免疫球蛋白融合蛋白的制作方法
【專利摘要】本發明公開包括生物活性分子和連接到生物活性分子的免疫球蛋白(Ig)Fc結構域的融合蛋白。該Fc結構域是(i)IgG1、IgG2或IgG4，或(ii)IgG4和IgD的雜交人Fc結構域。該雜交Fc用作生物活性分子的載體。
【專利說明】免疫球蛋白融合蛋白
本申請是申請日為2008年5月30日、申請號為200880016313.9、題為“免疫球蛋白融合蛋白”的專利申請的分案申請。
【技術領域】
[0001]本發明涉及雜交人Fe和免疫球蛋白融合蛋白，在其中雜交人Fe連接到生物活性分子。具體地，它涉及雜交人Fe，其源于人免疫球蛋白G(IgG)亞類的組合或人IgD和IgG的組合；以及融合蛋白，在其中這種Fe經共價鍵偶聯到生物活性分子。
[0002]
【背景技術】
[0003]生物活性分子在治療上可以具有很大的優勢。但是，它們作為治療劑可能具有缺點，因為它們具有較低的體內穩定性。它們具有較短的循環半衰期或血清半衰期，因為它們被活體內各種酶消化。因此，一直期望提高生物活性分子的循環半衰期。
[0004]已知:增加蛋白質大小，通過阻止經腎去除蛋白質可以增加它的半衰期(Knauf等，J.Biol.Chem.1988.263 =15064-15070)。例如，已經報道通過將活性蛋白偶聯到人白蛋白可增加蛋白質穩定性(Kinstler等,Pharm.Res.1995.12:1883-1888)。但是，由于活性蛋白至人白蛋白的偶聯只是略微增加它的滯留期，因此發展含有偶聯到人白蛋白的活性蛋白的有效藥物制劑不是有效方法。
[0005]其它報道的方法是調整蛋白質的糖基化。在蛋白質上增加糖基化和將唾液酸引入蛋白質可防止肝中蛋白質的降解。但是，蛋白質糖基化的增加也導致了蛋白質活性的降低。
[0006]為了穩定蛋白質和防止經腎的清除，將蛋白質連接到聚乙二醇(PEG)。共價連接到PEG已經被廣泛使用以遞送具有延長的半衰期的藥物(Delgado等，1992.9 =249-304)。但是，已經報道PEG連接到細胞因子或激素導致受體結合親和力的降低，原因在于該連接所引起的位阻。
[0007]最近，已經研究和發展了使用免疫球蛋白(immunoglobulin, Ig)制備的融合蛋白。Ig是血液的主要成分。A Ig (human Ig’hlg)包括不同種類,例如IgG、IgM、IgA、IgD和IgE (Roitt 等，“Immunology，，1989, Gower Medical Publishing, London, U.K.；New York,N.Y)。人IgGs可以進一步分為各種亞型，其已知為人IgGl (hlgGl)、人IgG2 (hIgG2)、人IgG3 (hIgG3)和人 IgG4 (hIgG4)。
[0008]免疫球蛋白由四條多肽鏈組成，兩條重鏈和兩條輕鏈，它們經過二硫鍵形成四聚體。每條鏈由可變區和恒定區組成。基于同種型(isotypes)，重鏈的恒定區進一步地分成三個或四個區(CH1、CH2、CH3和CH4)。基于Ig同種型，重鏈恒定區的Fe部分包括鉸合部、CH2、CH3和/或CH4結構域。
[0009]關于血清半衰期，IgGl、IgG2和IgG4具有21天的長半衰期，而其它免疫球蛋白具有小于一周的相對短的半衰期。融合到IgG的Fe部分的嵌合蛋白質顯示增加的穩定性和增加的血清半衰期(Capon等，Nature 1989.337:525-531)。生物活性蛋白已融合在CHl區域的N-端、Fe區域的N-端或IgG CH3區域的C-端。
[0010]在開始期，用細胞表面受體例如CD4(Capon等，Nature 1989.337:525-531)、TNFR (Mohler 等，J.1mmunology 1993.151:1548-1561)、CTLA4 (Linsley 等，J.Exp.Med.1991.173:721-730)、CD86 (Morton 等，J.1mmunology 1996.156:1047-1054)的胞外結構域產生IgG融合蛋白。同時，存在幾種已融合到IgG結構域的細胞因子和生長激素。但是，與用細胞表面受體的胞外結構域的融合不同，與非融合細胞因子或生長因子相比，用可溶性蛋白質融合到IgG導致生物活性的降低。嵌合蛋白質作為二聚體存在，其導致由于與它們的靶分子類似受體的相互作用而的位阻，原因在于彼此靠得很近的兩種活性蛋白質的存在。因此，這個問題應該被克服以產生有效的融合蛋白。
[0011]Fe融合技術的其它限制是存在不期望的免疫反應。免疫球蛋白的Fe結構域同時具有效應子功能例如抗體依賴的細胞介導細胞毒反應(antibody dependentcell-mediated cytotoxicity, ADCC)或補體依賴性細胞毒(complement-dependentcytotoxicity,⑶C)。這種效應子功能一般經過Ig的Fe區域與在效應細胞上FcRs的相互作用或經過補體結合取得。因此，應該進行Fe的效應子功能的阻斷以減少不期望的反應例如細胞殺死、細胞因子釋放或炎癥。
