中華絨螯蟹溶菌酶基因及其編碼蛋白和應用的制作方法
【專利摘要】本發明公開了一種中華絨螯蟹溶菌酶基因，其核苷酸序列如SEQ?ID?NO.1所示，并提供了其重組表達與純化方法。本發明還提供了中華絨螯蟹溶菌酶基因編碼的溶菌酶多肽，其氨基酸序列如SEQ?ID?NO.2所示，并提供了該基因序列的用途、溶菌酶的用途：本發明的溶菌酶既對革蘭氏陽性菌有抑菌活性，還對革蘭氏陰性菌有抑菌活性。利用本發明獲得的重組溶菌酶可用于開發抗菌類藥物和的飼料添加劑。
【專利說明】中華絨螯蟹溶菌酶基因及其編碼蛋白和應用
【技術領域】:
[0001]本發明涉及基因工程領域，具體是涉及中華絨螯蟹溶菌酶基因及其編碼的溶菌酶與所述基因在制備具有抗菌活性的重組蛋白中的應用。
【背景技術】:
[0002]無脊椎動物缺少獲得性免疫，在動物體液中不具有免疫球蛋白，其機體防御反應具有不同于脊椎動物的一些獨特性質，其反應機制傳統上被分為細胞免疫和體液免疫，主要包括血細胞的吞噬、包裹以及血淋巴中的一些水解酶、抗菌效應分子和調理因子的作用
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[0003]抗菌肽是一類廣泛存在于整個生物界中的雙親性小分子堿性多肽，是機體非特異性免疫的關鍵因子之一。自Steiner發現天蠶素cecropin以來，在各種生物中已經發現了1000多種抗菌肽。近年來，已從許多無脊椎動物體內分離出具有抗菌效應的多肽。溶菌酶又稱粘肽N-乙酰基胞壁酰水解酶，廣泛存在于無脊椎動物、脊椎動物、植物、細菌和噬菌體的各種器官或分泌物中，是固有免疫系統的重要分子。作為抗菌肽，溶菌酶能催化細菌細胞壁中肽聚糖N-乙酰葡萄糖胺和N-乙酰胞壁酸之間的β -1，4糖苷鍵的水解，導致細菌細胞壁破裂、內容物逸出而使細菌死亡。此外溶菌酶還可誘導調節機體其它免疫因子的合成與分泌、協同其它免疫因子進行免疫防御，對于缺少特異性免疫的無脊椎動物來說，溶菌酶是其免疫系統中非常重要的抗菌肽。
[0004]中華絨鰲蟹(Eriocheir sinensis)俗稱河蟹,屬甲殼綱，十足目，方蟹科，絨螯蟹屬，其肉味鮮美，具有很高的營養價值和經濟價值，是我國重要的水產養殖品種。隨著中華絨鰲蟹養殖環境的惡化，病害頻繁發生，鑒于此，研究中華絨鰲蟹的抗菌肽對于了解蟹免疫防御機制有著重要的作用。
[0005]在中華絨螯蟹中發現有多種抵抗外界病原微生物的蛋白或肽類，如多種凝集素、抗脂多糖因子，但還未有溶菌酶基因的報導。

【發明內容】
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[0006]本發明提供了中華絨螯蟹溶菌酶基因及其編碼蛋白和應用。
[0007]為實現上述目的，本發明采用的技術方案是:
[0008]一種中華絨螯蟹溶菌酶基因Eslysozyme，具體為序列SEQIDN0.1中堿基序列所示。其是從中華絨螯蟹中克隆到溶菌酶基因Eslysozyme的cDNA序列，該序列全長為831bp,包括開放閱讀框426bp，5’非編碼區長為25bp，3’非編碼區長為383bp，一個多聚腺苷酸尾巴。利用pET32a表達載體在大腸桿菌BL21中重組表達了該蛋白，表達產物具有抑菌活性。
[0009]中華絨螯蟹溶菌酶基因的編碼蛋白具有SEQIDN0.2所示的氨基酸序列，完整編碼蛋白含有141個氨基酸，其中編碼序列的1-16個氨基酸為信號肽序列。成熟肽包括125個氨基酸，預測該蛋白分子量為14.08kDa。成熟肽具有典型的Destabilase結構域。
[0010]本發明利用表達序列標簽技術和cDNA末端快速擴增技術從中華絨螯蟹中克隆到溶菌酶基因的cDNA的全長序列，通過PCR技術，擴增編碼溶菌酶成熟肽的基因片段并將其克隆到pET32a表達載體中，在大腸桿菌BL21中實現原核體外重組表達。重組產物經鎳瓊脂糖凝膠純化，透析復性后，獲得了重組溶菌酶蛋白，經檢測此重組蛋白具有較高的抑菌活性。本發明為中華絨螯蟹免疫防御機制提供了理論基礎，并為中華絨螯蟹的病害防治，開發醫藥產品和飼料添加劑奠定應用基礎。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0011]圖示為本發明中華絨螯蟹溶菌酶重組蛋白對金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)和大腸桿菌(E.coli)生長的抑制作用。
