專利名稱：中華絨螯蟹Crustin-2基因及其重組蛋白的應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于分子生物學技術領域，涉及中華絨螯蟹Crustin-2基因序列，具體地說是從中華絨螯蟹cDNA文庫中篩選出中華絨螯蟹Crustin-2相關的EST序列，并拼接成全序列，然后進行了 Crustin-2的原核重組表達并進行了相應抗菌活性的鑒定。該發明涉及到Crustin-2基因及其表達產物在藥物生產、飼料添加劑以及防腐劑和保鮮劑生產中的應用。
背景技術：
抗菌肽是廣泛存在于生物界中的雙親性小分子堿性多肽，是機體固有免疫的關鍵因子。Steiner最早在天蠶中發現后，到目前為止，在各種生物中總共發現了 800多種抗菌肽。根據抗菌肽的序列、二級結構和抗菌特性等，將己發現的抗菌肽分為四大類(1)不含半胱氨酸的線型抗菌肽，如天蠶素、馬蓋寧等；(2)具有半胱氨酸的環型抗菌肽，如防御素，抗真菌肽等；(3)富含某一種或兩種氨基酸的抗菌肽，主要包括富含脯氨酸的抗菌肽以及富含甘氨酸的抗菌肽等；(4)由前體大分子酶解產生的抗菌肽，如鱟的血藍蛋白。Crustin作為一種針對革蘭氏陽性菌的抗菌肽，首先是在岸蟹中發現的(Rdfetal.,1999)。隨后的研究發現其氨基酸序列在在其C末端有12個Cys，其中8個位置保守，形成WAP結構域。
中華絨螯蟹(五n'oc/^VWw似/力又名河蟹，因其營養豐富、味道鮮美而深受人們喜愛，fe我國重要的水產養殖品種之一。自20世紀80年代以來，中華絨螯蟹養殖業發展迅速，到2000年全國養殖產量已超過100 OOOt,年產值達120-150億元，已成為水產養殖支柱產業之一(崔朝霞等，2003)。但隨著中華絨螯蟹養殖規模的不斷擴大，各種疾病日趨嚴重，給養殖產業造成了巨大損失。養殖中華絨螯蟹病害的不斷爆發及病因的多樣性迫切要求從機體自身的免疫防御因子入手研究其抗病機制和制定新的疾病防治措施。Crustin作為一種重要的針對革蘭氏陽性菌的抗菌肽在其免疫防御中發揮著非常重要的作用。

發明內容
本發明的目的是從中華絨螯蟹中克隆Cmstin-2，并對其進行原核重組表達及重組產物的活性鑒定，為進一步研究中華絨螯蟹疾病防御機制提供基礎，并為中華絨螯蟹的病害防治、基因輔助選育及進一步開發為醫藥產品和詞料添加劑奠定基礎。
為實現上述目的，本發明采用的技術方案為
利用構建的cDNA文庫，采用RACE技術以及體外重組表達等技術，對中華絨螯蟹Crustin-2進行了研究，首次從中華絨螯蟹中克隆到Crustin-2，該基因具有序列表中所示的序
3列。
本發明從中華絨螯蟹中克隆到Crustin-2基因cDNA全長1255bp，包含一個339 bp的開放閱讀框，編碼112個氨基酸，5'非編碼區長30bp， 3'非編碼區長886bp，有多聚腺苷酸加尾信號和多聚腺苷酸尾巴，該基因在中華絨螯蟹免疫防御方面發揮著重要作用。它具有SEQID NO. 1所示的序列。
其編碼的蛋白具有SEQ ID NO. 2所示的氨基酸序列，分子量為12369.06,等電點為6.76 ，其中編碼序列的l-19為信號肽序列，成熟肽分子量為10464.64，等電點為6.21。具有典型的WAP結構域。利用pET30a(+)表達載體在大腸桿菌origami (DE3)重組表達了該蛋白，表達產物對革蘭氏陽性菌具有明顯抑菌活性，如藤黃微球菌(M&racoca^ 枯草桿菌(5a"7/wj jwMfo)、 四聯球菌(M/crococcm /"mge"ws)禾口蘇云金芽孢桿菌(6a"7/tts Awn'"g/e柳'j)的最小抑菌濃度分別為0.093 pM、 0.19 nM、 0.37 pM和0.093 而對革蘭氏陰性菌，如大腸桿菌&c^eHcWa co"和鰻弧菌ij'sfo"e〖a 。"gw!7/an/m沒有殺傷活力。中華絨螯蟹Crustin-2基因的重組表達產物可作為動物飼料添加劑、食品防腐劑、食品保鮮劑。
