一種cd81和ocln雙轉基因小鼠及其構建方法和用途
【專利摘要】本發明提供了一種CD81和OCLN雙轉基因小鼠及其構建方法和用途，該雙轉基因小鼠可以用于建立急性和慢性HCV感染小鼠模型。
【專利說明】—種CD81和OCLN雙轉基因小鼠及其構建方法和用途
【技術領域】
[0001]本發明涉及轉基因【技術領域】，具體的說涉及一種CD81和OCLN雙轉基因小鼠及其構建方法和用途。
【背景技術】
[0002]丙型肝炎在全世界廣泛流行，目前約有1.3-1.7億丙型肝炎患者。近80%HCV感染人群形成慢性感染，其中一部分慢性丙肝將進展為肝纖維化、肝硬化和肝癌。HCV有不同的亞型，不同人種間流行亞型不同，不同亞型對現有臨床治療的響應性不一樣。目前尚沒有HCV疫苗。因此，如何有效預防和治療丙型肝炎仍是亟待解決的重大衛生與健康問題。
[0003]HCV感染和致病機制的基礎研究，藥物和疫苗開發均依賴于合適的動物模型。除了人類之外，黑猩猩也對HCV易感。但黑猩猩數量少，繁殖慢，使用費用高，靈長類動物福利和倫理問題復雜，且不能反映慢丙性病型肝炎的病理，黑猩猩被用于研究的范圍有限，人們從黑猩猩感染模型獲得丙型肝炎相關理論和技術的突破受到極大限制。國內外學者針對開發丙型肝炎的小動物模型的研究也取得了一定的進展，包括:
[0004](I)全長轉基因小鼠:有HCV小鼠模型通常是將HCV全長基因組或者特定蛋白的片段通過轉基因的方法整合到小鼠基因組中，構建持續性表達HCV蛋白的轉基因小鼠(Moriya et al.，1998)。HCV基因通過轉基因技術在小鼠體細胞中超量表達，會對宿主細胞造成表達壓力。這類小鼠模型只表達HCV基因片段，缺乏HCV病毒顆粒侵入細胞和在細胞中復制的過程，因此其應用非常有限。
[0005](2)樹駒模型:樹駒能被丙型肝炎病毒侵染(Tong et al.，2011;Xu etal.，2007)。但屬于一過性感染，無法建立穩定可重復的感染；樹駒動物本身為野生動物，不易飼養和繁殖，遺傳品系不穩定，無法長期、穩定研究和利用。
[0006](3)嵌合體小鼠模型:在免疫缺陷小鼠中移植人肝細胞或在腎包膜下包埋人源肝組織的小鼠，雖能夠支持丙型肝炎病毒的有限感染和復制，但病毒感染效率低，人肝組織或細胞免疫排斥反應大，缺乏針對丙型肝炎病毒的免疫病理反應。例如，在嚴重免疫缺陷型(severe combined immunodeficiency, SCID)小鼠中，白蛋白啟動子(肝臟特異表達)控制尿激酶型纖溶酶原激活基因(urokinase-type plasminogen-activator gene, uPA)的表達，肝臟特異表達的uPA將造成持續性的小鼠肝損傷，將人的肝細胞移植到小鼠中，即可建立人肝細胞嵌合的小鼠模型(Kaul et al., 2007) 0
[0007](4)自身免疫系統嚴重缺陷并移植了人肝細胞和人免疫系統的小鼠，丙型肝炎病毒能有限感染及伴隨部分肝炎病理，但技術復雜，嚴重免疫缺陷小鼠不易獲得，整個人源化操作不穩定，又牽涉到倫理問題。例如，在免疫缺陷型的Balb/CRagZ+IUrg+小鼠中，白蛋白啟動子控制FK506結合蛋白與caspase8融合蛋白特異性在小鼠肝細胞中表達,造成可誘導性肝細胞損傷，誘導后可接受人源肝細胞移植(Washburn et al., 2011) ?
