一種生物發酵有機肥及其制備方法
【專利摘要】本發明公開了一種生物有機肥發酵復合菌劑，其含有淀粉霉（Amylomyces?rouxii）、青霉屬菌（Penicillium?cordubense）、嗜冷枯草芽孢桿菌（Bacillus?phychrophilus）。在種養殖廢棄物堆體中接種本發明的生物有機肥發酵復合菌劑，在北方低溫季節能迅速提高堆體溫度，且能使堆體保持50℃以上的高溫15天左右，縮短了發酵周期，能有效殺滅動物糞便中的病原物和寄生蟲。由此生產的有機肥發酵徹底，養分含量高，可作為優良的植物有機肥使用。
【專利說明】一種生物發酵有機肥及其制備方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于資源利用領域，具體涉及一種生物發酵有機肥及其制備方法。
【背景技術】
[0002]隨著百姓對畜禽產品需求的日益增加，我國畜禽養殖量每年以超過10%的速度增長，并逐漸集中在經濟發達、交通便利、市場需求大的大中城市及沿海地區。但同時大量畜禽糞污卻不能得到有效處置和利用，引發了一系列環境和生態問題，如造成水體面源污染加劇、土壤中污染物累積等，已引起公眾和政府普遍關注。2013年中共中央國務院一號文件再次重申了“強化農業生產過程環境監測，積極開展農業面源污染和畜禽養殖污染防治”工作。因此，在確保畜禽養殖產業有效發展、確保農民收入的前提下，有效地處置、利用畜禽廢棄物、減少環境和生態的污染風險迫在眉睫。
[0003]目前，國內外在畜禽糞便的處理中以好氧處理(高溫堆肥)、厭氧處理(沼氣)和焚燒處理(灰化)為主。我國利用各種技術處理畜禽糞便以期實現減量化、無害化、資源化的目的，目前我國對畜禽糞便的加工處理方法主要集中在以下三種:飼料化、能源化、肥料化等。
[0004]I)飼料化。畜禽糞便中不僅含有大量未消化的蛋白質、維生素而且還有一定數量的糖類物質和豐富的氨基酸種類。為了滿足畜牧業市場的飼料供應，開發出具有較高的蛋白質含量和齊全的氨基酸種類的飼料來源是目前最首要任務。國內外大量研究結果表明，雞糞不僅是反芻動物良好的蛋白質補充料，也是單胃動物和魚類良好的飼料蛋白來源，雞糞已經成為最受關注的一種非常規飼料資源。
[0005]2)能源化。能源化有兩種手段:焚燒和厭氧發酵。將畜禽糞便直接投入專用爐下充分燃燒成為灰渣，產生的熱量可用于發電等。這種方法可使畜禽糞便在較短時間內減量90%以上，并殺滅糞便中的有害`病菌和蟲卵。但投資大，處理費用昂貴，燃燒時釋放大量C02和其它有害氣體，對大氣環境有不良影響，同時一些有利用價值的營養元素被燒掉，造成再生資源的浪費。目前研究最多、最有發展前途的是通過厭氧消化工藝獲得沼氣。厭氧發酵生產沼氣，為生產生活提供能源，同時沼渣和沼液又是很好的有機飼料和肥料，這樣既減少了污染，又提高了污染物治理的經濟效益。但較大規模的厭氧處理沼渣沼液需深化利用才能排放。
[0006]3)肥料化。目前，利用畜禽糞便生產有機肥是備受人們歡迎的方式，不僅解決了污染問題而且還能最大限度的廢物資源化利用。堆肥過程產生的高溫能夠殺死大量病原微生物、雜草種子和害蟲，使有機物達到無害化和資源化的利用，除此之外，堆肥結束后生產的有機肥還能夠為大量的農作物提供必需的N、P、K等營養成分和有機質，成為農業發展的寶貴資源。肥料化尤其適宜推廣種養循環的經濟模式，以徹底理順糞污消解輸出的渠道，使畜禽養殖業生產廢棄物的綜合利用和糞污治理處于一個完整的系統工程中，具有運行成本相對較低、處理方式靈活方便的優勢。

