一種嗜熱酮還原酶突變體、編碼基因及其應用的制作方法
【專利摘要】本發明提供了一種嗜熱酮還原酶突變體、編碼基因、重組載體及其應用。所述突變體由SEQ?ID?No.1所示氨基酸序列經點突變得到，所述點突變為：第21位突變為亮氨酸，和/或第118位突變為組氨酸或谷氨酸。本發明的有益效果主要體現在：本發明提供了一種嗜熱酮還原酶突變體，突變特定位置的氨基酸生成的突變體同野生型酶相比，在熱穩定性和催化活性相當的前提下，提高了反應產物的旋光選擇性。
【專利說明】—種嗜熱酮還原酶突變體、編碼基因及其應用
(-)【技術領域】
[0001]本發明涉及一種嗜熱酮還原酶突變體、編碼基因、重組載體及其應用。
(二)【背景技術】
[0002]生物學上，手性產物的生成可經過化學與酶的催化，不對稱還原，多步反應合成。其中，生物催化的不對稱還原在理論上說，在溫和的條件下可以使產物對映選擇性達到99%。然而，在本發明中超嗜熱菌海棲熱袍菌表達的蛋白Tm酶活反應初始時并不能使產物的單一構型達到理想值，需要在同源建模、分子模擬和化學分子量分析等基礎上，對酶進行理性設計，定點突變，以期望能生成有效的生物催化酶。
[0003]目前越來越多的藥物或其中間體是通過一種生物酶催化合成的方式，而非化學合成。很明顯，酶催化相比于傳統的化學合成有極大的優勢:1，生物反應中可避免有毒的反應試劑或溶劑；2，酶具有高效率、底物特異性等特點，使得在反應中保護抗體的羰基團；3，避免了包括消旋化等在內的副反應。
[0004]國內外對于生物催化的研究越來越多，其中一個關鍵問題是所用的酶往往不能完全滿足實際工業化生產的要求，需要經過進一步的改造，以提高其穩定性，活性及手性選擇性。通過理性設計點突變的方法構建新酶更是一種常規方法。構建突變體酶改造的方法主要可分為三種類:非理性突變，半理性突變，理性突變。
[0005]非理性突變:首 先對基因隨機突變，體外隨機突變的技術多種多樣，主要有易錯PCR技術(error-prone PCR),DNA重排技術(DNA rearrangement method),基因家族重排技術(gene family rearrangement method)等,獲得基因文庫后進性篩選出有利的突變體。這種方法工作程序簡單明了，可能會出現突變極好的突變體，但也可能不會。突變庫容量較大，篩選出有利突變體的比例較低。
[0006]半理性突變:組合活性位點測試(CASTing)就是其中的一種。基本要點是:通過同源建模或晶體結構確定酶底物口袋中側鏈朝向位點的氨基酸殘基，同時選擇可以與其相互作用的另一個殘基，構建飽和突變體庫，以達到減少突變庫容量的同時增加篩選出有益突變的概率。其構庫依據一般為選定底物口袋SA范圍內的所有氨基酸殘基，將側鏈朝向底物口袋的選出，根據其所在的位點的二級結構(a螺旋為n+4，^折疊為n+2，loop為n+1)選定另一個氨基酸，針對這兩個氨基酸構建飽和突變進行篩選。這種策略構建的突變庫庫容量小，有效性高。
[0007]理性突變:在酶-底物三維建模和底物對接的基礎上，加以軟件分析，通過化學量子計算、熱能計算、分子動力學分析等，在酶活性中心區域選擇有效的點進行定向突變，直接獲得有益的突變體。這種方法突變庫的量極小，篩選出優突變的概率基本上達到100%。然而，前期的計算工作量極大，時間長需要知識的較多前期積累，現階段還無法達到通過先計算再進行定點定向突變的程序。
[0008]很多的文獻和專利中都報道了關于酮還原酶催化還原含酮基底物生成羥基化的產物，使反應變得高效率，具有底物特異性或旋光純選擇性等優勢。例如，有些研究是從赭色擲孢酵母提取出一種酮還原酶催化對取代乙酰苯(Cl-，Br-, Me-, OMe-, MeC3, CF3-等)，旋光選擇性極低，需要通過理性設計突變位點，定點突變將其氨基酸序列中242位的甲硫氨酸以亮氨酸取代，氨基酸序列中245位的谷氨酰胺以脯氨酸取代，組成有效的雙突變體酶。該突變體酶在原條件下催化具有各種取代基的對取代乙酰苯，使生成的產物構型由R-轉變為S-，同時使原S-產物的ee值提高至99%。這一成果具有極高的價值。