【具體實施方式】:
[0012]下面的實施例中將對本發明作進一步的闡述，但本發明不限于此。
[0013]實施例1:
[0014]一種克隆得到的中華絨螯蟹溶菌酶基因，具有SEQ ID N0.1所示的序列。
[0015]從 http: / / www.ncb1.nlm.nih.gov 網站下載中華絨螯蟹 cDNA 文庫(TaxonomyID:95602)的EST序列，將這些序列進行拼接，其中一條拼接序列推導出的氨基酸序列與Penaeus monodon溶菌酶的相似性為60%,與Litopenaeus vannamei溶菌酶的相似性為58.6%，經SMART軟件進行預測，該序列具有一個典型的Destabilase結構域。根據這條拼接序列設計正向引物PI (5 ’ -AGACAGGGGACGGAGAGTACGA-3 ’)和和adaptor dT弓丨物(5 ’ -GGCCACGCGTCGACTAGTACT17-3 ’)，中華絨螯蟹的cDNA為模板，進行PCR擴增，將PCR擴增產物稀釋100倍作為模板，利用正向引物P2 (5’ -TCACGTATTTGGTTCAGGTAAG-3’ )和adaptor dT引物進行第二次PCR擴增，瓊脂糖凝膠電泳檢測并回收目的片段，連接至PMD-18T載體，轉化大腸桿 菌T0P10感受態細胞中，選取陽性克隆送至生物公司進行測序。測序結果與經BLAST分析顯示該擴增片段為溶菌酶基因。將EST序列和所擴增的溶菌酶基因3’端序列拼接，即獲得溶菌酶基因的cDNA全長序列，如SEQ ID N0.1所示。設計引物P3(5’ -CTTCGAATTCCGACACCAA-3’)和 P4(5’ -TTTTTGTGCTTAAGAGCCCTAATA-3’)以驗證溶菌酶基因序列。
[0016]實施例2:
[0017]中華絨螯蟹溶菌酶基因編碼區原核重組表達載體的構建、表達和純化
[0018]1、重組表達載體的構建
[0019]根據中華絨螯蟹溶菌酶基因序列和表達載體pET32a (Novagen公司)的克隆位點，本發明采用pET32a中的EcoRI和Xho I酶切位點，設計引物時在上游引物引入EcoRI酶切位點，下游引物引入Xho I酶切位點。設計并合成用于擴增中華絨螯蟹溶菌酶基因編碼區片段的引物，P5 (5 ’ -GAATTCGACCCGCTGGAGGAC-3 ’)和 P6 (5 ’ -CTCGAGACGGAGAGGCATTGTGT-3，)。以中華絨螯蟹的cDNA作為模板擴增Eslysozyme片段，16°C下連接pMD18_T和Eslysozyme片段，將連接產物轉化大腸桿菌T0P10感受態細胞，用氨芐青霉素及PCR技術篩選陽性克隆，獲得pMD18-T-Eslysozyme重組質粒。在37°C水浴條件下，用EcoRI和Xho I分別酶切pET32a和pMD18-T-ESlyS0Zyme。酶切結束，用1%的瓊脂糖凝膠電泳酶切產物，回收pET32a載體大片段和帶有EcoRI和Xho I酶切位點的Eslysozyme片段，然后在T4DNA連接酶作用下，在16°C連接過夜。連接產物轉化大腸桿菌T0P10，用氨芐青霉素篩選和菌落PCR篩選并測序。
[0020]2、重組蛋白的表達和純化
[0021]本研究中使用的重組表達菌株為BL21，其帶有的plysS質粒可以表達T7溶菌酶，能抑制誘導物加入之前插入基因的泄漏表達，因此可以提高宿主菌對毒性表達物的耐受能力。
[0022]重組蛋白的誘導表達步驟如下:
[0023](1)挑取單克隆，于帶有氨芐青霉素的LB培養基中，220rpm，37°C培養至0D600約為0.5。
[0024](2)加入終濃度為 0.8mmol L-1 的 IPTG，220rpm, 37°C繼續培養 4_6h。
[0025](3)4°C，5000rpm，離心lOmin，收集菌體沉淀。加入100 μl上樣緩沖液，沸水浴中裂解1Omin后離心，取上清，于15%的SDS-PAGE電泳分析，考馬斯亮藍R-250染色，脫色后用凝膠成像系統記錄結果。