【發明內容】
[0007]本發明首先提供一種用于生物發酵有機肥的生物菌劑。
[0008]本發明提供的生物發酵有機肥復合菌劑,其含有淀粉霉(Amylomyces rouxii)、青霉屬菌(Penicillium cordubense)、嗜冷枯草芽抱桿菌(Bacillus phychrophilus)。
[0009]其中，所述的淀粉霉的保藏號為CGMCC N0.6874。
[0010]其中，所述的青霉屬菌的保藏號為CGMCC N0.6876。
[0011]本發明不限定嗜冷枯草芽孢桿菌的菌株號，現有公布的嗜冷枯草芽孢桿菌均可用于本發明，如公布于王亮，牛糞好氧堆肥中微生物多樣性及生產應用研究，2012，北京林業大學。
[0012]其中，所述淀粉霉的活菌數為10億/克以上，所述的青霉屬菌的活菌數為20億/克以上，所述嗜冷枯草芽孢桿菌的活菌數為10億/克以上。
[0013]在本發明一個實施方案，所述的生物菌劑可以為液體菌劑。
[0014]本發明還提供一種生物發酵有機肥的制備方法，用粉碎的農作物秸桿將畜禽糞便的C/N比調整到28-32，含水量調整至60-65%，按5_8%。的比例接入所述的生物菌劑，當堆體溫度高于55度時，翻堆通氣，經過20-30天好氧高溫發酵。
[0015]本發明的淀粉霉和青霉屬菌菌株分離與篩選過程如下:
[0016]①采用平板稀釋法分別從新鮮牛糞、不同發酵階段牛糞以及腐熟后的牛糞中進行微生物分離。稱取各樣品各IOg分別放入裝有90mL無菌水的三角瓶中，在搖床上振蕩30min，使樣品充分分散，靜置20min后即為KT1稀釋液，然后連續稀釋制成10_2_10_8濃度的稀釋液備用。取100 μ L各濃度的稀釋液，采用常規涂抹法用涂布器在改良高氏I號固體培養基上涂布，每個濃度梯度三個重復，分別置于25°C、35°C、50°C恒溫培養箱中培養。3d后挑取平板上長出的單菌落，進一步純化培養，并于4°C保存。
[0017]改良高氏I號培養基，其中葡萄糖10.0g/L、蛋白胨5.0g/L、KNO3L 0g/L、K2HPO40.5g/L、MgSO4.7Η200.5g/L、NaCl0.5g/L、FeSO40.01g/L、水 1000ml、pH7.2、瓊脂
1.5%-2.0%。
[0018]②根據菌株在纖維素一剛果紅平板上形成透明圈的快慢、透明圈明晰程度、透明圈與菌落直徑比值(D/d)的大小，篩選出了 I株中溫菌，該菌株在培養的第2天即出現清晰的透明圈，在培養第4天D/d達到10.7。該菌株菌落邊緣不整齊絨毛長，草叢狀，潔白色，毛上有黑色孢子。
[0019]③測定該菌株的ITS序列進行分子生物學鑒定，所用引物為ITSl:TCCGTAGGTGAACCTGCGG (SEQ ID N0.2) ；ITS4:TCCTCCGCTTATTGATATGC (SEQ ID N0.3)，序列如SEQ ID N0.1所示，與其它公布的淀粉霉的ITS序列同源性為99%以上，鑒定為淀粉霉(Amylomyces rouxii),命名為CZl,并于2012年11月23日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，簡稱CGMCCJia:北京市朝陽區北辰西路I號院3號，中國科學院微生物研究所，保藏編號為CGMCC N0.6874。
