體外篩選體內抗菌活性噬菌體的方法
【專利摘要】本發明公開了一種體外篩選體內抗菌活性不受補體系統影響的噬菌體制劑的方法，通過測定噬菌體和細菌在有補體活性的血清中以及補體被滅活的血清中相互作用后存活下來的細菌數，并結合在不含噬菌體只含細菌的含有補體的血清中活菌數的變化結果，分析判斷出該噬菌體的抗菌活性是否受血清補體的影響。本發明所建立的體外篩選方法，對從環境中新分離到的大量的噬菌體可進行初步淘汰，篩選出體內具有抗菌活性可能性大的噬菌體再進一步實施動物治療的實驗研究，縮短了研究周期，加快了實驗進程，節省了研究經費，對新型噬菌體抗菌制劑的研發具有非常重要的意義。
【專利說明】體外篩選體內抗菌活性噬菌體的方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于生物制藥領域，具體而言，涉及一種體外篩選抗菌活性不受某生物體體內補體影響的噬菌體制劑的方法。
【背景技術】
[0002]人們對細菌感染性疾病的治療常采用的方法是使用各種抗生素。但隨著大量廣譜抗菌藥物的長期應用，尤其是濫用，細菌耐藥問題逐年加劇，一系列耐藥病原菌，如結核桿菌、金萄菌、大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌、鮑曼不動桿菌、腸球菌和銅綠假單胞菌等，引起公眾的廣泛關注。尤其是近10年來，肺炎克雷伯菌、鮑曼不動桿菌以及銅綠假單胞菌對所有常規使用的抗生素全耐藥菌株(Pan-resistant strains)的出現,讓人們意識到:抗生素治療革蘭氏陰性菌感染的時代已接近終點。更為嚴峻地是，目前處于臨床試驗階段的新抗菌藥物不足30種，而其中大多數仍是對傳統藥物的結構修飾物。另外，對15個全球最大的跨國制藥公司研發部門的調查表明:目前只有不到10種的抗生素制劑處于研發階段，未來可用于臨床的新抗生素的研發前景不容樂觀。研發新型抗生素的速度是遠遠落后于細菌對抗生素產生抗性的速度，“后抗生素時代”即將來臨，因此，尋找抗生素以外的新型抗菌制劑已勢在必行。在這樣的時代背景下，噬菌體治療重新受到人們的關注，自2000年以來，國外已發表了多篇關于噬菌體治療的綜述，多株臨床耐藥菌的噬菌體相繼被分離并得到深入研究。
[0003]噬菌體治療(phage therapy)就是運用噬菌體及其產物來預防和治療各種細菌感染性疾病的方法。卩遼菌體(bacteriophage/phage)是能夠感染細菌的病毒。據估計:在生態環境中，每48h就會有約一半數量的細菌要被噬菌體感染。噬菌體通過限制細菌的數量、種類、以及改變細菌的代謝能力和生活史等途徑對微生物的生物化學循環以及進化起著重要影響。噬菌體最早是由Twort和Herelle D兩人分別于1915年和1917年發現。當時，雖然對噬菌體生物學特性的認識還很淺，但就已經用它來治療疾病了。首次噬菌體治療的公開報道是在1921年，Richard B.和Joseph Μ.用噬菌體治療葡萄球菌引起的皮膚感染。在注射給藥后的48小時之內，感染消退。H.ff.Smith和M.B.Huggins用噬菌體制劑治療小鼠的大腸桿菌全身感染，小鼠在接種106CFU/ml的病原菌后致死率為100%，但當提前接種大腸桿菌噬菌體104PFU/ml后，無一例發生死亡。這種噬菌體制劑的療效比用四環素、鏈霉素、氯霉素、氨芐青霉素、三甲氧芐二氨嘧啶等抗生素的效果要好。