一種熒光rt-pcr檢測異育銀鯽tlr9基因相對表達量的方法
【專利摘要】本發明公開了一種熒光RT-PCR檢測異育銀鯽TLR9基因相對表達量的方法。通過異育銀鯽TLR9基因特異性上、下游引物：TLR9－qF:5’–TCCAGAGTCATTGGCTGGTGTT–3’;TLR9－qR:5’–CATAGAGATGCTTCAGGAGGGG–3’，獲得異育銀鯽TLR9基因的140bp產物。TLR9基因的表達豐度在一定程度上反映了異育銀鯽免疫系統的活度，可以作為異育銀鯽疾病防治中的免疫監測指標。通過檢測異育銀鯽TLR9基因表達量的變化，可以提早判斷異育銀鯽是否感染了病原，及時采取有效的預防治療措施，避免疾病的嚴重發展造成不可挽回的巨大損失。
【專利說明】—種熒光RT-PCR檢測異育銀鯽TLR9基因相對表達量的方法【技術領域】
[0001]本發明屬于生物【技術領域】，涉及用于檢測異育銀鯽TLR9基因表達的特異性引物， 更具體地說是涉及一種熒光RT-PCR檢測異育銀鯽TLR9基因相對表達量的方法。主要用于異育銀鯽TLR9基因表達調控機理研究和免疫學功能研究，以及異育銀鯽早期病原感染的監測。【背景技術】[0002]隨著世界水產養殖業的快速發展，水產養殖產量大幅增加，水產品的跨國貿易及水產苗種的跨區域交流也日益頻繁，極大增加了水產動物病原微生物的傳播幾率。此外，水產養殖的高密度集約化、漁業水環境的惡化以及各種抗菌抗生素類漁藥的濫用，也會引發水產養殖動物的應激反應，導致機體的免疫系統受到抑制。正是這些因素的相互影響，導致魚病頻發，給漁業發展造成了不可估量的損失。運用現代生物技術作為水產養殖的技術支撐，掌握疾病的免疫防御技術是漁業健康可持續發展所必須解決的問題。在對疾病防治途徑進行探索的過程中，人們逐漸認識到免疫防病技術的優越性，近年來國際上魚類免疫學的研究逐漸受到重視。[0003]1996年，Science雜志發表了題為“天然免疫對獲得性免疫應答的指導作用” 一文，首次明確地將天然免疫提高到如此重要的地位。1997年Current Opinion In Immunology刊文提出模式識別受體(pattern-recognizing receptors, PRRs)和病原相關的分子模式(pathog en-associated molecular patterns, PAMPs)的概念，論證 PRRs 的模式識別作用賦予免疫系統識別“自己” “非己”的能力，標志著天然免疫研究進入了一個嶄新的階段。魚類是獲得性免疫(特異性免疫)和天然免疫(非特異性免疫)并存的脊椎動物， 但與哺乳動物相比，魚類獲得性免疫機制還不完善，在抵御病原微生物時主要依賴天然免疫發揮作用。[0004]Toll樣受體(Tol 1-1 ike receptors,TLRs)家族是動物識別入侵病原體的主要“模式識別受體”(PRRs)，幾乎可以識別所有病原微生物的高度保守的結構基序“病原相關的分子模式”(PAMPs)，在啟動機體產生天然免疫應答上起著非常關鍵的作用。PAMPs包括各種細菌細胞壁成分，如脂多糖、多肽糖、胞壁酸等，以及病毒的RNA，酵母細胞壁上的甘露糖， 還有鞭毛蛋白、細菌DNA等。在人類中已經證明具有病毒識別功能的有TLR2、TLR3、TLR4、 TLR7、TLR8和TLR9。與在人類等高等哺乳動物研究相比，TLRs在魚類及其他低等脊椎動物中的研究還比較少，但通常認為TLR1、2、4、5和6主要參與細菌成分的識別，而TLR3、7和8 主要特異性地識別病毒性成分，TLR9對這二者均能夠識別。[0005]異育銀鯽(Carassius auratus gibelio)是利用三倍體的方正銀鯽為母本、二倍體的興國紅鯉為父本，通過人工雜交的方法誘使方正銀鯽的卵進行雌核發育而培育的鯽魚養殖新品種，由于其具有生長速度快、適應范圍廣、肉味鮮美等特點，已成為國內大力推廣養殖的優良品種之一。