[0008](5)研究表明，丙型肝炎病毒感染的種屬特異性取決于其侵染特異性受體。在細胞水平已證明，轉入人源丙型肝炎病毒的細胞受體⑶81(Clusters of Differentiation 81:分化抗原81)和OCLN (Occludin:閉合蛋白)的小鼠細胞能支持病毒感染和復制。利用腺病毒載體攜帶CD81和OCLN在鼠肝細胞瞬間表達后，可檢測到丙型肝炎病毒在小鼠肝細胞中的復制，但不能建立感染和引起肝炎病理變化。例如，將四個HCV受體基因通過腺病毒載體表達于小鼠體內，能使HCV能夠進入小鼠細胞并復制。但HCV在這個模型中無法完成復制生活周期，也無法觀察丙型肝炎的病理進程(Dorner et al., 2011) 0

【發明內容】

[0009]本發明首先提供了一種⑶81和OCLN雙轉基因小鼠，該轉基因小鼠是通過如下方法建立的:
[0010](I)將人⑶81、OCLN基因克隆，分別插入pLIVE載體，獲得含有⑶81基因的表達載體pLIVE-CD81和含有OCLN基因的表達載體pLIVE-OCLN ；
[0011](2)CD81和OCLN雙轉基因小鼠的構建；
[0012]將載體pLIVE-CD81和pLIVE-OCLN分別進行酶切，分別得到含有CD81和OCLN基因的線性DNA片段；
[0013]將線性DNA片段注射入ICR小鼠受精卵；
[0014]受精卵隨后移植入ICR雌鼠子宮；
[0015]小鼠出生后經基因組PCR方法鑒定，分別獲得⑶81和OCLN的建系小鼠；
[0016]建系小鼠經回交獲得同時含有⑶81和OCLN的轉基因子代小鼠。
[0017]本發明還提供了構建上述⑶81和OCLN雙轉基因小鼠的方法:
[0018](I)將人⑶81、OCLN基因克隆，分別插入pLIVE載體，獲得含有⑶81基因的表達載體pLIVE-CD81和含有OCLN基因的表達載體pLIVE-OCLN ；
[0019](2) CD81和OCLN雙轉基因小鼠的構建；
[0020]將載體pLIVE-CD81和pLIVE-OCLN分別進行酶切，分別得到含有CD81和OCLN基因的線性DNA片段；
[0021]將線性DNA片段注射入ICR小鼠受精卵；
[0022]受精卵隨后移植入ICR雌鼠子宮；
[0023]小鼠出生后經基因組PCR方法鑒定，分別獲得⑶81和OCLN的建系小鼠；
[0024]建系小鼠經回交獲得同時含有⑶81和OCLN的轉基因子代小鼠。
[0025]具體的說，本發明的CD81和OCLN雙轉基因小鼠構建方法的具體步驟為:
[0026](I)人CD81、0CLN基因的克隆
[0027]從人cDNA文庫中通過RNA聚合酶鏈式反應(PCR)擴增出人CD81和OCLN編碼DNA(cDNA) (DNA 序列分別為 SEQ ID:1 和 SEQ ID:2)；
[0028]⑶81cDNA插入pLIVE載體核酸內切酶BamH I和Xho I酶切位點，獲得含有⑶81基因的表達載體pLIVE-⑶81 ；
[0029]OCLN cDNA插入pLIVE載體核酸內切酶Sal I和Xho I酶切位點，獲得含有OCLN基因的表達載體pLIVE-OCLN ；
[0030]其中pLIVE載體含小鼠甲胎蛋白增強子和小鼠白蛋白啟動子，可用于轉基因在小鼠肝臟的高效、特異性、穩定、長效表達；
[0031](2) CD81和OCLN雙轉基因小鼠構建[0032]pLIVE-CD81 載體 DNA 經 Bgl II 和 Nde I 內切酶消化，pLIVE-OCLN 載體 DNA 經 XbaI和Nde I內切酶消化，分別得到含該基因的線性化DNA片段(基因序列分別為SEQ ID:3和SEQ ID:4)；
[0033]將DNA片段分別稀釋至Ing/mL，經顯微注射入ICR小鼠受精卵；
[0034]受精卵隨后移植入ICR雌鼠子宮；
[0035]小鼠出生后經基因組PCR方法鑒定，分別獲得⑶81和OCLN的建系小鼠(⑶8 lTg/_和0CLNTg/O ；
[0036]建系小鼠經回交獲得同時含有CD81和OCLN轉基因子代小鼠(CD81Tg/0CLNTg，簡稱C/0Tg)。
