一種維生素k2及其制備方法
【專利摘要】本發明公開了一種維生素K2及其制備方法，該方法利用1-羥基-2-萘甲酸抗性黃桿菌株HNA12-D進行發酵培養，通過碳源甘油、氮源蛋白胨以及前體物質的分批補料，獲得維生素K2在菌體內的高效代謝，并采用有機溶劑萃取，大孔樹脂聯合硅膠柱提取分離維生素K2，提高了產品的收率和純度。本發明的黃桿菌HNA12-D經發酵培養120～144小時后，維生素K2粗品的總產量為200～600mg/L，經吸附層析后，產品的純度達到80～99%，與現有技術相比，其產量和純度都有大幅提高，并能應用于工業化生產中。
【專利說明】一種維生素K2及其制備方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及的是一種維生素K2，尤其涉及的是一種維生素K2及其制備方法。
【背景技術】
[0002]維生素K (VK)是一族含有共同化學結構(2-甲基-1，4-萘醌環)的物質的統稱，根據萘醌環3’位置所連接側鏈化學結構長度的不同，VK又分為不同的類別，天然存在的VK主要有兩種類型，即維生素Kl (葉綠醌類，簡稱PK)和維生素K2 (甲萘醌類，簡稱MK)，都屬于脂溶性維生素，均可由微生物合成。維生素K2的化學結構式為2-甲基-3-烯基-1，4-萘醌，分子式為C16H16O2.(C5H8)n，依據C-3上異戊二烯側鏈長度的不同，維生素K2可分為14種，通常以MK-n表示，其中n指的是側鏈上異戊二烯單元的個數，其中利用黃桿菌發酵產生的維生素K2的主要成分為MK-4、MK-5或MK-6中的一種或多種，其主要成分的分子式分別為:C31H40O2, C36H48O2, C41H56O2,結構式如下所示:
[0003]
【權利要求】
1.一種維生素K2的制備方法，其特征在于，包括以下步驟: (1)取黃桿菌HNA12-D接種于斜面培養基中，30~38°C下培養24小時進行活化，然后置于4°C下保藏2~15天，獲得活化的黃桿菌HNA12-D的斜面保藏菌； (2)取上述斜面保藏菌接種于種瓶培養基中，在30~38°C下搖瓶培養24~48小時，獲得種瓶培養物； (3)取種瓶培養物接種于發酵培養基中，置于28~38°C下發酵培養120~144小時，獲得發酵液，發酵培養期間每隔20~30小時補加營養物質，所述營養物質為甘油、蛋白胨和維生素K2生物合成的前體物質； (4)取上述發酵液，加入絮凝劑進行絮凝，離心，收集沉淀，獲得濕菌體； (5)將濕菌體放在_15°C低溫下冷凍3~10分鐘，然后在室溫中融化； (6)重復上述步驟(5)2~6次，使濕菌體的細胞經反復凍融而破碎，獲得破碎菌體； (7)取上述破碎菌體，先用有機溶劑進行萃取，獲得維生素K2粗品，再用大孔吸附樹脂對維生素K2粗品進行粗分，最后用硅膠柱精制，獲得維生素K2的純品提取液； (8)將上述純品提取液干燥，獲得所述維生素K2的純品。
2.如權利要求1所述的一種維生素K2的制備方法，其特征在于，所述步驟(1)的斜面培養基配方為:甘油8~12g/L，蛋白胨8~12g/L，酵母提取物1.5~4.5g/L，氯化鈉2~6g/L，磷酸氫二鉀2~10g/L，硫酸鎂0.1~4g/L，瓊脂20g/L ； 所述步驟(2)的種瓶培養基配方為:甘油4~10g/L，蛋白胨4~10g/L，酵母提取物1.5~3.5g/L，氯化鈉2~5g/L，磷酸氫二鉀2~8g/L，硫酸鎂0.05~5g/L ； 所述步驟(3)的發酵培養基配方為:甘油4~10g/L，蛋白胨4~10g/L，酵母提取物1.5~3.5g/L,氯化鈉2~5g/L,磷酸氫二鉀2~8g/L,硫酸鎂0.05~5g/L,聚氧乙烯油醚0.5 ~1.5g/L。
3.如權利要求1所述的一種維生素K2的制備方法，其特征在于，所述步驟(2)中，斜面保藏菌的接種量為每50mL種瓶培養基接種0.1~0.5立方厘米的斜面保藏菌。
4.如權利要求1所述的一種維生素K2的制備方法，其特征在于，所述步驟(3)中，種瓶培養物的接種量占發酵培養基的體積百分比為4~10%。
5.如權利要求1所述的一種維生素K2的制備方法，其特征在于，所述步驟(3)中，營養物質添加的重量百分比為:甘油0.05~0.15%，蛋白胨0.05~0.15%，前體物質0.005~0.05%，所述前體物質為異戊二烯、多聚異戊二烯、松柏油、松香、1，4- 二羥基-2-萘甲酸、1-羥基-2-萘甲酸、甲萘醌、對苯醌、對羥基萘中的一種或多種。
6.如權利要求1所述的一種維生素K2的制備方法，其特征在于，所述步驟(4)中的絮凝劑為明礬、聚合氯化鋁、聚丙烯酰胺、亞鐵氰化鉀或硫酸鋅。
7.如權利要求1所述的一種維生素K2的制備方法，其特征在于，所述步驟(7)中的有機溶劑為正己烷、異丙醇、甲醇、正丁醇中的一種或多種。
8.如權利要求1所述的一種維生素K2的制備方法，其特征在于，所述步驟(7)中的大孔吸附樹脂的型號為HZ816、HZ807、HZ806、HZ818或HZ820。
9.如權利要求1所述的一種維生素K2的制備方法，其特征在于，所述步驟(7)的硅膠柱精制中，洗脫溶劑為體積比為10~20:1的正己烷與乙酸乙酯混合液，洗脫流速為0.5~.4.5BV/h0
10.一種利用如權利要求1~9任一所述的維生素K2的制備方法制備獲得的維生素K2，其特征在于，所述維生素K2的組分為MK-4、MK-5或MK-6中的一種或多種。
【文檔編號】C12R1/20GK103571897SQ201310521459
【公開日】2014年2月12日 申請日期:2013年10月29日 優先權日:2013年10月29日
【發明者】鄭之明, 劉艷, 王麗, 王鵬, 趙根海, 劉會, 李哲敏, 吳荷芳, 劉紅霞, 檀沐 申請人:中國科學院合肥物質科學研究院