近年來，由于水環境的惡化、養殖規模的擴大、漁藥使用的不規范等因素，異育銀鯽病害發生率不斷攀升，尤其是2011年8月在我國異育銀鯽主要養殖區江蘇省出現重大疫情“鯽魚病毒性出血病，”短時間內疫病迅速蔓延，發病面積超過10萬畝，死亡率高達90-100%，造成經濟損失達數億元。本研究室國家大宗淡水魚類病毒學類崗位科學家曾令兵研究員帶領團隊成員第一時間迅速介入，通過病原分離、電鏡觀察、回歸感染以及PCR擴增等技術確定異育銀鯽病毒性出血病的病原為“鯉皰疹病毒II型”(Cyrinidherpesvirus-2, Cy HV_2)。由于異育銀鯽的病毒性出血病在國內是首次發現，缺乏相關的前期研究基礎，而且對于異育銀鯽的免疫機理和機制了解較少，所以目前對于該病毒病尚無有效的免疫防治技術和治療方法。
[0006]TLRs是宿主免疫的必需分子，通過感知入侵的病原微生物，識別病原相關分子模式，活化細胞內信號，來激活宿主的天然免疫系統產生免疫應答，進而抵御病原微生物的感染。TLR9作為TLRs家族的重要成員，參加魚類的免疫調節，在一定程度上反映了魚類的免疫能力，因此可以作為魚類疾病防治中免疫監測的指標。有關異育銀鯽TLR9基因的研究尚未見報道，本研究室利用RACE技術首次從異育銀鯽中克隆得到了 TLR9基因的全長cDNA序列，其Genbank序列號為KC816577。
[0007]實時突光定量PCR(real-time fluorescent quantitative PCR)是在常規 PCR 技術的基礎上發展起來的核酸定量技術。與常規PCR相比，實時熒光定量PCR技術具有特異性高、靈敏度高、可定量、有效解決PCR污染問題及自動化程度高等優點，保證了結果的可靠性和可重復性，已廣泛應用于分子生物學和醫學等研究領域。隨著實時熒光定量PCR檢測試劑盒的進一步研發，實時熒光定量PCR技術在水產動物疫病診斷中也得到了廣泛的應用。

【發明內容】

[0008]本發明的目的是提供了一種熒光RT-PCR檢測異育銀鯽TLR9基因相對表達量的方法。與常規PCR相比，該方法具有靈敏度高、特異性強、時間短、重復性好優點。
`[0009]為了實現上述目的，本發明采用的技術方案如下:
[0010]一種熒光RT-PCR檢測異育銀鯽TLR9基因相對表達量的方法，步驟如下:
[0011](I)針對異育銀鯽TLR9基因設計的引物序列如下:
[0012]TLR9-qF:5 ’ - TCCAGAGTCATTGGCTGGTGTT - 3’
[0013]TLR9-qR:5 ’ - CATAGAGATGCTTCAGGAGGGG - 3’
[0014]根據鯽魚β-actin基因cDNA序列(JX413519)，設計一對適用于實時熒光定量PCR檢測的內參基因特異性引物，引物序列如下:
[0015]β -actin-qF: 5 ’ - CACCACGGCCGAAAGAGAAATT - 3’
[0016]β -actin-qR: 5 ’ - AGGAAGGAAGGCTGGAAGAGAG - 3 ’ ；
[0017](2)總RNA的提取與純化:采用常規RNA提取和純化方法，從異育銀鯽脾臟中提取得到純化的總RNA ；
[0018](3) cDNA第一鏈的合成:以異育銀鯽脾臟總RNA為模板合成cDNA第一鏈；
[0019](4)實時熒光定量 PCR:采用 Bioteke 的 Power2XSYBR Real-time PCRPremixture試劑盒進行。以上述合成的cDNA第一鏈為模板，上述(I)中TLR9-qF、TLR9_qR和β -actin-qF、β -actin-qR為引物，進行實時熒光定量PCR擴增反應，每個樣品設3個平行管，PCR擴增結束后所得3個平行管的Ct值取平均數。