[0020]④根據菌株在纖維素一剛果紅平板上形成透明圈的快慢、透明圈明晰程度、透明圈與菌落直徑比值(D/d)的大小，篩選出了 I株低溫菌，該菌株在培養的第2天即出現清晰的透明圈，在培養第4天D/d達到9.2。該菌株菌落灰綠色，周邊乳白色，短絨毛狀，反面肉色，營養菌絲樹根狀，生長較快。
[0021]⑤測定該菌株的ITS序列進行分子生物學鑒定，所用引物為ITSl:TCCGTAGGTGAACCTGCGG (SEQ ID N0.2) ；ITS4:TCCTCCGCTTATTGATATGC (SEQ ID N0.3)，序列如SEQ ID N0.4所示,與其它公布的青霉屬菌(Penicillium cordubense)的ITS序列同源性為99%以上，鑒定為青霉屬菌(Penicillium cordubense)，命名為CZ2，并于2012年11月23日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，簡稱CGMCCJia:北京市朝陽區北辰西路I號院3號，中國科學院微生物研究所，保藏編號為CGMCC N0.6876。
[0022]本發明的淀粉霉新菌株CZ1，能在環境溫度為8°C左右的條件下，使堆肥迅速起爆，且能使堆體保持50°C以上的高溫15天，縮短了發酵周期，能有效殺滅動物糞便中的病原物和寄生蟲。堆肥發酵結束后，堆肥產物養分含量高，PH8.0左右，可作為優良的植物有機肥使用。
[0023]本發明的青霉屬菌(Penicillium cordubense)CZ2,能在環境溫度為8°C左右的條件下，使堆肥迅速起爆，且能使堆體保持50°C以上的高溫15-18天，縮短了發酵周期，能有效殺滅動物糞便中的病原物和寄生蟲。堆肥發酵結束后，堆肥產物養分含量高，PH8.0左右，可作為優良的植物有機肥使用。
[0024]本發明所述的生物發酵有機肥復合菌劑可以在環境溫度為5°C左右的低溫環境下用于畜禽糞便堆肥處理，使我國北方地區有機肥生產每年可連續進行10-15個周期，每個生產周期20天左右完成。堆肥產物的養分含量均高于標準NY-525-2012中的規定，重金屬含量遠遠低于標準NY-525-2012中的規定。項目生產的肥料在多種植物上施用后，均能促進植物的生長發育，提聞植物廣品的品質。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0025]圖1所示為堆肥過程中堆料的溫度變化。
【具體實施方式】
[0026]以下實施例用于說明`本發明，但不用來限制本發明的范圍。
[0027]若無特別說明，本發明中所述的“份”是指“重量份”。
[0028]實施例1生物有機肥發酵復合菌劑的制備
[0029]I)淀粉霉CZl發酵
[0030]將淀粉霉CZl接種至改良高氏I號固體培養基斜面，于35°C恒溫條件培養72h得到斜面種子；
[0031]將斜面種子接種至改良高氏I號液體培養基，于35°C恒溫條件，180r/min轉速振蕩培養72h得到液體種子；
[0032]將液體種子以5% (V/V,即每100ml液體培養基接種5ml液體種子)接種量,接種到液體發酵罐中的生產培養基中，進行菌種生產，于持續通氣條件下，35°C恒溫培養4天。培養后的發酵液即可作為菌劑使用。
[0033]所述的改良高氏I號固體培養基成分為:其中葡萄糖10.0g/L、蛋白胨5.0g/L、KNO3L Og/L、K2HPO40.5g/L、MgSO4.7Η200.5g/L、NaCl0.5g/L、FeSO40.01g/L、水 1000ml、pH7.2、瓊脂2.0%，分裝入試管中，每管5-10ml，塞上棉塞，高溫高壓滅菌20min，之后擺成斜面。