這些滿意的療效激起了人們對噬菌體治療研究的 熱情，自1917年到1956年期間共發表800余篇有關噬菌體治療的報道，所治療的疾病有痢疾、傷寒、副傷寒、霍亂、化膿及尿道感染等，給藥方式分為皮內、皮下、靜脈、腹膜內、肌肉注射等，還有直接用于肺、頸動脈及心包的。當時許多研究機構和生物公司也對噬菌體的臨床應用產生了興趣，開始將噬菌體用于臨床治療。雖然當時許多噬菌體治療的嘗試都是成功的，但絕大部分實驗結果都刊登在烏克蘭和喬治亞的期刊中，并沒有傳到西方，即使有一小部分傳到西方科學界，也因實驗設計不夠周密、實驗數據不夠詳細以及缺乏相應的對照實驗而受到西方學者的摒棄。另外，從商業角度上說，對噬菌體治療的知識產權很難劃定，這些都是當時西方世界未對噬菌體治療進行深入研究的原因，加上后來抗生素的成功推廣，及其所表現出的快捷、高效、簡便的優勢，許多國家停止了對噬菌體治療的科學研究。直到20世紀末，快速加劇的細菌耐藥現象促使人們重新審視噬菌體作為抗菌制劑所具有的巨大潛力，越來越多的研究人員意識到利用噬菌體來預防和治療細菌感染的可行性和廣闊前景。
[0004]噬菌體制劑以其殺菌特異性強、自然資源豐富、易于工程改造等抗生素無法比擬的優點，必將成為未來治療全耐藥菌株(對所有常規使用的抗菌藥物全耐藥的細菌，即所謂的“超級細菌”)所造成感染的新型抗菌制劑。然而，噬菌體在防治疾病的過程中也存在很多需要克服的問題，此處不再詳述，僅將本發明所涉及的一項要解決問題敘述如下:
[0005]噬菌體無論數量還是種類都是自然界最為豐富的物種之一，從環境中分離到可以殺滅各種多重耐藥菌的噬菌體并非難事，但并不是所有新分離到的噬菌體在生物體內都能行駛其抗菌活性。因為生物體內存在很多可以影響噬菌體殺菌的因素，因此噬菌體抗菌活性在體內和體外會存在很大差異。傳統的篩選體內具有抗菌活性噬菌體的方法主要是通過動物實驗，對這些新分離到的噬菌體未經過一個初篩而直接進行動物實驗，勢必造成實驗動物的浪費、研究成本的提高和研究周期的增長。
[0006]雖然體內影響噬菌體抗菌活性的因素至今未完全明確，但本發明所建立的方法，僅針對其中一種影響因素，即補體系統對噬菌體抗菌活性的影響，可快速淘汰抗菌活性受補體系統影響的噬菌體，快速篩選出抗菌活性不受某一生物體內補體系統影響的噬菌體。這種方法增強了噬菌體研究對象的針對性，避免了一些不必要的研究成本的浪費。

【發明內容】

[0007]本發明的目的在于克服現有技術的缺陷，提供一種體外篩選抗菌活性不受某一生物體體內補體系統影響的噬菌體制劑的方法。為了實現本發明的目的，擬采用如下技術方案:
[0008]本發明一方面`涉及一種體外篩選體內抗菌活性曬菌體的方法，其特征在于包括如下步驟:
[0009]無菌采集實驗動物的外周血，將血清分成三份A、B、C，其中一份血清A經52_60°C，20-40min的補體滅活處理；
[0010]于三份血清中加入噬菌體的宿主菌，37C放置4-6分鐘，再分別于滅活血清A和未滅活血清B中加入待篩選的噬菌體，未滅活血清C中不加入任何噬菌體，三份血清于37°C反應 0.5-1.5h ；
[0011]計數測定三份血清中的宿主菌活菌數，如果A、B中宿主菌的生長速度一致，且生長速度小于宿主菌在C中的生長速度，則該待篩選的噬菌體可以作為動物實驗的候選噬菌體，反之則淘汰該待篩選的曬菌體。
[0012]在本發明的一個優選實施方式中，所述的細菌可以是從感染者痰液標本以外的臨床微生物檢驗送檢標本中(例如灌洗液、傷口、糞便、尿液等)分離得到的所有種類的細菌和與其相關的噬菌體。