[0037]通過轉基因技術將⑶81和OCLN分別整合到小鼠染色體上，然后通過遺傳學手段選育出含⑶81和OCLN轉基因的小鼠，小鼠基因組穩定整合并同時表達編碼HCV受體的人CD81和OCLN兩個基因，但不影響其等位的宿主基因，故對宿主盡可能小的造成影響，可以用來支持HCV進入小鼠肝細胞。
[0038]本發明還提供了上述⑶81和OCLN雙轉基因小鼠的用途，其可用于建立急性和慢性HCV感染小鼠模型，CD81和OCLN的雙轉基因小鼠中HCV復制對抗病毒藥物(包括核苷酸類似物和蛋白酶抑制劑)敏感，可在HCV自然感染小鼠中驗證針對HCV的抗病毒藥物的藥效、免疫調節劑的抗病毒評價、臨床治療方案研究和優化、和疫苗研發。
[0039]而且可以在具有完整免疫系統的小鼠中重現HCV病毒感染自然史和病理進程，使HCV在小鼠中持續復制，肝臟和外周血中HCV病毒載量穩定；從而可建立急性和慢性感染及其肝臟病理模型。
[0040]本發明首次構建了丙型肝炎病毒受體CD81和OCLN的雙轉基因小鼠，構建方法穩定，能穩定批量的制備；
[0041]本發明首次在⑶81和OCLN的雙轉基因小鼠中建立能夠完整反映HCV自然感染史和丙型肝炎病理進程的持續感染模型；
[0042]還可以利用OCLN和CD81基因的雙轉基因小鼠發展各種針對HCV的診斷、檢測技術、方法和產品；
[0043]本發明還提供了利用OCLN和⑶81基因的雙轉基因小鼠經血感染HCV病毒產生的生物活性物質，包括但不限于抗體、廣譜和或中和抗體、抗原遞呈細胞、HCV反應性T細胞等;
[0044]利用OCLN和⑶81基因的雙轉基因小鼠經血感染HCV病毒可能產生的各種HCV突變體突變信息可用于藥物設計、疫苗開發。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0045]圖1-A包含人源⑶81和OCLN的轉基因質粒構建圖譜
[0046]圖1-B鼠尾提取DNA，PCR鑒定小鼠的基因型
[0047]圖1-C檢測轉基因小鼠肝臟人CD81和OCLN的表達，肝癌細胞系Huh7，Huh7.5.1作為對照`
[0048]圖1-D通過qRT-PCR檢測轉基因小鼠中人源CD81和OCLN在不同組織中的表達
[0049]圖1-E檢測人源⑶81和OCLN在轉基因小鼠肝細胞的定位。[0050]圖2-A實驗小鼠尾靜脈注射HCV病毒(TCID5tl=I X IO8)。雙轉基因小鼠(C/0Tg，n=4)，對照小鼠wt (n=3)在各個時間點處死，分析血清病毒載量。
[0051 ] 圖2-B實驗小鼠尾靜脈注射HCV病毒(TCID5tl=I X IO8)。雙轉基因小鼠(C/0Tg，n=4)，對照小鼠wt (n=3)在各個時間點處死，分析肝臟病毒載量。
[0052]圖2-C實驗小鼠尾靜脈注射HCV病毒(TCID5tl=I X IO8)。雙轉基因小鼠(C/0Tg，n=4)，對照小鼠wt (n=3)在各個時間點處死，分析血清谷丙轉氨酶(ALT)水平。
[0053]圖2-D實驗小鼠尾靜脈注射HCV病毒(TCID5tl=I X IO8)。雙轉基因小鼠(C/0Tg，n=4)，對照小鼠wt(n=3)在各個時間點處死,分析血清前白蛋白(PA)水平。
[0054]圖2-E慢性感染導致脂肪變性出只在感染后I個月，5只在感染后2個月)，纖維化(4只在感染后6個月，4只在感染后10個月)，肝硬化(4只在感染后13個月)時的血清和肝臟病毒載量，肝損傷(ALT水平)，抗HCV抗體的指標。每組左側的點表示病理階段小鼠經由超聲，CT和病理評判為陽性的小鼠數據。右側的點表示為病理階段陰性的小鼠。
[0055]圖3-A通過H&E染色分析肝臟(每只小鼠3張切片)，虛線標出中央靜脈淋巴細胞浸潤(e-f)淋巴細胞在肝小葉聚集(g_h)柱狀圖顯示了每張切片的淋巴細胞聚集數量。
[0056]圖3-B H&E染色表現出微小的水泡樣脂肪變性(箭頭所示)。淀粉樣沉積物或組織壞死(虛線標出)
[0057]圖3-C masson染色顯示纖維化進展。纖維化程度由彌散度評價(纖維化區域/纖維化區域數量)
[0058]圖3-D血清中轉化生長因子(TGF-β I)在HCV感染后的表達。