[0009]也有相關研究如:提取于橘青霉的酮脂還原酶(ker)，用于催化4_溴_3_氧基丁酸生成高純度的(S-) 4-溴-3-羥基丁酸，酶活穩定性低，一般在30°C熱浴6h后酶活降低到初始酶活的15%。為了提高穩定性，易錯聚合酶鏈式反應隨機突變，然后對突變體進行高通量的篩選，最終獲得熱穩定性提高的單突變體，它們分別是在其特定氨基酸序列中54位的亮氨酸被谷氨酰胺取代成的單突變體，氨基酸序列中245位的精氨酸被賴氨酸取代成的單突變體，和氨基酸序列中271位置的天冬酰胺被天冬氨酸取代成的單突變體酶，尤其是氨基酸序列中54位的亮氨酸被谷氨酰胺取代的突變體酶在30°C熱浴6h后，活性提高到初始酶活的62%，突變后的效果非常顯著。
(三)
【發明內容】

[0010]本發明目的是提供一種產物ee值高的嗜熱酮還原酶突變體、編碼基因、重組載體及其應用。
[0011]本發明采用的技術方案是:
[0012]一種嗜熱酮還原酶突變體，由SEQ ID N0.1所示氨基酸序列經點突變得到，所述點突變為:第21位突變為亮氨酸，和/或第118位突變為組氨酸或谷氨酸。
[0013]2-羥基-4-苯基丁酸乙酯(HPBE)是合成眾多血管緊張素轉化酶，抑制劑類治療高血壓和充血性心力衰竭藥物的關鍵手性中間體。如:苯那普利(Benazepril)、依那普利(Enalapril )、賴諾普利(Lisinopril )、西拉普利(Cilazapril )、培哚普利(Perindopril )、喹那普利(Quinapril)、螺普利(Spirapril)和雷米普利(Ramipril)等。因此，2_輕基-4-苯基丁酸乙酯在該類藥物合成中具有相當的重要性，它的制備一直是國內外研究的熱點之一，吸引了許多的化學科技工作者對其制備方法進行廣泛的研究，報道了大量的制備方法。
[0014]海棲熱袍菌表達的酮還原酶Tm能夠催化特異的酮酯，并能夠改變其催化效率與對映選擇性。本發明以EOPB為模式底物，該酶能夠催化EOPB不對稱加氫合成S-HPBE達到ee值為81%，通過對該酶活性區域理性設計/定點突變。W21，W86，P87，W118四個點進行定點飽和突變篩選出突變體，提高其ee值，但并盡量不減少其酶活穩定性、米氏參數和比活。這樣就能獲得理想的酮還原酶。
[0015]從海棲熱袍菌提取可編碼醛酮還原酶的基因Tm，經過保守序列比較、同源建模等方式分析，其開放閱讀框是861bp，編碼蛋白的理論相對分子質量是33.23kDa，利用PET28a(+ )構建基因tadh的大腸桿菌表達系統。將重組的特定位點基因突變導入受體細胞反應，其是否成功可通過合成寡核苷酸進行測序檢驗。本發明中的突變體酮還原體酶的合成及驗證必須經過以下過程:
[0016]1、通過PCR定點突變來改變編碼酮還原酶的特定基因，其中應有到的原料脫氧寡核苷酸，Taq酶，Mg2+，及PCR緩沖液都是由公司購買而來的。新合成的寡核苷酸鏈酮母鏈是相同的，但只有被突變的位點氨基酸改變。
[0017]2、將突變后的基因轉到一個克隆載體上，形成一個完整重組質粒。將重組質粒轉化到感受態細胞內，在適宜的培養基內培養宿主細胞。
[0018]3、活化表達酮還原酶，分離、收集并純化。
[0019]4、檢測單突變體酶催化生成的產物的ee值和轉化率，選擇合適的突變體。
[0020]5、根據步驟1，克隆雙突變體。
[0021]6、催化突變體催化反應，并檢測其還原酶活力、旋光選擇性及熱穩定性。
[0022]肽鏈的合成可通過DNA序列和還原的氨基酸序列鑒定出來。由于遺傳密碼子的自然退化，導致一個密碼子翻譯多個氨基酸或終止信號，或者其它的DNA序列編碼相同的氨基酸序列等等。這樣就可以理解關于這些DNA和氨基酸序列的等位基因的突變體的存在是一種很自然的現象。同時我們可以有目的性的引導這種突變。氨基酸序列中插入、取代或缺失、顛倒或其在其一個或兩個末端添加數個氨基酸而得到，且與原來所示的氨基酸序列具有90%以上的同一性，且保持其酮還原酶活性。這些氨基酸的替代可以建立在其本身極性、帶電性、可溶性、疏水性、親水性、兩親性的相似性的基礎上。例如，帶負電的氨基酸有天冬氨酸和谷氨酸，帶正電的氨基酸有賴氨酸和精氨酸，含有不帶電的極性基團的氨基酸和含有非極性基團的氨基酸具有相似的親水性，如:亮氨酸，異亮氨酸，纈氨酸，甘氨酸，丙氨酸，天冬酰胺，谷氨酰胺，絲氨酸，蘇氨酸，苯丙氨酸，和絡氨酸。前面所說的聚合肽鏈的鹽類和脂類可以發生突變，同樣也有前面所說的聚合肽鏈的前導序列。比如，前導序列含有N-末端的甲硫氨酸，可能會被N-甲酰甲硫氨酸所替代，從而發生突變。這些突變在本發明中都有可能出現。