[0020]實時熒光定量PCR擴增體系如下:
[0021]Power2 X SYBR Real-time PCR Premixture 混合物 25 μ L、20 μ mol/L 正向引物和反向引物各I μ L> cDNA第一鏈模板2 μ L、無菌雙蒸水21 μ I,總反應體積為50 μ L。
[0022]實時突光定量PCR反應參數設置如下:
[0023]95 °C 2min ；
[0024]95°C 15s,60°C 15s,72°C 20s (共 40 個循環)。
[0025](5)異育銀鯽脾臟組織中TLR9基因相對表達量的計算:實時熒光定量PCR完成后，根據獲得的Ct值計算異育銀鯽被病毒感染后各時間段下的ACt和T (Λ Λ⑴值，計算方法如下:
[0026]Δ Ct=Ct (TLR9) -Ct ( β -actin)
[0027]Δ Δ Ct= Δ Ct (TLR9)-ACt (O 時健康異育銀鯽)
[0028]以2_ (Λ "Gt)數值表示異育銀鯽脾臟中TLR9基因相對于健康異育銀鯽TLR9基因的
表達量。
[0029]與現有技術相比，本發明具有以下優點:
[0030](I)本發明采用的實時`熒光定量PCR技術與常規PCR相比，實時熒光定量PCR技術自動收集熒光信號，避免了肉眼判斷的主觀性，可提高實驗的靈敏度；實時熒光定量PCR技術采用全封閉反應，無需PCR后處理，避免污染，保證了結果的可靠性和重復性；實時熒光定量PCR技術也免除了常規PCR中的電泳、定量掃描等后續繁瑣步驟，大大縮短了實驗時間。
[0031](2) TLR9基因的表達豐度在一定程度上反映了異育銀鯽免疫系統的活度，當TLR9基因相對表達量增高時，提示異育銀鯽可能已處于病原感染狀態，而此時憑肉眼還觀察不到異育銀鯽體表上有任何病原感染病癥。因此通過監測異育銀鯽脾臟組織中TLR9基因相對表達量的變化，可提早得知異育銀鯽是否被病原感染，及時采取有效的預防治療措施，避免勢態的嚴重發展造成不可挽回的損失。
[0032](3)TLRs是宿主免疫的必需分子，通過感知入侵的病原微生物，識別病原相關分子模式，活化細胞內信號，來激活宿主的天然免疫系統產生免疫應答，進而抵御病原微生物的感染。TLR9作為TLRs家族的成員，參加魚類的免疫調節，TLR9可識別病毒成分，病毒感染宿主后，TLR9的表達量顯著升高。因此可以通過TLR9基因對病毒進行監測，一旦發現表達量升高，立即采取預防措施，贏取時間并做進一步詳細診斷和治療。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0033]圖1為異育銀鯽TLR9基因和內參基因β-actin實時熒光定量PCR產物電泳結果;
[0034]從左至右的泳道依次為DL500DNA Marker,TLR9 基因(140bp)、β -actin (198bp)、DL500DNA Marker。
[0035]圖2為TLR9基因在健康異育銀鯽及腹腔注射CyHV_2病毒的異育銀鯽脾臟組織中的差異表達分析。【具體實施方式】[0036]下列實例進一步說明本發明，但不應該當做對本發明的限制。[0037]實施例1:[0038]異育銀鯽的人工感染實驗:[0039]收集病魚(鯉皰疹病毒II型感染)的肝、脾、腎等內臟組織于無菌培養皿中，用無菌眼科剪剪碎，加入10倍體積(V/W)的DPBS(Sigma公司產品)，轉入玻璃均化器內并在冰浴下研磨成組織勻漿液。