本發明利用表達序列標簽(EST)技術、cDNA末端快速擴增(RACE)技術從中華絨螯蟹中克隆到Crustin-2基因cDNA全長序列，通過PCR技術，擴增編碼Crustin-2成熟肽的基因片段并將其克隆到pET30a(+)表達載體中，在大腸桿菌Origami (DE3)實現體外重組表達。重組產物經HiTrap chelating柱純化和透析后，對藤黃微球菌、枯草芽孢桿菌、四聯微球菌和蘇云金芽孢桿菌都具有較強的殺菌活力，最小抑菌濃度分別為0.093 ^M、 0.19 nM、 0.37和0.093 ^M;對革蘭氏陰性菌沒有明顯的殺菌活力。本發明可以為進一步研究中華絨螯蟹免疫防御機制提供基礎，并為中華絨螯蟹的病害防治、基因輔助選育和飼料添加劑奠定基礎，同時為進一步開發為醫藥產品奠定基礎。實施實例1:
本發明中的中華絨螯蟹Crustin-2的cDNA序列克隆及體外重組表達包括下列步驟
a) 中華絨螯蟹總RNA的提取及mRNA的純化；
b) 中華絨螯蟹cDNA文庫構建；
c) 中華絨螯蟹cDNA文庫EST序列的大規模測定；
d) 中華絨螯蟹EST序列的同源性分析及Crustin-2基因片段的篩選；
e) EST序列拼接獲得Cmstin-2的全序列；
f) 中華絨螯蟹Crustin-2的體外重組表達及活性分析。具體操作如下
.中華絨螯蟹總RNA的提取及mRNA的純化利用Invitrogen公司的Trizol試劑從感染了鰻弧菌的中華絨螯蟹血淋巴中提取總RNA，利用QIAGENE公司的OligotexmRNA純化試劑盒純化mRNA。
2. 中華絨螯蟹cDNA文庫構建利用Stratagene公司cDNA Synthesis Kit和ZAP-cDNA Synthesis Kit (Stratagene)進行cDNA的合成，雙鏈cDNA經末端補平、五co及I接頭連接、￡co/ I末端磷酸化、A7zo I內切酶酶切后利用QIAGEN公司QIAEX II AgaroseGel Extraction Kit對大于lOObp的酶切片段進行回收，與Invitrogen公司Uni-ZAP XRvector載體連接，利用Stratagene公司的ZAP-cDNA Gigapack III Gold Cloning Kit試劑盒進行文庫包裝，利用Exassist Helper Phage和SOLR菌株從Uni-ZAP XRVector上體外切割pBluescript成為質粒文庫。
3. 中華絨螯蟹cDNA文庫EST序列的大規模測定文庫中篩選陽性克隆，使用載體通用引物T3在MegaBACE1000測序儀上進行序列測定，將得到的原始峰圖文件(*.abi，*.abd文件)數據經Phred程序處理轉化為序列文件(*.seq)和質量文件(氣s叫.qual)，依據質量文件提供的數值確定獲得序列的誤差概率，去除低質量的堿基，用cross-mach程序屏蔽數據中的載體序列，從得到的數據中選取連續堿基質量大于Q13 (準確率大于95%)且長度大于100bp的序列作為EST數據，具體《基因表達序列標簽(EST)數據分析手冊》(胡松年著，浙江大學出版社，2005年)。