[0023]這里的酮還原酶的基因突變具有能夠催化底物生成旋光純產物。而定點的選擇可依賴于蛋白的晶體結構圖譜，分子同源建模，化學分子量分析，分子生物學和蛋白化學技術的基礎上進行參考分析。這些選擇出來的特殊氨基酸位置是影響該酶催化特性的重要因素，可通過X-射線晶體圖譜結構上確定，在本發明酮還原酶中的突變位點包括Trp21，Trp86, Pro87, Trpll80
[0024]優選的，所述突變體氨基酸序列為下列之一:SEQ ID N0.3 (突變體W21L)、SEQ IDN0.4 (突變體 W21L/W118E)、SEQ ID N0.5 (突變體 W21L/W118H)。
[0025]本發明還涉及編碼所述的嗜熱酮還原酶突變體基因，以及含有所述基因的重組載體和基因工程菌。本領域普通技術人員根據本發明提供的突變體氨基酸序列，可以方便的進行重組獲得基因工程菌，以基因工程菌發酵培養獲得的菌體細胞或菌體細胞破碎后的上清液作為酶源，可催化含酮基底物還原獲得光學純手性醇。其酶液純化的過程可通過Ni+柱純化、鹽析、脫鹽等步驟，或者通過70~80°C熱純化IOmin~3h等方式。轉化可按下述方法進行:在pH6.0~8.0的磷酸鹽緩沖液中，在NADP+、葡萄糖脫氫酶、葡萄糖存在下，在本發明酮還原酶作用下，不對稱還原含酮基底物，制得手性醇。
[0026]本發明還涉及所述的基因在制備重組嗜熱酮還原酶中的應用。
[0027]本發明還涉及所述的嗜熱酮還原酶突變體在催化2-氧代-4-苯基丁酸乙酯不對稱加氫合成(S ) -2-羥基-4-苯基丁酸乙酯中的應用。
[0028]優選的，所述不對稱加氫合成在10~80°C下進行。
[0029]在本發明中，從海棲熱袍菌中找到可編碼醛酮還原酶的基因Tm，可表達的熱穩定酮還原酶在有機合成中有著較大的應用潛力，該酶能夠特異性催化酮酯，并通過同源建模/理性設計等技術提高催化效率，改變產物的對映選擇性，并提高其ee值。所以本發明以2-氧代-4-苯基丁酸乙酯(EOPB)作為研究對象。原始的Tm酶不對稱還原EOPB生成2-羥基-4-苯基丁酸乙酯(HPBE)共兩種構型R-與S-，其中S-構型的對映選擇性只達到81%，而本發明通過定點突變可使其達到99%。
[0030]本發明的有益效果主要體現在:本發明提供了一種嗜熱酮還原酶突變體，突變特定位置的氨基酸生成的突變體同野生型酶相比，在熱穩定性和催化活性相當的前提下，提高了反應產物的旋光選擇性。
(四)【專利附圖】

【附圖說明】
[0031]圖1為不同溫度下野生型和雙突變體的酶活。
(五)【具體實施方式】
[0032]下面結合具體實施例對本發明進行進一步描述，但本發明的保護范圍并不僅限于此:
[0033]實施例1:第一輪突變
[0034](一)設計引物并構建突變文庫
[0035]將點W21，W86，P87，W118進行定點飽和突變，因此利用oligo7軟件設計平末端引物，共四條反向引物，和33條正向引物。然后進行PCR定點突變。本次PCR突變采用KOD-Plus-Neo DNA聚合酶試劑盒(購買來自東洋紡科技有限公司，上海。)
[0036]表1:定點突變的弓丨物設計
[0037]
【權利要求】
1.一種嗜熱酮還原酶突變體，由SEQ ID N0.2所示氨基酸序列經點突變得到，所述點突變為:第21位突變為亮氨酸，和/或第118位突變為組氨酸或谷氨酸。
2.如權利要求1所述的嗜熱酮還原酶突變體，其特征在于所述突變體氨基酸序列為下列之一:SEQ ID N0.3、SEQ ID N0.4、SEQ ID N0.5。
3.編碼權利要求1或2所述嗜熱酮還原酶突變體的基因。
4.含有權利要求3所述基因的重組載體。
5.含有權利要求3所述基因的重組基因工程菌。
6.權利要求3所述的基因在制備重組嗜熱酮還原酶中的應用。
7.權利要求1所述的嗜熱酮還原酶突變體在催化2-氧代-4-苯基丁酸乙酯不對稱加氫合成(S) -2-羥基-4-苯基丁酸乙酯中的應用。
8.如權利要求3所述的應用，其`特征在于所述不對稱加氫合成在10~80°C下進行。
【文檔編號】C12N15/53GK103614347SQ201310454764
【公開日】2014年3月5日 申請日期:2013年9月27日 優先權日:2013年9月27日
【發明者】陳振明, 張雙玲, 王志國, 周碩, 賴敦岳, 張颯 申請人:杭州師范大學