[0026]同時做未誘導對照，取Iml菌液離心，棄去上清后，加入80 μl水和20μ 15Χ蛋白上樣緩沖液，100°C沸水煮沸10分鐘，稍離心，收集上清液和和沉淀，SDS-PAGE檢測表達產物。
[0027]重組蛋白的純化步驟如下:
[0028]采用金屬螯合層析方法，利用組氨酸側鏈上的咪唑基與金屬離子(Ni2+)等螯合的特性，使基因重組技術制備的His-Tag融合重組蛋白和pET32a空載體誘導表達的TRX蛋白得到純化。主要實驗步驟操作如下:
[0029]( 1)變性狀態下純化His標簽重組蛋白所需緩沖液配方:
[0030]A.緩沖液I:配制:0.5mol L-1NaH2PO4Igmlj0.5mol I^1Na2HPO4Slml, NaC129.3g 和尿素480g，溶解后定容到1L。
[0031]B.緩沖液 II:配制:0.5mol L-1NaH2PO419mlj0.5mol L-1Na2HPO4SlmLNaCd 3g，咪唑34g和尿素480g，溶解后定容到1L。
[0032]C.緩沖液III:咪唑濃度為50mmol L-1的緩沖液B:緩沖液I90ml，加緩沖液IIlOml ;咪唑濃度為400mmol L-1的緩沖液B:緩沖液120ml，加緩沖液II80ml。
[0033](2)純化步驟
[0034]A.離心收集菌體，加20_30ml緩沖液I。超聲波破碎菌體后離心取上清。細菌破碎液用0.45 μ m濾膜過濾。
[0035]B.用緩沖液I平衡10個床體積，控制流速為1ml min-1。
[0036]C.將細菌破碎液以流速為1ml min-1上樣。
[0037]D.用緩沖液I洗10個柱床體積，流速為1ml min-1。
[0038]E.用分別含50mmol r\400mmol L-1咪唑的緩沖液III進行階段洗脫，流速為2mlmirT1，收集各階段洗脫峰，每個濃度洗脫5個柱床體積，用SDS-PAGE檢測融合蛋白的分子量大小和純度。
[0039]F.用純水流洗5個柱床體積，再用20%的乙醇流洗5個柱床體積，將柱子于4~8°C環境中保存。重組蛋白以包涵體形式存在，以常規方法經過包涵體純化、復性獲得中華絨螯蟹溶菌酶重組蛋白。[0040]實施例3:
[0041]中華絨螯蟹溶菌酶重組蛋白的抑菌活性測定
[0042]重組蛋白的抑菌活性是根據Rathinakumar等的方法略微改動。測定重組蛋白Eslysozyme對細菌生長曲線的影響。
[0043](I)測試菌為金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)>枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)和大腸桿菌(E.coli)。當被測菌長到對數生長期時,離心,沉淀用Tris-HCl (50mmol 1，pH=8.0)溶解，使濃度達到每毫升為IO3菌落形成單位。
[0044](2)在平底96孔板(Costar, Fisher)中每孔加50 μ I菌懸液。蛋白用Tris-HCl梯度稀釋后，加到96孔板中，每個濃度設5個重復，對照蛋白TRX設為對照組。
[0045](3)室溫孵育3小時，再加入150 μ I的培養基。
[0046](4)混勻。放入28°C培養箱中過夜培養。
[0047](5)用酶標儀于600nm檢測各孔OD值。
[0048]抑菌 實驗結果:重組溶菌酶蛋白對大腸桿菌、枯草芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌有抑菌活性，如圖所示。
【權利要求】
1.中華絨螯蟹溶菌酶基因，其特征在于:中華絨螯蟹溶菌酶基因的CDNA序列為序列表SEQ ID Nol中所示的核苷酸序列。
2.一種按權利要求1所述的中華絨螯蟹溶菌酶基因的編碼蛋白，其特征在于:所述編碼蛋白氨基酸序列如SEQ ID No2中所示。
3.一種按權利要求1所述的中華絨螯蟹溶菌酶基因的重組蛋白作為殺菌劑的應用，其特征在于:在大腸桿 菌中進行表達，獲得具有抑菌活性的重組蛋白。
【文檔編號】C12N9/36GK103614399SQ201310553323
【公開日】2014年3月5日 申請日期:2013年12月21日 優先權日:2013年12月21日
【發明者】李鳳梅 申請人:青島科技大學