內參照。玉米的Zein、zssIIb、hmgA、Invertase和Adhl基因都曾被用作內標準基因進行轉基因玉米PCR檢測，也有文章對玉米的這幾個內標準基因進行了比較，發現上述幾個基因都適合于轉基因玉米的定性PCR檢測，但是目前還未發現關于對二穗短柄草內標準基因的報道。
[0008]二穗短柄草是一種冷季型溫帶禾本科植物，在一些地方也常常作為一種牧草，該種植物由于具備株型矮小、自花授粉、種子不散落，生命周期短、生長條件簡單等特點，近年來被作為一種新型的禾本科模式植物，因此轉基因二穗短柄草技術也迅速發展。由于外源基因的拷貝數對外源基因的穩定表達影響較大，因此當拿到一個轉基因植株時首先要對它的外源基因拷貝數進行分析，傳統的拷貝數分析是利用Southern檢測技術，該種方法費時費力，而且成本較高，如果要對大量的材料進行分析，工作量比較大。因此近年出現了利用定量PCR法對轉基因植物基因外源基因拷貝數分析，該種技術可以彌補Southern檢測技術的不足，尤其適合對大量材料進行高通量檢測。除此之外二穗短柄草也可以作為一種牧草，因此轉基因二穗短柄草也可能被加工成飼料，在對飼料進行轉基因檢測的時候也需要該種植物的內標準基因。但是目前國際上尚未有適合二穗短柄草外源基因檢測和拷貝數分析的內標準基因的報道。因此，篩選適合二穗短柄草外源基因檢測和拷貝數分析的內標準基因對促進二穗短柄草轉基因研究意義十分重大。

【發明內容】

[0009]本發明所要解決的技術問題在于提供一種適合于二穗短柄草外源基因檢測和拷貝數分析的內標準基因及其應用，克服目前尚未有適合二穗短柄草外源基因檢測和拷貝數分析的內標準基因的現狀。
[0010]本發明所述的適合于二穗短柄草外源基因檢測和拷貝數分析的內標準基因，是二穗短柄草內標準基因BDFIM基因，其序列如SEQ ID NOl所示，并根據BDFIM基因序列設計定性、定量PCR檢測的引物對BDFM-F/BDFM-R，設計Southern探針進行BDFM基因拷貝數分析，用于轉基因二穗短柄草檢測，其中，定性PCR檢測和定量PCR檢測的引物對相同，其序列如SEQ ID N02所示和SEQ ID N03所示，Southern探針序列如SEQ ID N04所示。
[0011]本發明的適合于二穗短柄草外源基因檢測及拷貝數分析的內標準基因的應用，用于定性、定量檢測轉基因二穗短柄草的外源基因。
[0012]本發明的適合于二穗短柄草外源基因檢測及拷貝數分析的內標準基因的應用，用于分析外源基因在轉基因二穗短柄草中的拷貝數。
[0013]進一步，本發明設計了利用內標準BDFM基因測定二穗短柄草外源基因拷貝數的引物對HPT-F/HPT-R，其序列分別如SEQ ID N05所示和SEQ ID N06所示。
[0014]進一步，本發明所述內標準基因-BDFM基因具備種內一致性，即所有的二穗短柄草品種均含有BDFIM基因；所述BDFIM基因還具備種間特異性，即在其它物種里沒有該基因；通過Southern雜交還證明了 BDFM基因在二倍體二穗短柄草基因組中的拷貝數是I。
[0015]本發明利用生物信息學手段對BDFM基因序列進行分析，獲取了二穗短柄草的內源基因BDF頂序列，其序列如SEQ ID NOl所示。通過利用定性、定量PCR法分別對14種不同品種的二穗短柄草和16種其它物種進行檢測，證明二穗短柄草BDFM基因種間特異性、種內非特異性的特點；通過利用Southern雜交方法對7種不同品種二穗短柄草進行BDFM基因拷貝數分析，結果表明3種不同品種二倍體二穗短柄草中BDFIM基因都是I個拷貝，在4種不同品種多倍體二穗短柄草中BDFIM基因是多拷貝。由于目前用于二穗短柄草轉基因研究的受體材料以二倍體為主，所以，BDFIM基因符合內標準基因的低拷貝特點，通過這些實驗結果表明=BDFIM基因符合內標準基因的特點。
[0016]本發明的通過對二穗短柄草的外源基因HPT基因進行拷貝數分析，進一步證明了該BDFIM基因可以作為二穗短柄草的內標準基因。
[0017]本發明的有益效果:
[0018]本發明通過生物信息學分析和分子生物學實驗驗證，在二穗短柄草中尋找到了作為轉基因二穗短柄草外源基因檢測和拷貝數分析的內標準基因-BDFM基因，該BDFM基因具有種內一致性、種間特異性、低拷貝數的特點，符合內標準基因的標準要求，適合于二穗短柄草外源基因檢測及拷貝數分析的內標準基因。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0019]圖1為BDFIM片段的核苷酸序列及定性、定量PCR引物位置。
[0020]圖2為BDFM基因種內非特異性鑒定結果，其中，M為marker，I為BD21，2為BD21-3，3 為 BDl-1,4 為 BD29_1，5 為 BD18_1，6 為 BD23_1，7 為 BD26_1，8 為 BD13_1，9 為BD2-3,10 為 BD20-1,11 為 BD10-1，12 為 BD28,13 為 BD25-1，14 為 BD19-2，15 為陰性對照。
[0021]圖3為BDF頂基因種間特異性鑒定結果，其中M為Marker，I為二穗短柄草，2為月季，3為棉花，4為黑麥草，5為康乃馨，6為麥冬，7為非洲菊，8為狗牙根，9為煙草，10為玉米，11為水稻，12為大 豆,13為小麥，14為大麥,15為擬南芥。
[0022]圖4為BDFM基因種內非特異性定量鑒定結果。
[0023]圖5為BDFM基因種間特異性定量鑒定結果。[0024]圖6為Southern-Blot分析內標準基因的拷貝數，其中I為Bd21_3，2為Bd21，3
為 Bd29-1，4 為 Bdl9-2，5 為 Bd20_l，6 為 Bd28，7 為 BdlO-1，8 為空白對照。
[0025]圖7為BdFM基因實時定量PCR擴增曲線。
[0026]圖8為BdF頂基因標準曲線圖。
[0027]圖9為HPT基因實時定量PCR擴增曲線。
[0028]圖10為HPT基因標準曲線圖。
【具體實施方式】
[0029]以下結合具體實施例進一步詳細描述本發明的技術方案，但所述實施例不限制本
發明的保護范圍。應當說明的是，以下實施例僅用以說明本發明的技術方案而非限制，盡管
參照較佳實施例對本發明進行了詳細說明，本領域的普通技術人員應當理解，可以對發明
的技術方案進行修改或者等同替換，而不脫離本發明技術方案的精神和范圍，其均應涵蓋
在本發明的權利要求范圍中。
[0030]實施例1
[0031]1、實驗材料
[0032]1.1植物材料
[0033]二穗短柄草:選用的二穗短柄草材料為二倍體植株和多倍體植株，詳見表1。
[0034]表1實驗中所選用的二穗短柄草材料
[0035]
【權利要求】
1.一種適合于二穗短柄草外源基因檢測及拷貝數分析的內標準基因，其特征在于，所述內標準基因為BDF頂基因，其核苷酸序列如SEQ ID NOl所示。
2.根據權利要求1所述的適合于二穗短柄草外源基因檢測及拷貝數分析的內標準基因，其特征在于，針對所述內標準基因序列設計定性、定量PCR檢測的引物，設計Southern探針進行BDFIM基因拷貝數分析，用于轉基因二穗短柄草檢測，其中，定性、定量PCR檢測的引物對相同，其序列如SEQ ID N02所示和SEQ ID N03所示，Southern探針序列如SEQ IDN04所示。
3.如權利要求1所述的適合于二穗短柄草外源基因檢測及拷貝數分析的內標準基因的應用，其特征在于，用于定性、定量檢測轉基因二穗短柄草的外源基因。
4.如權利要求1所述的適合于二穗短柄草外源基因檢測及拷貝數分析的內標準基因的應用，其特征在于，用于分析外源基因在轉基因二穗短柄草中的拷貝數。
5.如權利要求4所述的適合于二穗短柄草外源基因檢測及拷貝數分析的內標準基因的應用，其特征在于，分析外源基因在轉基因二穗短柄草種的拷貝數所用的引物對為HPT-F/HPT-R，其序列如 SEQ` ID N05 所示和 SEQ ID N06 所示。
【文檔編號】C12Q1/68GK103525922SQ201310454983
【公開日】2014年1月22日 申請日期:2013年9月29日 優先權日:2013年9月29日
【發明者】儲昭慶, 朱宏 申請人:上海辰山植物園