[0034]所述的改良高氏I號液體培養基成分同前，無瓊脂。[0035]2)青霉屬菌(Penicillium cordubense) CZ2 發酵
[0036]將青霉屬菌CZ2接種至改良高氏I號固體培養基斜面，于25°C恒溫條件培養72h得到斜面種子；
[0037]將斜面種子接種至改良高氏I號液體培養基，于25°C恒溫條件，180r/min轉速振蕩培養72h得到液體種子；
[0038]將液體種子以5% (V/V,即每100ml液體培養基接種5ml液體種子)接種量,接種到液體發酵罐中的生產培養基中，進行菌種生產，于持續通氣條件下，25°C恒溫培養4天。培養后的發酵液即可作為菌劑使用。
[0039]所述的改良高氏I號固體培養基成分為:其中葡萄糖10.0g/L、蛋白胨5.0g/L、KNO3L Og/L、K2HPO40.5g/L、MgSO4.7Η200.5g/L、NaCl0.5g/L、FeSO40.01g/L、水 1000ml、pH7.2、瓊脂2.0%，分裝入試管中，每管5-10ml，塞上棉塞，高溫高壓滅菌20min，之后擺成斜面。
[0040]所述的改良高氏I號液體培養基成分同前，無瓊脂。
[0041 ] 3 )嗜冷枯草芽孢桿菌發酵
[0042]將嗜冷枯草芽孢桿菌(王亮，2012)接種至牛肉膏蛋白胨固體培養基斜面，于37°C恒溫條件培養72h得到斜面種子；
[0043]用接種針挑取斜面菌落，接種至帶牛肉膏蛋白胨液體培養基的三角瓶中，在35°C，160r/min條件下培養12h得到種子液。
[0044]將液體種子以5% (V/V,即每100ml液體培養基接種5ml液體種子)接種量,接種到液體發酵罐中的生產培養基中，進行菌種生產，于持續通氣條件下，35°C，160r/min條件下培養2天。培養后的發酵液即可作為菌劑使用。
[0045](4)將淀粉霉CZl發酵液、青霉屬菌CZ2發酵液、嗜冷枯草芽孢桿菌發酵液按重量比，1:2:1進行混合，即得本發明的生物發酵有機肥復合菌劑，其中淀粉霉的活菌數為10億/克以上，所述的青霉屬菌的活菌數為20億/克以上，所述嗜冷枯草芽孢桿菌的活菌數為10億/克以上。
[0046]實施例2生物有機肥制備方法
[0047]在環境溫度5°C左右的低溫條件下，將新鮮牛糞與粉碎秸桿以一定比例進行混合，調整堆料的C/N為30，含水量為65%。
[0048]將實施例1生產的菌劑按照質量比8%。接種到堆料混合物中，堆體溫度高于55度時，翻堆通氣，進行堆肥發酵。同時以不接入本發明的菌劑的堆體為對照。
[0049]監測發酵過程中堆料的溫度變化，并于發酵結束后，測定堆肥產物的養分含量和種子發芽指數(GI)。
[0050]測定方法:堆肥樣品養分含量根據有機肥料農業行業標準(NY-525-2012)進行測定。采用H2SO4-H2O2聯合消煮,全氮采用Kjeltec2300型凱氏定氮儀測定,全磷采用鑰;鑰黃比色法分光光度計測定，全鉀火焰光度法FP6410型火焰光度計測定。堆肥樣品有機碳含量采用灼燒法測定。
[0051]堆肥結束后用小土鉆多點鉆取堆體中部樣品，每處理采樣500g，混合均勻，然后采用四分法取樣200g。稱取50g加250ml蒸懼水混合攪拌30min后，經3000r/min離心lOmin，上清液即為堆肥浸提液。在直徑9cm鋪有濾紙的無菌培養皿中，均勻放入20粒白菜(Brassica campestris L.)種子,吸取5ml堆肥浸提液潤濕濾紙，以蒸懼水作對照，每個處理3次重復，在25°C恒溫培養箱中培養24h，測定種子發芽率和根長，并計算種子發芽指數。