`[0059]圖4-A C/0Tg小鼠注射病毒I周后，以(200毫克/千克)進行利特拉匹偉藥物注射，對照小鼠注射DMSO。qRT-PCR分析治療后小鼠血清和肝臟的病毒拷貝數。
[0060]圖4-B C/0Tg小鼠注射病毒I周后，以(20毫克/千克)進行利巴韋林藥物注射，對照小鼠注射生理鹽水。qRT-PCR分析治療后小鼠血清和肝臟的病毒拷貝數。
[0061]圖5pLIVE 載體
【具體實施方式】
[0062]ICR小鼠:⑶-1 ?小鼠，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司
[0063]pLIVE載體:購于美國Mirus公司。
[0064]實施例1⑶81和OCLN雙轉基因小鼠的構建
[0065]從人cDNA文庫中通過DNA聚合酶鏈式反應(PCR)擴增出人CD81和OCLN編碼DNA (cDNA,序列分別為SEQ ID:1和SEQ ID:2)，擴增條件為:95度10分鐘；95度30秒，58度30秒，72度2分鐘，33個循環；72度10分鐘。(Pfuultra II酶購于Agliant公司)。⑶81cDNA插入pLIVE載體核酸內切酶BamH I和Xho I酶切位點，獲得含有⑶81基因的表達載體pLIVE-CD81 ；0CLN cDNA插入pLIVE載體核酸內切酶Sal I和Xho I酶切位點，獲得含有OCLN基因的表達載體pLIVE-OCLN (核酸內切酶購于NEB公司、pLIVE載體購于Mirus公司)。pLIVE-CD81載體DNA經Bgl II和Nde I內切酶消化，pLIVE-OCLN載體DNA經XbaI和Nde I內切酶消化，分別得到含該基因的線性DNA片段(圖1_A，片段序列分別為SEQID:3和SEQ ID:4)。將兩個線性DNA片段分別稀釋至Ing/mL，經顯微注射入ICR小鼠受精卵。受精卵隨后移植入ICR雌鼠子宮；小鼠出生后經基因組PCR方法鑒定(圖1-B)，分別獲得CD81和OCLN的建系小鼠(CD81Tg/_和0CLNTg/_);建系小鼠經交配CD81Tg/_和0CLNTg/_單轉基因小鼠最終獲得同時含有⑶81和OCLN轉基因子代小鼠(⑶81Tg/0CLNTg，簡稱C/0Tg)。
[0066]實施例2HCV持續感染模型的建立 [0067]丙型肝炎病毒(Huh7.5.1細胞(巴斯德研究所)，通過電轉P-J399EM (實驗室構建)(Han et al.，2009)體外轉錄得到的全長HCV的RNA，培養96h后收集上清，上清超濾純化)通過尾靜脈注射(TCID5ci=IXIO8),注射時間控制在I~2分鐘。分別感染C/0Tg|轉基因小鼠和野生型ICR鼠，分別在感染后O小時-12月，不同時間點采集血清或者肝臟組織。以實時定量逆轉錄-聚合酶鏈式反應(qRT-PCR)方法檢測血清(genomes/mL)和肝細胞(genomes/g)中HCV RNA含量。條件為:50度30分鐘；95度10分鐘；95度30秒，58度30秒，72度30秒(采集信號)，50個循環，引物序列為=Sence(正向引物):ATCACTCCCCTGTGAGGAACT ；Ant1-sence (反向引物):GCGGGTTGATCCAAGAAAGG。注射病毒后wt的血清病毒載量為(genomes/mL):53746900±747977 (12 小時)，25791242±8626787(2 天)，7026±2797(4 天)，433±73(1周)，1周后wt小鼠的外周血檢測不到病毒拷貝。注射病毒后C/0Tg雙轉基因小鼠外周血病毒載量(genomes/mL)(圖 2_A):35986785±3016340 (12 小時)，1607875± 1304933(2 天)，228942± 174178 (4 天)，64505±6821 (I 周)，67622±4612 (2 周)，33671 ± 13347(3 周)，6921±4272 (I 個月)，6739±4783 (2 個月)，403±95 (3 個月)，534± 125 (4 個月)，1375±198 (6 個月)，4781±2969 (10 個月)，2067±277 (12 個月)。結果顯示 HCV能夠在C/0Tg雙轉基因小鼠的外周血形成持續的病毒血響應。