[0013]在本發明的另一個優選實施方式中，所述的滅活或未滅活血清中加入的的細菌可以是一種以上細菌的混合物，加入的噬菌體也可以是一種以上噬菌體的混合物。[0014]本發明的原理如下:補體系統(complement system)是天然存在于人和脊椎動物正常新鮮血清中的一組非特異性球蛋白。在這些生物體內，補體的激活在特異性免疫和非特異性免疫過程中均起重要的作用。細菌和噬菌體進入機體內環境中均可遇到補體，其作用結果有三種情況:①補體激活后順利發揮溶菌效應，將細菌殺滅，感染結束。此類細菌一般不會引起實驗動物的敗血癥，因此無需實施噬菌體治療敗血癥的動物實驗研究。②某些細菌因對補體系統具有天然的抗性可在機體內環境中存活，此類細菌雖可通過一定的機制抵抗補體的溶解作用，但其與補體的作用是客觀存在的。當補體作用后改變的位點不影響細菌表面噬菌體吸附的受體結構或噬菌體尾部參與吸附細菌的關鍵結構，噬菌體即可行駛其在血清中的抗菌活性，此類噬菌體可考慮后續進行噬菌體治療的實驗動物研究。③當補體作用后改變的位點恰好位于細菌表面噬菌體吸附的受體結構或噬菌體的尾部參與吸附細菌的關鍵結構，均會影響噬菌體對細菌的抗菌活性，甚至使噬菌體的抗菌活性完全喪失。這些噬菌體在內環境中充滿補體的生物體內其抗菌活性也一定會受到影響，因此，后續進行的噬菌體治療感染的實驗動物研究中，此類噬菌體應考慮被淘汰。另外，補體的活性對熱非常敏感，560C，30min可完全滅活血清補體。因此，如果噬菌體在新鮮未滅活血清中無抗菌活性，而在滅活血清中有抗菌作用，便可證明此噬菌體抗菌活性的喪失與補體系統直接相關，否則為其他因素造成(如中和抗體等其他血清充分)。 [0015]本發明所建立的體外篩選方法，對從環境中新分離到的噬菌體可進行初步淘汰，從而選擇出在某生物體體內具有抗菌活性可能性大的噬菌體再進一步實施動物治療的實驗研究，因此，本發明所涉及的方法可縮短研究周期，加快實驗進程，節省研究經費。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0016]圖1:噬菌體ZZl和PF19分別對細菌AB09V和KP19的血清殺菌實驗結果【具體實施方式】
[0017]下面通過對兩株新分離噬菌體(ZZl和PF19)的篩選實例詳細敘述本發明的技術內容:
[0018]I實驗材料
[0019]1.1主要試劑
[0020]營養瓊脂粉、營養肉湯粉、瓊脂粉(購自杭州天和微生物試劑有限公司)，上層瓊脂培養基(含0.7%瓊脂，配制方法為營養肉湯22.0g、瓊脂粉7.0g于IL蒸餾水中，加熱煮沸至完全溶解，分裝，121°C高壓滅菌15min，4°C保存備用)，下層瓊脂培養基(含1.5%瓊脂，配制方法為營養瓊脂粉38.0g于IL蒸餾水中，加熱煮沸至完全溶解，121°C高壓滅菌15min，傾倒分裝于滅菌平皿內，4°C保存備用)，PEG-8000 (購自北京澤平科技有限責任公司)，噬菌體保存液 SM(Nac15.8g、MgS04.7H202g、lmol/L Ttris.HCL50ml、2% 明膠 5ml,加超純水至1000ml，分裝，121°C高壓滅菌20min，4°C保存)。
[0021]1.2菌株和噬菌體
