專利名稱：發酵過程中添加NaCl生產γ-聚谷氨酸的方法
技術領域：
本發明屬于生物技術領域，涉及一種高效發酵生產Y-聚谷氨酸的方法。
背景技術：
Y -聚谷氨酸(poly- γ -glutamic acid,簡稱γ -PGA)是由L_谷氨酸或D-谷氨酸通過Y-酰胺鍵結合形成的一種水溶性的生物高分子聚合物。由于Y-聚谷氨酸具有吸水性、可降解性、水解性等眾多特性，因此被廣泛用于醫藥、食品加工、農業、綠化以及水處理等多種領域，具有極大的開發價值和應用前景。γ -聚谷氨酸最初由炭疽芽抱桿菌中發現，在高(X)2濃度的誘導下，炭疽芽抱桿菌可產生Y-D-聚谷氨酸，產生的Y-D-聚谷氨酸附著在細胞壁上并在微生物細胞外面形成莢膜，炭疽芽抱菌株的毒性限制了其在工業上的應用。由于枯草芽孢桿菌和地衣芽抱桿菌的易培育性和安全性，現在聚谷氨酸的生產大多報道由此類菌株產生。Y-聚谷氨酸一般以游離形式直接分泌到培養基中，可靜態發酵也可動態發酵，可稱為游離型Y-聚谷氨酸。 Y -聚谷氨酸可作為細胞外營養物存儲，可促進細胞膜的形成，在非常時期為微生物提供生存所需，可防止噬菌體的侵襲，并在高鹽環境下對金屬離子進行包裹從而對細胞具有保護作用。目前國內外主要采用微生物發酵法生產Y-聚谷氨酸。迄今所報道的Y-PGA產生菌主要有四種枯草(納豆)芽孢桿菌(BaciLLus subtiLis)、地衣芽孢桿菌(BaciLLus Licheniformis)、而 高溫芽 包桿菌(BaciLLus thermotoLerant)、炭Iil芽 包桿菌(BaciLLus. anthracis)，盡管許多研究者對微生物發酵法生產Y -聚谷氨酸進行了大量研究，但產率普遍還處于較低水平，生產成本高，這在很大程度上限制了 Y -聚谷氨酸的工業生產與應用。由于Y-PGA生物合成的機理至今尚不很清楚，而且菌株生成Y-PGA的代謝途徑復雜， 調節方式多樣，目前提高其生產效率的方法主要依靠選育優良菌種和優化發酵工藝。因此提高Y-聚谷氨酸的生產效率是大規模生產與應用亟待解決的重要課題。

發明內容
本發明的目的在于提供一種新的發酵工藝以提高Y-聚谷氨酸(Y-PGA)的產量， 即將納豆芽孢桿菌在液態發酵培養基中預培養一段時間后添加NaCl以提高發酵基質的滲透壓，再繼續培養至發酵終點以提高Y-PGA產量。一般認為γ -PGA是某些細菌的莢膜或黏液層的主要有機成分，而莢膜或黏液層的形成既是這些細菌的遺傳屬性，也與其所處環境條件密切相關。如對數期的細菌很少形成莢膜，進入穩定期后才開始大量形成，這是細菌對環境劣變(如營養成分減少、代謝廢物增加)的一種適應機制。有文獻報道(李大力等，化學與生物工程，24:50-51，2007)在配制培養基時添加NaCl培養枯草芽孢桿菌能提高Y -PGA的產量，并認為這是菌種對滲透壓提高的一種適應機制。但我們的研究發現這種添加NaCl的方式在培養納豆芽孢桿菌 (Bacillus subtilis natto) CICC20643時并不能提高γ-PGA的產量，甚至使產量和生物量CN 102533885 A
都降低。究其原因是較高的滲透壓對納豆芽孢桿菌的生長會造成一定程度的抑制，使生物量比未加入NaCl的狀態下要少一些。因此先讓納豆芽孢桿菌在不受抑制的狀態下培養，待其進入穩定期后加入NaCl再繼續培養，則既保證了足夠的生物量，又形成了合成Y -PGA的有利環境，其結果使Y-PGA產量提高。本發明提供的生產γ -聚谷氨酸的方法采取如下步驟(1)、將納豆芽孢桿菌斜面菌種接種于已滅菌冷卻的液態種子培養基中，在30 37°C搖瓶培養18 36h，即成納豆芽孢桿菌種子液；O)、將納豆芽孢桿菌種子液按 6%接種量接種于液態發酵培養基中，于 30 37°C搖瓶培養或通氣培養12 36h ；然后在培養基中添加重量體積百分比為3% 6%的NaCl，NaCl以固體顆粒或溶液狀態加入，添加NaCl后繼續搖瓶培養或通氣培養36 48h，終止發酵；(3)、對發酵液進行提取、純化，制得含Y-聚谷氨酸的產品。其中，液態種子培養基，以重量體積百分比計，單位為g/L，其組成為蛋白胨8 12g/L，牛肉膏 4 6g/L，NaC18 12g/L，pH6. 5 7. 5，其余為水。其中，液態發酵培養基，以重量體積百分比計，單位為g/L，其組成為蔗糖或葡萄糖 20 25g/L，酵母膏 5 10g/L，谷氨酸鈉 20 50g/L，Na2HPO4 lg/L，NaH2PO4 lg/L，MgSO4 0. 5g/L，ρΗ6· 0 7. 5，其余為水。本發明的優點在于在菌種生長穩定期加入NaCl不影響菌種生長，這樣既保證了足夠的生物量，又形成了合成Y-PGA的有利環境，結果使Y-PGA產量提高。本方法比接種前添加NaCl或不加NaCl能提高Y -聚谷氨酸的產量10% 40 %，且操作簡單、便于大規模生產，具有良好的應用前景。