[0052]GI(%)=處理平均發芽率X處理平均根長/(對照平均發芽率X對照平均根長)X 100。
[0053]從堆肥過程中堆料的溫度變化情況(圖1)可以看出，在環境溫度為5°C左右的低溫條件下，添加本發明復合菌劑與未接菌對照的堆體溫度均呈現出先上升后下降的趨勢，物料在堆積初期由于微生物的活動逐漸分解，釋放熱量，不斷提高了堆內溫度。接菌的處理在第2d達到50°C以上，第Ild達到最高溫，為60.3°C，而CK在整個發酵期間始終未達到50°C，其在第IOd達到最高溫43.1°C。從升溫速度和最高溫來看，添加本發明菌劑的處理均高于CK。堆肥溫度在55°C條件下保持3d以上(或50°C以上保持5-7d)，是殺滅堆肥所含致病微生物和害蟲卵，保證堆肥的衛生指標合格和堆肥腐熟的重要條件。接種本發明復合菌劑的處理堆料維持55°C以上的時間為9d，達到了無害化標準，而CK處理的堆料未達到無害化標準。隨著有機物的消耗，微生物的代謝活動減慢，自身產熱量減少，并由于環境溫度較低，從而導致堆體的溫度迅速下降至20°C左右，并在堆肥結束后，堆體溫度穩定在20°C左右。
[0054]種子發芽指數(GI) ≥80%，說明有機肥料對植物無毒性并已達到腐熟。測定發酵20天時兩個處理堆料的種子發芽指數(見表1)，接種本發明復合菌劑的堆肥處理，在第20天，其種子發芽指數為90.7%，說明此時堆料已完全腐熟。而未接菌(CK)堆料，種子發芽指數為65.4%，說明發酵不徹底。
[0055]測定發酵20天時堆料的養分含量(見表1)可以看出，接種本發明復合菌劑的堆料其有機質和全效氮磷鉀的含量均顯著高于未接菌的對照(CK)，其總養分含量是CK的2倍，達到并高于NY-525-2012中有機肥質量的標準。而未接菌(CK)堆料，養分含量未達到NY-525-2012中有機肥質量的標準。
[0056]表1堆肥樣品的種子發芽指數和養分含量
【權利要求】
1.一種生物有機肥發酵復合菌劑，其含有淀粉霉(Amylomyces rouxii )、青霉屬菌(Penicillium cordubense)、嗜冷枯草芽抱桿菌(Bacillus phychrophilus)。
2.如權利要求1所述的生物菌劑，其特征在于，所述的淀粉霉的保藏號為CGMCCN0.6874。
3.如權利要求1所述的生物菌劑，其特征在于，所述的青霉屬菌的保藏號為CGMCCN0.6876。
4.如權利要求1~3任一項所述的生物菌劑，其特征在于，所述淀粉霉的活菌數為10億/克以上，所述的青霉屬菌的活菌數為20億/克以上，所述嗜冷枯草芽孢桿菌的活菌數為10億/克以上。
5.如權利要求1~4任一項所述的生物菌劑，其特征在于，其為液體菌劑。
6.—種生物發酵有機肥制備方法，其特征在于，用粉碎的農作物秸桿將畜禽糞便的C/N比調整到28-32，含水量調整至60-65%，按5-8%。的比例接入權利要求1~5任一項所述的生物菌劑，當堆體溫度高于55度時，翻堆通氣，經過20-30天好氧高溫發酵。
7.制備權利要求6所述的制備方 法制備的生物發酵有機肥。
【文檔編號】C12R1/07GK103497899SQ201310454820
【公開日】2014年1月8日 申請日期:2013年9月29日 優先權日:2013年9月29日
【發明者】劉克鋒, 王順利, 王紅利, 高程達, 石愛平 申請人:北京農學院