一種發酵過程中添加過氧化氫生產γ-聚谷氨酸的方法
【專利摘要】本發明公開了一種發酵過程中添加過氧化氫生產γ-聚谷氨酸的方法，該方法采用在發酵48h時添加一定濃度的氧載體過氧化氫（0.5-5%，v/v）到發酵液中，提高溶氧濃度，進而提高γ-聚谷氨酸的產量，同時也控制了γ-聚谷氨酸中L-谷氨酸和D-谷氨酸的比例。該方法使得γ-聚谷氨酸的產量得到了很大的提高，而且也控制了其構型的比例，使所制得的不同構型γ-聚谷氨酸按照各自不同特點分別應用到化妝品、環境保護、食品、醫藥、農業、沙漠治理等領域。
【專利說明】一種發酵過程中添加過氧化氫生產Y-聚谷氨酸的方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種Y-聚谷氨酸的生產方法，特別涉及一種發酵過程中添加過氧化氫生產Y-聚谷氨酸的方法 。
【背景技術】
[0002]y -聚谷氨酸是由D-谷氨酸和L-谷氨酸通過α -氨基和、-羧基間的酰胺鍵結合而成的一種多功能生物可降解高分子材料。
[0003]分子量分布在IOOkDa到1000OkDa之間。Y -聚谷氨酸具有優良的水溶性、超強的吸附性和生物可降解性，降解產物為無公害的谷氨酸，是一種優良的環保型高分子材料，可作為保水劑、重金屬離子吸附劑、絮凝劑、緩釋劑以及藥物載體等，在化妝品、環境保護、食品、醫藥、農業、沙漠治理等產業均具有很高的商業價值和社會價值。
[0004]從聚谷氨酸的發現至今僅有幾十年的歷史，聚谷氨酸的研究主要還是處于實驗室階段，主要包括對其性質的研究，產生菌的改良和基因研究，發酵過程研究和提取純化過程研究，以及衍生物的生產和性質的研究。近幾年來，由于人們環境意識的增強和國家可持續發展戰略的要求，發展對環境友好的材料和開發改善環境問題的產品成為一種產業上的趨勢，它也推動了聚谷氨酸產業化研究和探索的進程。進入本世紀，個別國際知名公司開始進行聚谷氨酸的生產和應用的研究，國內部分大學和研究所也積極開展了相關的研究，國內更有數家企業開始計劃聚谷氨酸的大規模生產。由于這些產業化研究的跟進，使得聚谷氨酸成為現階段最受人關注的生物制品之一。
[0005]不同構型組成的Y-聚谷氨酸有不同的應用，例如，含有較高含量L-谷氨酸的Y-聚谷氨酸因其對皮膚的兼容性在化妝品行業應用廣泛，在一些其他的領域，含有較高D-谷氨酸的Y-聚谷氨酸因其降解較慢而被廣泛應用。這使得在Y-聚谷氨酸生產過程中控制其構型組成以滿足不同的應用需求變得很重要。
[0006]Y-聚谷氨酸的構型以及組成隨著菌株和培養條件的不同而不同。炭疽芽孢桿菌特異性可以生產出D-Glu構型的Y-聚谷氨酸；采用地衣芽孢桿菌生產Y-聚谷氨酸，其會隨著錳離子濃度的不同而得到D-Glu含量10~100%的不同Y -聚谷氨酸；采用枯草芽孢桿菌也可以生產不同類型的Y-聚谷氨酸。
[0007]利用添加氧載體過氧化氫來提高Y -聚谷氨酸的產量，同時控制其構型的比例尚未見報道。
【發明內容】
[0008]本發明的目的是提供一種Y -聚谷氨酸的生產方法，特別是提供一種發酵過程中添加過氧化氫生產Y-聚谷氨酸的方法。采用本發明所述生產方法生產Y-聚谷氨酸，不但Y-聚谷氨酸的產量有所提高，Y-聚谷氨酸聚合物中L型谷氨酸和D型谷氨酸的比例也能得到控制。