具體實施例方式實施例1 搖瓶發酵(1)種子液的制備生產γ-PGA采用的納豆芽孢桿菌(Bacillus subtilis natto)來自中國工業微生物菌種保藏中心(CICC)，菌種編號CICC 20643。種子培養基組成為蛋白胨10g/L，牛肉膏5g/L，NaC110g/L, pH7. 0，其余為蒸餾水或自來水，裝液量50mL/250 mL三角瓶，在121 °C 滅菌30min，冷卻后，取一環預先保存于斜面培養基的納豆芽孢桿菌接種于種子培養基中， 在37°C、120 r/min搖瓶培養對h，即成納豆芽孢桿菌種子液。⑵搖瓶培養發酵培養基的成分25g/L，酵母膏5g/L，谷氨酸鈉40g/L，Na2HPO4 lg/L, NaH2PO4 lg/L, MgSO4 0. 5g/L，其余為蒸餾水；初始pH值為6. 5，裝液量70 mL/250mL三角瓶，搖床轉速為120r/min，在發酵24h后添加50g/LNaCl，NaCl以固體顆粒經滅菌后按無菌操作方式加入；繼續培養4 后終止發酵。C3) Y-PGA 的提取將發酵液于5000r/min下離心25min,上清液用lmol/L HCl調pH到3. 0，加入4 倍體積的95%乙醇，放于4°C下冰箱內過夜。然后于5000r/min下離心20min，用乙醇洗滌沉淀物，收集粘性沉淀物，干燥得Y-PGA產品。
實施例2 液態深層發酵(1)種子液的制備同實例1。(2)液態深層培養發酵培養基的成分葡萄糖20g/L、酵母粉10g/L、谷氨酸鈉20g/L、磷酸氫二鈉 lg/L、磷酸氫二鈉lg/L、硫酸鎂0. 5g/L，其余為自來水；初始pH值為7. 0，在5L微生物發酵罐中加入3L發酵培養基，滅菌冷卻后以5%接種量接入納豆芽孢桿菌種子液，37°C培養，通氣比0. 5 0. 8 (ν/ν)，攪拌轉速200r/min，培養24h后添加4%的NaCl，NaCl以濃溶液經滅菌后按無菌操作方式加入。繼續在37°C培養36h后結束，培養過程通氣比降低至 0. 3 0. 5 (ν/ν) ο(3) γ -PGA 的提取提取純化工藝同同實例1，Y -PGA的最高產量達到29. 76g/L。
權利要求
1.發酵過程中添加NaCl生產γ-聚谷氨酸的方法，其特征在于采取如下步驟(1)、將納豆芽孢桿菌斜面菌種接種于已滅菌冷卻的液態種子培養基中，在30 37°C 搖瓶培養18 36h，即成納豆芽孢桿菌種子液；(2)、將納豆芽孢桿菌種子液按1% 6%接種量接種于液態發酵培養基中，于30 37°C搖瓶培養或通氣培養12 36h ；然后在培養基中添加重量體積百分比為3% 6%的 NaCl, NaCl以固體顆粒或溶液狀態加入，添加NaCl后繼續搖瓶培養或通氣培養36 48h， 終止發酵；(3)、對發酵液進行提取、純化，制得含Y-聚谷氨酸的產品。
2.根據權利要求1所述的發酵過程中添加NaCl生產Y-聚谷氨酸的方法，其特征在于所述的液態種子培養基，以重量體積百分比計，單位為g/L，其組成為蛋白胨8 12g/L，牛肉膏4 6g/L, NaC18 12g/L, ρΗ6· 5 7. 5，其余為水。
3.根據權利要求1所述的發酵過程中添加NaCl生產Y-聚谷氨酸的方法，其特征在于所述的液態發酵培養基，以重量體積百分比計，單位為g/L，其組成為蔗糖或葡萄糖20 25g/L，酵母膏 5 10g/L，谷氨酸鈉 20 50g/L，Na2HPO4 lg/L，NaH2PO4 lg/L，MgSO4 0. 5g/ L，pH6. 0 7. 5，其余為水。
全文摘要
本發明提供了一種發酵過程中添加NaCl生產γ-聚谷氨酸的方法。本方法以納豆芽孢桿菌為γ-聚谷氨酸的生產菌，主要發酵工藝步驟包括將菌種在液態發酵培養基中預先好氧培養一段時間，然后添加NaCl以提高發酵基質的滲透壓，再繼續好氧培養至發酵終點等三個步驟。本方法比接種前添加NaCl或不加NaCl能明顯提高γ-聚谷氨酸的產量，且操作簡單、便于大規模生產，具有良好的應用前景。
文檔編號C12P13/02GK102533885SQ201210006209
公開日2012年7月4日 申請日期2012年1月9日 優先權日2012年1月9日
發明者朱丹, 鄒水洋 申請人:東莞理工學院