注射病毒后wt小鼠的肝臟檢測不到病毒拷貝，而C/0Tg雙轉基因小鼠的肝臟病毒拷貝數為(genomes/g)(圖2-B):149676500±26422459.09 (12 小時)，68863260±26554660 (2 天)，30167166± 14023164(4 天)，48183923±49326087 (I 周)，5221675±782099 (2 周)，4723475±570250 (3 周)，5649760 ±3372903 (I 個月)，3597135±2671267 (2 個月)，1831199±34834 (3 個月)，3055570±565440 (4 個月)，10729851 ±3954535 (6 個月)，14392085± 1902774 (10 個月)，15543000± 124774 (12個月)，結果顯示HCV能夠在C/0Tg雙轉基因小鼠的肝臟形成持續的復制。同時，對肝組織進行病理分析(H&E、Masson’ s染色)，超聲、CT等無創傷影像學分析，以評估HCV感染導致的肝炎、肝損傷(肝纖維化、肝硬化)等典型丙型肝炎病理。HCV感染的雙轉基因小鼠表現為輕微的肝炎癥狀(大部分ALT < 40)。wt小鼠組ALT (U/L)水平為:17.8±11.08(未感染)，10.5±0.51 (12 小時)，7.0± 1.42 (2 天)，29.5±9.19 (4天)，6.6±3.54 (I 周)，28.2±8.84 (2 周)，17.7± 13.33 (I 個月)，27.9± 1.69 (2 個月)，26.5±0.70 (3 個月)，37.4±12.90 (4 個月)，27.3±6.01 (10 個月)，16.5±6.29 (12 個月)。C/0Tg|轉基因小鼠的ALT(U/L)水平為:17.8± 11.01(未感染)，7.8±6.72(12小時)，28.0±1.25(2 天)，57.3±3.88(4天)，16.3±7.72(1 周)，61.0±5.65(2 周)，21.2±11.16(I 個月)，19.6±0.68 (2 個月)，27.4±10.25 (3 個月)，36.3±4.06 (4 個月)，35.7±5.44(6個月)，19.5±3.79 (10個月)，232.3±26.89 (12個月)。結果顯示注射病毒后的wt小鼠幾乎沒有肝炎癥狀(ALT <40)，而C/0Tg雙轉基因小鼠在感染病毒的大部分時間也幾乎沒有肝炎癥狀，只在感染晚期有肝炎癥狀(ALT >40)(圖2-C)。注射病毒后wt組的前白蛋白幾乎都維持在正常水平(20~30mg/L)而C/0Tg雙轉基因小鼠在感染后4天就幾乎檢測不到，提示病毒感染造成了一定的肝損傷(圖2-D)。通過H&E染色發現，感染HCV的雙轉基因小鼠肝臟出現淋巴細胞聚集，在感染后I周到5個月在每張切片都能發現5~20個數目不等的淋巴細胞聚集(圖3-A)，感染后I~2個月脂肪變性(水泡樣結構)以及感染后3~6個月血管周邊淀粉樣沉積和感染后10個月細胞壞死(圖3-B)。Masson染色顯示(圖3-C)在感染后6個月出現明顯的膠原纖維聚集(藍色)提示肝臟纖維化出現。而彌散度(纖維化區域/纖維化區域數量)顯示感染后3個月為60，而感染后6個月以及10個月為180，顯示纖維化程度的加深。分析顯示感染后轉化生長因子(TGF-0 I)表達的升高也證實了纖維化的加深(圖3-D)。而通過比較脂肪變性，纖維化以及肝硬化的小鼠以及相同時間病理陰性的小鼠發現只在脂肪變性階段肝臟病毒拷貝數和血清HCV抗體水平病理陽性組和病理陰性組存在顯著性差異其余都沒有顯著性差異(圖2-E)。以上結論顯示雙轉基因小鼠能夠支持HCV復制并產生與臨床相同的病理過程。
[0068]實施例3利用HCV急性感染小鼠進行的抗病毒藥物的藥效評價