4. 中華絨螯蟹EST序列的同源性分析及Crustin-2基因片段的篩選將獲得的全部有效的EST數據進行聚類拼接，生成Contigs禾Q Singletons,分別將所獲的Contigs與Singletons在數據庫中進行BLASTn和BLASTx分析，根據相似性分析結果尋找出與Crustin-2基因同源的EST序列。
5. 中華絨螯蟹Crustin-2基因cDNA全長序列的克隆根據Crustin-2的EST序列設計特異 性 引 物 Fl (GTGCGACAGGAACCAGAAGC) 禾卩 Rl(CTCGGGCTTCTGGTTCCTGT)， 分別利用載體通用引物 T3(AATTAACCCTCACTAAAGGG)禾卩T7 (GTAATACGACTCACTATAGGGC)進行3，和5'末端的擴增。PCR產物用1.0%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，用膠回收試劑盒(上海博大泰克)進行PCR產物的回收和純化，再與pMD-18T載體(大連寶生物工程有限公司)連接，然后轉化大腸桿菌感受態細胞T叩10F',挑選陽性克隆用載體引物M13-47和RV-M進行測序，所得結果經CLUSTER分析拼接和得到全長序列。
3'RACE擴增所用反應體系及反應條件25 [d反應體系，包含2.5 nl 10xPCR buffer,1.5^1 MgCl2 (2.5 mM),
1.0 nl弓I物F1 (lOpmo,)，
1.0 ^引物T7(10pmol/pl)，
2.0 nl dNTP (2.5 mM)，
0.15 |il Taq DNA polymerase (Promega),
l.OplcDNA模板，
15.85PCR-grade water。
反應在PTC-100PCR熱循環儀(MJ Research)中進行，反應條件為94。C預變性5分鐘，然后進入35個循環94。C變性30秒'59'C退火30秒'72"C延伸60秒。最后進行72°C延伸IO分鐘。
5'RACE擴增所用反應體系及反應條件
25 反應體系
2.5 pl 10xPCR buffer,
1.5^1 MgCl2 (2.5mM),
1.0 nl引物R1 (10pmoLVl)，
1.0 pi引物T3(10pmo騎
2.0 nl dNTP (2.5 mM)，
0.15 pi Taq DNA polymerase (Promega),
1.0 jilcDNA模板，
15.85 nl PCR隱grade water。
反應在PTC-100PCR熱循環儀(MJ Research)中進行，反應條件為94。C預變性5分鐘，然后進入35個循環94。C變性30秒'60。C退火30秒'72。C延伸90秒。最后進行72°C延伸IO分鐘。陽性克隆的PCR篩選條件為.-
25 nl反應體系
2.5 pl 10xpCR buffer,
1.5plMgCl2 (2.5 mM),
1.0 nl引物M13-47 (10pmol/nl),
1.0 pi引物RV-M (10 pmol/pl),
2.0 dNTP (2.5 mM)，
0.15 pi Taq DNA polymerase (Promega),1.0 pl菌液
15.85 pl PCR-grade water<>
反應在PTC-100 PCR熱循環儀(MJ Research)中進行，反應條件為94。C預變性5分鐘，然后進入35個循環94。C變性30秒，59。C退火30秒，72。C延伸60秒。最后進行72。C延伸IO分鐘。
實施實例2.