[0022]本發明所用的兩株細菌(鮑曼不動桿菌AB09V和肺炎克雷伯菌KP19)是從河南省人民醫院微生物室住院病人痰液中分離到的致病菌，經法國生物梅里埃公司生產的細菌生化鑒定板條進行鑒定，用紙片法測定藥物敏感性。將過夜培養菌液分裝制成20%的甘油菌后置-70°C下長期保存。用接種環挑取-70°C凍存的菌種劃線接種于營養瓊脂平板表面，于37°C恒溫培養箱中培養過夜。挑取單菌落接種于盛有營養肉湯的錐形瓶中,放于搖床中37°C、160r/min震蕩培養過夜(約16h)。實驗其取Iml菌液5000g離心lmin，棄去上清，加入Iml生理鹽水吹吸混勻制成菌懸液后備用。ZZ1、PF19分別是用AB09V和KP19為指示菌從污水中分離的兩株噬菌體，參照傳統的方法進行單斑純化和平板裂解增殖后，得到濃度為IOkiPFUAiI噬菌體裂解液，經過0.2um濾孔的濾菌器進行過濾除菌后分裝于EP管內置4 °C保存備用。
[0023]1.3實驗動物
[0024]SPF級BALB/c小鼠，6~8周齡，雌雄不限，體重(19± I) g，購于鄭州大學實驗動物研究中心。實驗過程中對動物的處置符合動物倫理學標準。
[0025]2.實驗方法
[0026]2.1滅活血清和未滅活血清的制備
[0027]I只小鼠內眥取血可獲得新鮮血液約1ml。為保持原有血清補體的活性，要盡可能快的收獲血清。將采集的鼠血于37°C放置30min，4°C再放置10min，5000g離心5min，收獲血清。經過0.2um濾孔的濾菌器進行過濾除菌，取1/3的血清置于56°C的水浴滅活30min。
[0028]2.2血清中噬菌體的殺菌實驗
[0029]取等體積的三份血清:兩份未滅活血清`和一份熱滅活血清。于三份血清中先加入1/100血清體積的含有AB09V菌的生理鹽水混懸液(終濃度均達107CFU/ml)。37°C放置5分鐘，再分別于一份滅活血清和一份未滅活血清中加入1/100血清體積的噬菌體ZZl (終濃度均達108PFU/ml)，另一份未滅活血清作為無噬菌體對照反應管。三份反應物置于37°C水浴反應Ih后，同時進行5000gX5min的離心，棄去上清，加入等體積無菌生理鹽水充分吹吸混勻后再次進行5000gX5min的離心，再棄去上清，如此反復5次以充分去除游離噬菌體。最后一次洗滌后加入等體積營養肉湯混勻后，在營養肉湯中進行適當稀釋后通過平板傾注法計數活菌的菌落數。以相同的方法操作PF19在血清中對KP19菌的殺菌實驗。
[0030]2.3F19對其宿主菌所致小鼠敗血癥動物模型的治療實驗
[0031]將培養過夜的KF19菌液(109CFU/ml)進行離心洗滌(3000g，5min)，棄去上清后加入等體積無菌生理鹽水并吹吸混勻。40只小鼠均尾靜脈注射IOOul洗滌后的菌液(細菌總量為IO8CFU)。Ih后將這些感染的小鼠隨機分為4組，每組10只。第一組尾靜脈注射IOOul的F19噬菌體無菌濾液(IOwPFUAiI)，第二組注射經90°C，IOmin熱滅活的F19噬菌體無菌濾液(IOkiPFUAiI),第三組注射IOOul的無菌生理鹽水，第四組為無治療對照組。觀察四組小鼠的生存情況。
[0032]3結果和討論
[0033]噬菌體ZZl和PF19分別對細菌AB09V和KP19的血清殺菌實驗結果參見說明書附圖1。
[0034]鮑曼不動桿菌AB09V和肺炎克雷伯菌KP19在新鮮未滅活血清中的活菌數未有下降，說明二者均可在具有補體活性的新鮮血清中存活而不被殺滅，因此二者均對鼠血清補體有著天然的抗性。