[0069]丙型肝炎病毒通過尾靜脈注射(TCID5tl=I X IO8)感染C/0Tg雄性小鼠，注射時間控制在I~2分鐘。感染一周后開始進行藥物治療，利巴,林(ribavirin, RBV(sigma)給藥持續4周，姆天腹腔注射20mg/kg)或者特拉匹偉(Telaprevir (votex, VX-950),給藥持續2周，每天腹腔注射200mg/kg)單組份抗病毒藥物治療。利巴韋林在治療后I周和4周，特拉匹偉在治療后I周和2周取小鼠的血清和肝組織。qRT-PCR方法檢測血清、肝細胞中HCVRNA拷貝數(方法見實施例2)。相對于非治療組，利巴韋林在治療后顯著降低了血清和肝臟的病毒拷貝數，其中未治療組外周血病毒載量(genomes/mL) 123489±5761 (注射病毒后I周)，68312±214 (生理鹽水腹腔注射I周)，5958± 1332(生理鹽水腹腔注射I個月);而治療組123489土5761 (注射病韋后I周)，而利巴,林治療I周以及4周在外周血檢測不到病韋拷貝。肝臟病毒拷貝(genomes/mg)未治療組:17864±3223 (注射病毒后I周)，5289±891(生理鹽水腹腔注射后I周)，4713±916 (生理鹽水腹腔注射后4周)，治療組17864±3223(注射病毒后I周)，260 ±226 (注射利巴韋林后I周)，894±639 (注射利巴韋林4周)。結果顯示利巴韋林治療能有效降低HCV在血清中的拷貝數以及在肝臟的復制(圖4-A)而針對HCV特異性藥物特拉匹偉，相對于非治療組，特拉匹偉在治療后顯著降低了血清和肝臟的病毒拷貝數，其中未治療組外周血病毒載量(genomes/mL)其中未治療組外周血病毒載量(genomes/mL) 123489±5761 (注射病毒后 I 周)，39782±5315 (DMS0 腹腔注射 I 周)，4349±1531 (DMS0腹腔注射I個月);而治療組123489±5761 (注射病毒后I周)，特拉匹偉治療I周以及2.周在外周血檢測不到病毒拷貝。肝臟病毒拷貝(genomes/mg)未治療組:17864±3223 (注射病毒后 I 周)，14041 ±2712 (DMS0 腹腔注射后 I 周)，4723±570 (DMS0腹腔注射后4周)，治療組11836±1104 (注射病毒后I周)，273±301 (注射特拉匹偉后I周)，注射特拉匹偉4周肝臟檢測不到病毒拷貝。結果顯示利巴韋林治療能有效降低HCV在血清中的拷貝數以及在肝臟的復制(圖4-B)。提示雙轉基因小鼠的HCV感染模型對于臨床現行藥物敏感，是評估HCV藥物的優秀平臺。
【權利要求】
1.一種⑶81和OCLN雙轉基因小鼠，其特征在于該雙轉基因小鼠是通過如下方法建立的: (1)將人⑶81、OCLN基因克隆，分別插入pLIVE載體，獲得含有⑶81基因的表達載體PLIVE-CD81和含有OCLN基因的表達載體pLIVE-OCLN ； (2)⑶81和OCLN雙轉基因小鼠的構建； 將載體PLIVE-CD81和pLIVE-OCLN分別進行酶切，分別得到含有CD81和OCLN基因的線性DNA片段； 將線性DNA片段注射入ICR小鼠受精卵； 受精卵隨后移植入ICR雌鼠子宮； 小鼠出生后經基因組PCR方法鑒定，分別獲得⑶81和OCLN的建系小鼠； 建系小鼠經回交獲得同時含有CD81和OCLN的轉基因子代小鼠。
2.一種制備權利要求1所述CD81和OCLN雙轉基因小鼠的方法，其特征在于該方法為: (1)將人⑶81、OCLN基因克隆，分別插入pLIVE載體，獲得含有⑶81基因的表達載體PLIVE-CD81和含有OCLN基因的表達載體pLIVE-OCLN ； (2)⑶81和OCLN雙轉基因小鼠的構建； 將載體PLIVE-CD81和pLIVE-OCLN分別進行酶切，分別得到含有CD81和OCLN基因的線性DNA片段； 將線性DNA片段注射入ICR小鼠受精卵； 受精卵隨后移植入ICR雌鼠子宮； 小鼠出生后經基因組PCR方法鑒定，分別獲得⑶81和OCLN的建系小鼠； 建系小鼠經回交獲得同時含有CD81和OCLN的轉基因子代小鼠。
3.權利要求1所述CD81和OCLN雙轉基因小鼠建立急性和慢性HCV感染小鼠模型的應用。
【文檔編號】C12N15/85GK103548775SQ201310502450
【公開日】2014年2月5日 申請日期:2013年10月23日 優先權日:2013年10月23日
【發明者】唐宏, 陳新文, 陳繼征, 趙洋, 張超, 陳海榮 申請人:中國科學院武漢病毒研究所