[0009]本發明的技術方案如下:[0010]本發明采用地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)生產Y -聚谷氨酸。菌種來源:發明所用菌種見天津北洋百川生物技術有限公司申請專利名稱為惰性載體固態發酵法生產Y-聚谷氨酸的方法專利，申請號=200910228297。該菌種為地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis),現已保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，菌種編號CGMCC3336。
[0011]—種發酵過程中添加過氧化氫生產Y -聚谷氨酸的方法，在發酵48h時,將一定體積百分濃度的過氧化氫(0.5%_5%)添加到發酵液中，提高了溶氧濃度，進而提高了 Y-聚谷氨酸的產量，并控制了 Y-聚谷氨酸的構型。
[0012]D-谷氨酸與L-谷氨酸濃度的測定:高效液相色譜(HPLC)
[0013]儀器:Agilentl200高效液相色譜儀(配紫外可見檢測器和工作站)。
[0014]色譜柱:大賽璐CR (+) / (CR-)手性柱；
[0015]流動相:pH2.0高氯酸水溶液；
[0016]流速:0.4mL/min ；
[0017]柱溫:25O;
[0018]檢測波長:UV200nm
[0019]樣品制備:發酵液經二次醇沉復溶后，與等體積6mol/L鹽酸在110°C進行水解，水解前樣品用流動相稀釋適當倍數，水解后樣品用流動相稀釋適當倍數，經0.22 μ m濾膜過濾，濾液供液相色譜分析。
[0020]有益效果:
[0021]利用本發明所述的Y-聚谷氨酸生產方法來生產Y-聚谷氨酸，其Y-聚谷氨酸的產量得到顯著提高，該方法可以同時控制Y-聚谷氨酸中L/D谷氨酸的比例，因此可以得到不同用途的Y-聚谷氨酸。
【具體實施方式】
[0022]下面通過具體的實施方案敘述本發明中Y-聚谷氨酸的生產方法。除非特別說明，本發明中所用的技術手段均為本領域技術人員所公知的方法。另外，實施方案應理解為說明性的，而非限制本發明的范圍，本發明的實質和范圍僅由權利要求書所限定。對于本領域技術人員而言，在不背離本發明實質和范圍的前提下，對這些實施方案中的物料成分和用量進行的各種改變或改動也屬于本發明的保護范圍。
[0023]對照實驗:
[0024]1.CGMCC3336菌種的活化:在富含營養的固體培養基斜面上于37°C培養16小時，制備得到成熟的斜面種子，固體培養基的成分包含:蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCllOg/L，瓊脂 20g/L, ρΗ7.2 ；
[0025]2.種子液的制備:
[0026]將一環上述種子轉入裝有液體種子培養基的三角瓶中，37°C，220rpm培養16小時至對數生長期；
[0027]種子液培養基組成(g/L):葡萄糖30 ;酵母膏7 ;胰蛋白胨10 ；Κ2ΗΡ040.5 ；MgSO4.6Η200.5，ρΗ7.2 ； 500ml的三角瓶中分裝50ml培養基；
[0028]3.發酵罐發酵:[0029]發酵罐培養基成分為(g/L):葡萄糖80，谷氨酸鈉80，硝酸銨18，NaCllO,MgSO4.6Η200.5，CaCl2.6Η201.0, FeSO4.6Η200.01，精氨酸 0.44，組氨酸 0.26，蘇氨酸 0.5，蛋氨酸0.4，膽堿0.1，谷氨酰胺0.5，吡哆醇0.001,ρΗ7.2 ；
[0030]發酵條件:5L發酵罐裝液量為3L,種子液的接種量為10%,發酵溫度37°C,發酵時間72小時，
[0031]通風量1.0vvm，轉速400rpm，初始pH為7.2 ;發酵結束后經檢測Y聚谷氨酸的產量為18g/L。Y-聚谷氨酸中L-谷氨酸與D-谷氨酸含量比例為1:1。
[0032]實施例1