[0035]噬菌體ZZl在新鮮未滅活血清中不能有效殺滅AB09V，Ih后的活菌數與無噬菌體對照組的活菌數基本無差異，但在補體滅活血清中對AB09V卻具明顯殺滅作用，活菌數只有1.5±0.4X 103CFU/ml，與初始活菌濃度(107CFU/ml)相比下降約4個數量級。此結果說明:血清補體幾乎可使噬菌體ZZl對AB09V的殺滅作用完全喪失，噬菌體ZZl在小鼠體內對鮑曼不動桿菌AB09V不可能具有抗菌活性，因此，沒有必要再進一步實施動物實驗來觀察治療效果。
[0036]噬菌體PF19在新鮮未滅活血清中以及滅活血清中均能有效殺滅KP19，Ih后的活菌數僅剩1.3±0.6X 102CFU/ml，與初始活菌濃度(107CFU/ml)相比下降約5個數量級。此結果說明:血清補體對PF19殺滅肺炎克雷伯菌KP19幾乎無影響，因此，我們對F19進一步實施了動物實驗。將致死量的KF19 (IO8CFU)注射入小鼠的尾靜脈，24h后未經治療的第四組小鼠、注射滅活F19的第二組小鼠以及僅注射無菌生理鹽水的第三組小鼠均全部死亡，而尾靜脈注射活性噬菌體F19的第一組小鼠除I只于注射細菌后的第三天死亡外，其余9只小鼠的存活期均超過30天(存活率達90% )。
[0037]體內存在很多可以影響噬菌體和細菌相互作用的因素，這些因素可使一些噬菌體在體內的抗菌活性減弱甚至完全喪失，而那些在體內具有抗菌活性的噬菌體必定不受這些因素的影響(如噬菌體F19)。但到目前為止，這些影響噬菌體抗菌活性的體內因素并未被明確。本發明所建立的方法，僅針對其中一種影響因素，即補體系統對噬菌體抗菌活性的影響，可快速淘汰抗菌活性受補體系統影響的噬菌體，快速篩選出抗菌活性不受某一生物體內補體系統影響的噬菌體。這種方法增強了噬菌體研究對象的針對性，避免了一些不必要的研究成本的浪費。
[0038]以上所述，僅為本發明的【具體實施方式】，但本發明的保護范圍并不局限于此，任何不經過創造性勞動想到的變化或替換，都應涵蓋在本發明的保護范圍之內。因此，本發明的保護范圍應該以權 利要求書所限定的保護范圍為準。
【權利要求】
1.一種體外篩選體內抗菌活性噬菌體的方法，其特征在于包括如下步驟: 無菌采集實驗動物的外周血，將血清分成三份A、B、C，其中一份血清A經52-60°C，20-40min的補體滅活處理； 于三份血清中加入噬菌體的宿主菌，37°C放置4-6分鐘，再分別于滅活血清A和未滅活血清B中加入待篩選的噬菌體，未滅活血清C中不加入任何噬菌體，三份血清于37°C反應0.5-1.5h ； 計數測定三份血清中的宿主菌活菌數，如果A、B中宿主菌的生長速度一致，且生長速度小于宿主菌在C中的生長速度，則該待篩選的噬菌體可以作為動物實驗的候選噬菌體，反之則淘汰該待篩選的曬菌體。
2.根據權利要求1所述的方法，所述的細菌可以是從感染者痰液標本以外的臨床微生物檢驗送檢標本中(例如灌洗液、傷口、糞便、尿液等)分離得到的所有種類的細菌和與其相關的嗤囷體。
3.根據權利要求1所述的方法，所述的滅活或未滅活血清中加入的的細菌可以是一種以上細菌的混合物，加入的噬菌 體也可以是一種以上噬菌體的混合物。
【文檔編號】C12R1/92GK103555673SQ201310498522
【公開日】2014年2月5日 申請日期:2013年10月23日 優先權日:2013年10月23日
【發明者】靳靜, 王山梅, 李振江, 王書偉, 陳松建, 張改, 王小亭, 王進 申請人:靳靜