根據SEQ ID NO. 2對應的cDNA序列，設計含有限制性內切酶AWe I和屈o I酶切位點的特異性引物 F2 (CATATGACGTCTGTCCTGCACCACAATAA)和 R2
增編碼Crustin-2成熟肽的基因片段，反應在PTC-100 Programmable Thermal Crontroller cycler(MJ Research)中進行，反應條件為94。C預變性5分鐘；然后進行35循環包含94。C變性30秒，6(TC退火30秒，72'C延伸30秒；最后72'C延伸10分鐘。然后將其克隆到pET30a(+)表達載體中，轉化大腸桿菌origami (DE3),測序確認表達框正確后，接種陽性克隆到LB培養基中，37。C振蕩培養至O.D6Q()=0.4-0.6，加入IPTG至終濃度為lmM誘導4小時后離心收集菌體。菌體用超聲波200W處理30-60分鐘(每次3秒，間隔3秒)。離心收集上清，利用Amersham公司的HiTrap chelating柱純化重組產物。純化后的產物利用梯度稀釋法進行抑菌活性測定。以藤黃微球菌、枯草芽孢桿菌、四聯微球菌、蘇云金芽孢桿菌、大腸桿菌和鰻弧菌作為受試菌株檢驗表達產物的殺菌活性。將104-105的對數生長期受試菌在28'C培養24-36小時后，600nm測定細菌濃度。發現革蘭氏陰性菌在所有Crustin-2試驗濃度下都能正常生長，而革蘭氏陽性菌只在含低濃度Crustin-2或者不含Crustin-2的LB培養基中生長。
實施實例3:重組表達產物在藥物生產、飼料添加劑、防腐劑以及保鮮劑方面的應用。
7中華絨螯蟹Crustin-2基因及其體外重組表達SEQUENCE LISTING
<110>中國科學院海洋研究所
〈120〉中華絨螯蟹Crustin-2基因及其體外重組表達
<130〉
〈140> 1
<141〉 2009-03-17
<歸 2
<170> Patervtln version 3. 5
<210〉 1
<211> 1255
<212〉 謹
<213> 中華絨螯蟹(Eriocheir sinensis)
<220>
〈221〉 CDS
<222〉 (31)..(369)
<400〉 1
ccccgggctg caggaattcg aattccaaaa atg aag gtg tgt ctg acc etc ctg 54
Met Lys Val Cys Leu Thr Leu Leu1 5
get acc tgc ctg ttg gtg ggg ctg age age ggc acg tct gtc ctg cac 102Ala Thr Cys Leu Leu Val Gly Leu Ser Ser Gly Thr Ser Val Leu His10 15 20
cac aat aac aaa ttc tgc ggc gac aac gtg ccc acc tec caa acc tat 150His Asn Asn Lys Phe Cys Gly Asp Asn Val Pro Thr Ser Gin Thr Tyr25 30 35 40
ggc tgc cgc tac ttc acc aag gac tac aac gac aaa tac gtg tgc gac 198Gly Cys Arg Tyr Phe Thr Lys Asp Tyr Asn Asp Lys Tyr Val Cys Asp45 50 55
agg aac cag aag ccc gag age acc tgc ccg cca ctt cgt ccc aca tgc 246Arg Asn Gin Lys Pro Glu Ser Thr Cys Pro Pro Leu Arg Pro Thr Cys60 65 70
acc agg aac ttc age ggc ggt ccc cct gtg gag tgc gtg acc gac aac 294Thr Arg Asn Phe Ser Gly Gly Pro Pro Val Glu Cys Val Thr Asp Asn75 80 85
gac tgc gcc tac age gac aag tgc tgc tgt gac get tgc etc gac cac 342Asp Cys Ala Tyr Ser Asp Lys Cys Cys Cys Asp Ala Cys Leu Asp His90 95 100
ccc gtc tgc aag ccc cct tat aac tag ataccccttc gtcccctctt 389Pro Val Cys Lys Pro Pro Tyr Asn中華絨螯蟹Crustin-2基因及其體外重組表達 105 110
taccccttcctataagcctctcggtaaccctaactctatcccttttgttt449
cctttttatccctcttttcagtcttgagataaccccaaactcccttttattctccctgtc509
