用于人間充質干細胞的培養基的制作方法
【專利摘要】本發明涉及新型的用于人間充質干細胞（hMSC）的培養基。更具體地，本發明涉及其中hMSC細胞系能夠生長的培養基，包括在通常用于這類細胞的培養基中不能生長的那些細胞系。所述用于人間充質細胞的培養基包括通常用于培養間充質干細胞的基礎培養基；人白細胞/血小板層溶解產物（血沉棕黃層）；胰島素；亞硒酸鈉；乙醇胺；以及堿性成纖維細胞生長因子（bFGF）。
【專利說明】用于人間充質干細胞的培養基
【技術領域】
[0001]本發明涉及用于人間充質干細胞(hMSC)的新型培養基。更具體地，本發明涉及其中hMSC細胞系能夠生長的培養基，包括因為已經適應了特定培養基在通常用于這類細胞的培養基中不能生長的那些細胞系。
【背景技術】
[0002]hMSC是多能細胞，根本特征在于它們能夠分化成多種間充質組織，如骨、軟骨、腱、肌肉和脂肪組織等。hMSC可以從成人體內的多種組織中分離，包括可以在骨髓、脂肪組織和臍帶血中發現的那些hMSC。
[0003]hMSC的抗增殖、免疫調節和消炎的作用已經將注意力集中在這些細胞上，作為由免疫系統引起的疾病(包括移植物抗宿主病、實體器官移植后排斥和自身免疫疾病)的潛在治療劑。
[0004]眾所周知，對于hMSC的體外培養來說需要保持其多能性，并且為此需要向普通培養基中加入外源因子，例如堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)、表皮生長因子(EGF)和轉化生長因子(TGF β -1)。然而，多數hMSC依賴于特定的培養基，并且不能在通常用于間充質干細胞培養的培養基上(如 適用于間充質干細胞(MSCQ)的補充有胎牛血清的DMEM/F12培養基)進行培養。

【發明內容】

[0005]為了克服這些問題，本發明涉及用于hMSC的新型培養基，在其上可以使在其他培養基配制物中不生長的hMSC進行生長。根據本發明的培養基包括:
[0006]a)通常用于間充質干細胞培養的基礎培養基
[0007]b)人白細胞/血小板層溶解產物(血沉棕黃層；LBC)
[0008]c)胰島素
[0009]d)亞硒酸鈉
[0010]e)乙醇胺
[0011]f)堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)
[0012]如在本文件中使用的，術語“培養基”是指用于細胞培養、生長或增殖的營養溶液。術語“細胞培養”是指在人造的體外環境中維持、培養或生長的細胞。
[0013]在本文件中使用的術語“基礎培養基”是指其中當補充有不同補充物時人間充質細胞可以生長的任何培養基，補充物可以包含血清或不包含血清。基礎培養基提供標準無機鹽如鋅、鐵、鎂、鈣和鉀，以及維生素、葡萄糖、緩沖體系和必需氨基酸。
[0014]優選地，根據本發明通常用于培養基中間充質細胞培養的基礎培養基是DMEM/F12+丙酮酸鹽(DMEM/F12培養基是相同份數的Dubelcco改良Eagle培養基(Dubelcco’ sModified Eagle Medium,DMEM)(其是由Harry Eagle開發的最低基礎培養基的改進物)和Ham’s F12 (其由Ham開發用于中國倉鼠卵巢(Chinese Hamster Ovary, CHO )細胞的生長)培養基的混合物)、Ham’ s F10、Ham’ s F12、MCDB131 (由Knedler和Ham開發的培養基，作為具有減少的血清補充物用于人細胞生長的培養基)、或RPMI1640 (其名字來源于RoswellPark Memorial Institute的首字母,其中它由Moore及其同事開發,用于正常淋巴細胞和腫瘤性淋巴細胞的培養，盡管當適量補充時它也可以使其他不同類型的細胞生長)。這些培養基的配制物和組合物廣為人知并且可以從任何生產商和供應商處獲得，例如Gibc0(LifeTechnologies)。更優選地，培養基是DMEM/F12+丙酮酸鹽。
[0015]根據本發明用于人間充質細胞的培養基的一種成分是白細胞/血小板層溶解產物。白細胞/血小板層，也稱為“血沉棕黃層”，是全血離心或沉降后在血漿和紅細胞之間觀察到的層。它基本上包括白細胞和血小板。白細胞/血小板層溶解產物(血沉棕黃層)以5%至20% (v/v)、更優選7%至15% (v/v)、并且最優選10% (v/v)的量存在于根據本發明的培
養基中。
[0016]根據本發明培養基的另一種成分是胰島素。胰島素對細胞生長的有益作用是已知的(Cartwright, T.y Shah, G.P Culture media.Basic cell culture, 2ndedition, Davis, J.M.ed.2002.0xford University Press, New York, USA)。膜島素優選以2mg/L至20mg/L、更優選5mg/L至15mg/L并且最優選lOmg/L的量存在于根據本發明的培
養基中。 [0017]此外，根據本發明的培養基的另一種成分是以亞硒酸鈉形式存在的硒。硒是痕量元素，通常由血清提供給培養基，并且對培養基來說是必需的。亞硒酸鈉以0.005至
1.730mg/L的量存在于培養基中。
[0018]進一步地，根據本發明用于人間充質細胞的培養基包括乙醇胺。眾所周知，乙醇胺促進細胞膜的構建。在根據本發明的培養基中的乙醇胺以lmg/L至8mg/L、優選2mg/L至5mg/L的量存在。