將組織勻漿液轉移至50mL離心管中(BD公司產品)，在280°C冷凍后于室溫再融化，如此反復凍融3次，隨后在4°C，4000r/min離心30min (Sigma, 3K215)。取上清液經0.22 μ m濾器(Nalgene公司產品)過濾。獲得的組織勻漿濾液(病毒的copy數為l.eXlOYopies/yL)立即用于魚體人工感染試驗，剩余濾液可分裝于凍存管(Corning 公司產品)并在_80°C保存備用。[0040]人工感染試驗在水族箱中進行，水體體積為40L，連續充氣，水溫25°C。取近期未用過疫苗的健康異育銀鯽(體長10~15cm) 60尾，每尾經腹腔注射0.2mL上病毒懸液，作為病毒感染組；以DPBS注射作為對照組，繼續在水族箱中培養，分別于注射病毒后的6h、12h、 24h、48h、72h取其脾臟組織，迅速置于液氮中凍存保藏。[0041]實施例2:[0042]總RNA的提取和純化:[0043](I)取液氮凍存的脾臟組織50-100mg加入ImL Trizol后，用勻漿器徹底勻漿混勻，室溫放置5min，使其充分裂解。[0044](2)4°C, 12, 000r/min,離心IOmin,上清轉移至一新的無RNase的1.5mL離心管中，棄沉淀。[0045](3)每管加入200 μ L氯仿，振蕩混勻后室溫放置15min。[0046](4)4°C, 12, 000r/min,離心15min,吸取上層水相,轉移至一新的無RNase的1.5mL 離心管中。[0047](5)每管加入0.5mL異丙醇,輕輕混勻后,室溫放置5_10min。[0048](6) 4°C, 12，000r/min,離心 IOmin,棄上清,RNA 沉于管底。每管加入 ImL DEPC 水配制的75%乙醇，溫和振蕩離心管，懸浮沉淀。[0049](7) 4°C,8, 000r/min,離心5min,盡量棄上清,所得沉淀即為異育銀鯽脾臟組織的 RNA,室溫晾干5-10min后，加入DEPC水溶解，并于_80°C保存備用。[0050]實施例3:[0051]TLR9基因的實時熒光定量PCR檢測:[0052](I)引物: [0053]TLR9-qF:5 ’ - TCCAGAGTCATTGGCTGGTGTT - 3’[0054]TLR9-qR:5 ’ - CATAGAGATGCTTCAGGAGGGG - 3’[0055]異育銀鯽TLR9基因的PCR產物預計長度為140bp，瓊脂糖凝膠電泳結果顯示PCR 擴增后的產物長度與預計長度一致，且為單一條帶，說明所設計的引物具有很強的特異性， 適合用于實時熒光定量PCR檢測。瓊脂糖凝膠電泳結果如圖1所示。[0056]同時根據Genbank里查找到的鯽魚β-actin基因cDNA序列(JX413519)，設計一對適用于實時熒光定量PCR檢測的內參基因特異性引物，引物序列如下:[0057]β-actin-qF:5’ - CACCACGGCCGAAAGAGAAATT - 3，
[0058]β -actin-qR:5，- AGGAAGGAAGGCTGGAAGAGAG - 3，；
[0059]異育銀鯽β -actin基因的PCR產物預計長度為198bp，瓊脂糖凝膠電泳結果顯示PCR擴增后的產物長度與預計長度一致，且為單一條帶，說明所設計的引物具有很強的特異性，適合用于實時熒光定量PCR檢測。瓊脂糖凝膠電泳結果如圖1所示。
[0060](2) cDNA第一鏈的合成:
[0061]以實施例2所得到的異育銀鯽脾臟總RNA作為模板，用ImProm-1I TM反轉錄試劑盒(Promega)中的01 igo(dT)作為引物,按照試劑盒說明書進行反轉錄,合成cDNA第一鏈，反應體系的總體積為20 μ L。
[0062](3)實時熒光定量PCR:
[0063]實時突光定量PCR 米用 Bioteke 的 Power2X SYBR Real-time PCR Premixture試劑盒進行。以上述(2)中合成的cDNA第一鏈為模板，上述(I)中TLR9_qF、TLR9_qR和β -actin-qF、β -actin-qR為引物，進行實時熒光定量PCR擴增反應，每個樣品設3個平行管，PCR擴增結束后所得3個平行管的Ct值取其平均數。
[0064]實時熒光定量PCR擴增體系如下:
[0065]Power2X SYBR Real-time PCR Premixture 混合物 25 μ L、10 μ mol/L 正向引物和反向引物各I μ L> cDNA第一鏈模板2 μ L、無菌雙蒸水21 μ I,總反應體積為50 μ L。
[0066]實時突光定量PCR反應參數設置如下:
[0067]95 °C 2min ；`
[0068]95°C 15s,60°C 15s,72°C 20s (共 40 個循環)。
[0069](4)病毒感染的異育銀鯽脾臟中TLR9基因相對表達量的計算:
[0070]實時熒光定量PCR完成后，根據所獲得的Ct值計算異育銀鯽被病毒感染后各時間段下的Λ Ct和2_(ΛΛΜ)值，計算方法如下:
[0071]Δ Ct=Ct (TLR9) -Ct ( β -actin)
[0072]Δ Δ Ct= Δ Ct (TLR9)-ACt (O 時健康異育銀鯽)
[0073]以2_(Δ "Gt)數值表示病毒感染異育銀鯽脾臟中TLR9基因相對于健康異育銀鯽TLR9基因的表達量。
[0074]2_(Λ 數值代表了病毒感染異育銀鯽脾臟中TLR9基因相對于健康異育銀鯽TLR9基因的表達倍數。β-actin即β_肌動蛋白，是細胞的一種重要骨架蛋白，在所有類型的細胞中都進行表達，且其表達水平僅受啟動子與RNA聚合酶相互作用的影響，受環境影響因素很小，表達水平較為恒定，因此β-actin被作為公認的內參基因，常用做測定目標基因表達量時的內參照。本實驗中2_(ΔΔΜ)數值越大，表明TLR9基因的表達量越高。
[0075]圖2為病毒感染后的不同時間段異育銀鯽脾臟組織中TLR9基因的相對表達量。從圖中可以看出，病毒感染后的12h，TLR9基因的表達量就開始升高，表達量是健康異育銀鯽(Oh)的10.1倍；感染后的24h，TLR9表達量是健康異育銀鯽的51.3倍；72h時TLR9表達量達到最高，是健康異育銀鯽的75.7倍。以上結果表明，當TLR9基因相對表達量增高時，即表明異育銀鯽已經處于病原感染狀態，異育銀鯽體內固有的免疫系統已經啟動，盡管此時從肉眼上觀察不到異育銀鯽體表上有任何感染的病癥。
[0076]表1為在不同時間段測得的TLR9基因的Ct值
【權利要求】
1.一種熒光RT-PCR檢測異育銀鯽TLR9基因相對表達量的特異性引物，其特征在于它是由符合熒光定量PCR反應特點的異育銀鯽TLR9基因特異性上、下游引物:TLR9 — qF: 5’ -TCCAGAGTCATTGGCTGGTGTT - 3’；TLR9 —qR: 5’ - CATAGAGATGCTTCAGGAGGGG - 3’ ； 以及作為內參基因的異育銀鯽β -actin基因特異性上、下游引物:β — actin — qF:5’ -CACCACGGCCGAAAGAGAA`ATT - 3，； β — actin — qR:5，- AGGAAGGAAGGCTGGAAGAGAG - 3， 組成。
【文檔編號】C12Q1/68GK103498003SQ201310502471
【公開日】2014年1月8日 申請日期:2013年10月23日 優先權日:2013年10月23日
【發明者】范玉頂, 曾令兵, 周勇, 董圣, 徐進, 張輝 申請人:中國水產科學研究院長江水產研究所