tcccttttcaccttcctttagcttccatgtaaac t caaacgtccctacattccctttgtt569
ccctttaggtaac c 11 c aaactcctttccattccctgtgttgcctcttctttcttccctt629
tsgcttctatgtaaccctcatattccccttcattccctttgtccctcctctaggtaaccc689
ccgactcccttcccttccctttctaccctctactttctttcctttatagtcgtccggtac749
accccactctctcctccaacccctttgttcccttctctccctcctctttccgttcagtct809
ctaggt犯gcccagtcgcccctacctccatccctccctcctttctcccttcaaccgtatc869
ctccacacctgcccacaagcttttttattgtctttttttttttacaagggagtgactctt929
acgtaagctcatctacgctgttttgtcctctctgtcggcttgagtctttgtgtgtgttcc989
gggttgtctacgcatgtgaagtgttgcc已tgtgatttgttttgtgttgtggttgtcttaa1049
tgagtaatttacgaatgc犯gtgcatctggtatcctgtgtgtgtgtgtgt1109
gtgtgtgtgtgtgtgtacttaagggacttcctactgcggttcactttgatgtttcgagac1169
tggtttcggaacgtgtctcgcatctg犯tctcctctttatgttgttgttg1229
gtc鄉gg郞1255
〈210〉 2 〈211〉 112 <212〉 PRT
〈213〉 中華絨螯蟹(Eriocheir sinensis) 〈400〉 2
Met Lys Val Cys Leu Thr Leu Leu Ala Thr Cys Leu Leu Val Gly Leu 15 10 15
Ser Ser Gly Thr Ser Val Leu His His Asn Asn Lys Phe Cys Gly Asp 20 25 30
Asn Val Pro Thr Ser Gin Thr Tyr Gly Cys Arg Tyr Phe Thr Lys Asp 35 40 45
Tyr Asn Asp Lys Tyr Val Cys Asp Arg Asn Gin Lys Pro Glu Ser Thr 50 55 60中華絨螯蟹Crustin-2基因及其體外重組表達 Cys Pro Pro Leu Arg Pro Thr Cys Thr Arg Asn Phe Ser Gly Gly Pro 65 70 75 80
Pro Val Glu Cys Val Thr Asp Asn Asp Cys Ala Tyr Ser Asp Lys Cys 85 90 95
Cys Cys Asp Ala Cys Leu Asp His Pro Val Cys Lys Pro Pro Tyr Asn 100 105 110
權利要求
1.一種中華絨螯蟹Crustin-2基因，其特征在于具有序列表SEDIQ No.1中的核苷酸基序列。
2. —種要求1所述的中華絨螯蟹Crustin-2基因編碼蛋白，其特征在于具有序列表SEDIQNo.2中氨基酸序列。
3. —種權利要求2所述中華絨螯蟹Crustin-2的應用，其特征在于中華絨螯蟹Crustin-2基因的重組表達產物可作為抗菌劑應用于藥物生產、飼料添加劑、防腐劑以及保鮮劑的生產。
全文摘要
本發明涉及分子生物學技術領域，是中華絨螯蟹Crustin-2的基因克隆及其重組表達技術。本發明利用表達序列標簽(EST)技術、5’和3’末端快速擴增技術(RACE)從中華絨螯蟹中克隆到Crustin-2基因cDNA全長1255bp，包括一個339bp的開放閱讀框，編碼112個氨基酸，該基因在中華絨螯蟹免疫防御方面發揮著重要作用。重組Crustin-2蛋白具有顯著的革蘭氏陽性菌抑菌活性，對藤黃微球菌(Micrococcus luteus)、枯草桿菌(Bacillus subtilis)、四聯球菌(Micrococcus tetragenus)和蘇云金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis)的最小抑菌濃度分別為0.093μM、0.19μM、0.37μM和0.093μM；而對革蘭氏陰性菌沒有明顯抑菌活性。本發明可為進一步研究中華絨螯蟹免疫防御機制提供基礎，并為中華絨螯蟹的病害防治、基因輔助選育和飼料添加劑開發奠定基礎。
文檔編號A61P31/04GK101565703SQ200910020030
公開日2009年10月28日 申請日期2009年3月25日 優先權日2009年3月25日
發明者宋林生, 母昌考, 王玲玲, 蓋云超, 趙建民, 邱麗梅, 鄭沛林 申請人:中國科學院海洋研究所