[0019]最后，根據本發明用于人間充質細胞的培養基還包括bFGF。眾所周知，bFGF推薦用于培養間充質細胞(Sato, J.et al.Specific cell types and their requirements.Basic cell culture, 2nd edition, Davis, J.M.ed.2002.0xford University Press, NewYork, USA)。bFGF以5ng/L至25ng/L的量存在于根據本發明的培養基中。
[0020]出乎意料的是，通過在根據本發明的培養基中成分的組合，培養人間充質細胞系是可能的，包括適應通常可商購的其他培養基的那些細胞系，它們不能在通常用于這類細胞的培養基中進行生長，例如由Lonza或PromoCell提供的人間充質細胞。
[0021]可選地，根據本發明的培養基包括抗生素。可以使用通常用于培養這類細胞的任何抗生素。優選地，該抗生素是慶大霉素/兩性霉素的混合物。需用于培養基的抗生素的量可以由本領域技術人員容易地確定。
[0022]對于間充質干細胞的生長來說，需要為根據本發明的培養基補充，例如胎牛血清(FBS)或源自人血漿的細胞培養補充物(CCS)，例如依照美國專利US8，252，590B2中描述獲得的。如果使用FBS，則認為10%至20% (v/v)的量是足夠的。另一方面，如果使用CCS來補充根據本發明的培養基，則認為10%至40% (v/v)的量是足夠的。
[0023]根據本發明用于人間充質干細胞的培養基可以是干燥形式或液體形式。對于以干燥形式使用來說，它的成分可以在合適的液體中溶解，用于培養間充質細胞。對于本領域的技術人員而言，其中可以溶解根據本發明的培養基成分的液體類型是眾所周知的，例如滅菌蒸餾水。
[0024]以下通過參考多個【具體實施方式】進一步詳細地描述了本發明。然而，這些實施例并不旨在限制本發明的范圍。
【具體實施方式】
[0025]實施例
[0026]實施例1
[0027]制備了根據本發明的培養基，包含作為基礎培養基的DMEM/F12+丙酮酸鹽、10%(v/v)的人白細胞/血小板層溶解產物(血沉棕黃層)、10mg/L的胰島素、0.0067mg/L的亞硒酸鈉、2mg/L乙醇胺以及20ng/mL的bFGF。這種培養基稱為LV2。培養基LV2單獨使用，或補充有10% (v/v)的適用于間充質干細胞(MSCQ)的胎牛血清(FBS)或補充有15% (v/V)的源自人血衆的細胞培養補充物(CCS)。培養了可以由Lonza (Basel, Switzerland)或PromoCell (Heidelberg, Germany)商購的hMSC。使用由制造商推薦的培養基作為陽性對照。僅一種可商購的基礎培養基作為陰性對照。結果顯示在表1中。
【權利要求】
1.一種用于人間充質細胞的培養基，其特征在于它包括: a)通常用于培養間充質干細胞的基礎培養基； b)人白細胞/血小板層溶解產物(血沉棕黃層); c)胰島素； d)亞硒酸鈉； e)乙醇胺；以及 f)堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)。
2.根據權利要求1所述的用于人間充質細胞的培養基，其特征在于所述間充質干細胞基礎培養基是 DMEM/F12+丙酮酸鹽、Ham’ s F10、Ham’ s F12、MCDB131 或 RPMI1640。
3.根據權利要求1或2所述的用于人間充質細胞的培養基，其特征在于所述人白細胞/血小板層溶解產物(血沉棕黃層)以5%至20% (v/v)的量存在于所述培養基中。
4.根據權利要求3所述的用于人間充質細胞的培養基，其特征在于所述人白細胞/血小板層溶解產物(血沉棕黃層)以7%至15% (v/v)的量存在于所述培養基中。
5.根據前面權利要求中任一項所述的用于人間充質細胞的培養基，其特征在于所述胰島素以2mg/L至20mg/L的量存在。
6.根據權利要求5所述的用于人間充質細胞的培養基，其特征在于所述胰島素以5mg/L至15mg/L的量存在。
7.根據前面權利要求中任一項所述的用于人間充質細胞的培養基，其特征在于所述亞硒酸鈉以0.005mg/L至1.730mg/L的量存在。
8.根據前面權利要求中任一項所述的用于人間充質細胞的培養基，其特征在于所述乙醇胺以lmg/L至8mg/L的量存在。
9.根據權利要求8所述的用于人間充質細胞的培養基，其特征在于所述乙醇胺以2mg/L至5mg/L的量存在。
10.根據前面權利要求中任一項所述的用于人間充質細胞的培養基，其特征在于所述bFGF以5ng/L至25ng/L的量存在。
11.根據前面權利要求中任一項所述的用于人間充質細胞的培養基，其特征在于它進一步包括抗生素。
12.根據權利要求11所述的用于人間充質細胞的培養基，其特征在于所述抗生素是慶大霉素/兩性霉素的混合物。
13.根據權利要求1至12中任一項所述的用于人間充質細胞的培養基，其特征在于所述培養基以10%至20% (v/v)的量補充有胎牛血清(FBS)。
14.根據權利要求1至12中任一項所述的用于人間充質細胞的培養基，其特征在于所述培養基以10%至40% (v/v)的量補充有源自人血漿的細胞培養補充物(CCS)。
【文檔編號】C12N5/0775GK103805561SQ201310553617
【公開日】2014年5月21日 申請日期:2013年11月8日 優先權日:2012年11月13日
【發明者】喬斯·瑪麗亞·迭斯塞萬提斯, 羅德里戈·加哈爾多羅德里格斯 申請人:基立福有限公司