[0033]發酵罐發酵采用氧載體添加策略，其余條件同對照實施例。發酵48h時添加過氧化氫 0.5% (v/v)0
[0034]結果:Y -聚谷氨酸產量由對照組的18g/L提高到25g/L。L/D構型比例為1:2。
[0035]實施例2
[0036]發酵罐發酵采用氧載體添加策略，其余條件同對照實施例。發酵48h時添加過氧化氫 1% (v/v)0
[0037]結果:Y -聚谷氨酸產量由對照組的18g/L提高到28g/L。L/D構型比例為4:5。
[0038]實施例3
[0039]發酵罐發酵采用氧載體添加策略，其余條件同對照實施例。發酵48h時添加過氧化氫 2% (v/v)0
[0040]結果:Y -聚谷氨酸產量由對照組的18g/L提高到30g/L。L/D構型比例為6:5。
[0041]實施例4
[0042]發酵罐發酵采用氧載體添加策略，其余條件同對照實施例。發酵48h時添加過氧化氫 5% (v/v)0
[0043]結果:Y -聚谷氨酸產量由對照組的18g/L提高到20g/L。L/D構型比例為1:3。
【權利要求】
1.一種發酵過程中添加過氧化氫生產Y-聚谷氨酸的方法，包括如下步驟: (1)地衣芽孢桿菌CGMCC3336菌種的活化: 在富含營養的固體培養基斜面上于37°C培養16小時，制備得到成熟的斜面種子，固體培養基的成分包含:蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaC110g/L，瓊脂20g/L，pH7.2 ； (2)種子液的制備: 將一環上述種子轉入裝有液體種子培養基的三角瓶中，37°C，220rpm培養16小時至對數生長期； 所述種子液培養基組成為:葡萄糖30g/L ;酵母膏7g/L ;胰蛋白胨10g/L ；K2HP040.5g/L ；MgS04.6Η200.5g/L，ρΗ7.2 ；500ml 的三角瓶中分裝 50ml 培養基； (3)發酵罐發酵: 發酵罐培養基成分為:葡萄糖80g/L，谷氨酸鈉80g/L，硝酸銨18g/L，NaC110g/L,MgSO4.6Η200.5g/L，CaCl2.6Η201.0g/L，FeSO4.6Η200.01g/L，精氨酸 0.44g/L，組氨酸 0.26g/L,蘇氨酸0.5g/L，蛋氨酸0.4g/L，膽堿0.lg/L，谷氨酰胺0.5g/L，吡哆醇0.001g/L, pH7.2 ； 發酵條件:5L發酵罐裝液量為3L,種子液的接種量為10%,發酵溫度37°C,發酵時間72小時，在發酵48h時，將體積百分濃度為0.5%-5%的過氧化氫添加到發酵液中，通風量1.0vvm，轉速 400rpm，初始 pH 為 7.2。
2.根據權利要求1所述的一種發酵過程中添加過氧化氫生產Y-聚谷氨酸的方法，其特征在于，在發酵罐發酵至48h時，添加過氧化氫，添加量為0.5%體積百分濃度。
3.根據權利要求1所述的一種發酵過程中添加過氧化氫生產Y-聚谷氨酸的方法，其特征在于，在發酵罐發酵至48h時，添加過氧化氫的體積百分濃度為1%。
4.根據權利要求1所述的一種發酵過程中添加過氧化氫生產Y-聚谷氨酸的方法，其特征在于，在發酵罐發酵至48h時，添加過氧化氫的體積百分濃度為2%。
5.根據權利要求1所述的一種發酵過程中添加過氧化氫生產Y-聚谷氨酸的方法，其特征在于，在發酵罐發酵至48h時，添加過氧化氫的體積百分濃度為5%。
【文檔編號】C12R1/10GK103525879SQ201310499326
【公開日】2014年1月22日 申請日期:2013年10月22日 優先權日:2013年10月22日
【發明者】喬長晟, 張帥, 高明昊, 李雪 申請人:天津北洋百川生物技術有限公司