[0012]發明公開 技術問題
[0013]總的說來，有對 具有生物活性的最小損失和具有不期望的免疫反應的最小風險的改良Fe融合蛋白的需求。
[0014]技術方案
[0015]本發明提供雜交Fe (雜合Fe)，其源于人IgG亞類的組合或人IgD和IgG的組合。當雜交Fe連接到生物活性分子時，雜交Fe有效增加了生物活性分子的血清半衰期，以及當編碼Fe-多肽融合蛋白的核苷酸被表達時，增加了多肽的表達水平。
[0016]本發明同時提供在其中雜交Fe連接到生物活性分子的雜交Fe融合多肽。該融合蛋白有時稱為“生物活性分子-Fe融合蛋白”或簡稱為“融合蛋白”。該融合蛋白可以具有Fe和生物活性分子之間的連接體。Fe可以在其N-端偶聯到生物活性分子的C-端。
[0017]可通過如下步驟產生融合蛋白:構建編碼和能夠表達融合蛋白的核苷酸；在宿主細胞中表達它；和收獲融合蛋白。可選地，該融合蛋白可以通過表達編碼Fe的核苷酸，并以常規方式將它連接到生物活性分子而產生。
[0018]根據本發明的一種實施方式的多肽可以用下式表示:
[0019]N' -(Zl)p-Y-Z2-Z3-Z4-C/
[0020]其中N'是多妝的N-端和C'是多妝的C-端；
[0021]Zl表示氨基酸序列，其包括在SEQ ID NO: 11的90到98位置的氨基酸殘基的至少C-端部分或在SEQ ID NO:14的90-98位置的氨基酸殘基的至少一部分；
[0022]Y表示氨基酸序列，其包括在SEQ ID NO: 11的99到113位置的氨基酸殘基的至少C-端部分或在SEQ ID NO:14的99到162位置的氨基酸殘基的至少一部分；
[0023]Z2表示氨基酸序列，其包括在SEQ ID NO: 12的111到147位置的氨基酸殘基的至少N-端部分或在SEQ ID NO:14的163到199位置的氨基酸殘基的至少一部分；
[0024]Z3表示氨基酸序列，其包括在SEQ ID NO:11的118-223、SEQ ID N0:12的114-219,SEQ ID NO:24的165-270或SEQ ID NO:13的115到220位置的氨基酸殘基的至少C-端部分；
[0025]Z4表示氨基酸序列，其包括在SEQ ID NO:11的224-330、SEQ ID NO: 12的220-326,SEQ ID NO:24的271-377或SEQ ID NO:13的221-327位置的氨基酸殘基的至少N-端部分以及
[0026]P是O或I的整數，
[0027]其中Z2和Z3氨基酸殘基總數是在80和140之間，兩端數值包括在內。
[0028]Zl可以是氨基酸序列，其包括來自于SEQ ID NO:11的90_98位置的氨基酸殘基C-端側的5到9個連續氨基酸殘基，或者來自于SEQ ID NO:14的90-98位置的氨基酸殘基C-端側的5-9個連續氨基酸殘基。在一些實施方式中，Zl可以是IgGlCHl結構域(SEQID NO:11)或IgD CHl結構域(SEQ ID NO:14)的5、6、7、8或9個C-端氨基酸殘基。
[0029]在另一個實施方式中，Zl是氨基酸序列，其包括SEQ ID NO:11的90_98位置的氨基酸殘基或SEQ ID NO: 14的90-98位置的氨基酸殘基。Zl可以是由SEQ ID N0:11的90-98的位置或SEQ ID NO:14的90-98的位置5到9個氨基酸殘基組成的氨基酸序列。Zl也可以是由SEQ ID NO: 11的90到98氨基酸殘基或SEQ ID NO:14的90到98的氨基酸殘基組成的氨基酸序列。
[0030]Y可以是氨基酸序列，其包括來自于SEQ ID NO: 11的99到113位置的氨基酸殘基的C-端側的5個或更多個、或10個或更多個連續氨基酸殘基，或來自于SEQ ID NO: 14的99到162位置的氨基酸殘基C-端側的10個或更多個連續氨基酸殘基。在某些實施方式中，Y可以是氨基酸序列，其包括SEQ ID NO:11的99到113位置的氨基酸殘基、SEQ IDNO:14的158到162位置的氨基酸殘基、SEQ IDNO:14的153到162位置的氨基酸殘基、SEQIDNO:14的143到162位置的氨基酸殘基、SEQ ID NO:14的133到162位置的氨基酸殘基或SEQ ID NO:14的99到162位置的氨基酸殘基。
[0031]Z2可以是氨基酸序列，其包括來自于SEQ ID NO:12 (hIgG2)的111到147位置的氨基酸殘基的N-端側的4到37個或6-30個連續氨基酸殘基，或來自于SEQ ID NO:14(hIgD)的163到199位置的氨基酸殘基的N-端側的6_30個連續氨基酸殘基。在某些實施方式中，Z2可以是人IgG2CH2結構域的6個N-端氨基酸殘基或人IgD CH2結構域的8
個N-端氨基酸殘基。
[0032]Z2和Z3的氨基酸殘基總數可以是80和140之間。在一個實施方式中，Z2和Z3的氨基酸殘基總數可以是90和120之間，兩端數值包括在內。在另一個實施方式中，Z2和Z3的氨基酸殘基總數可以是105和115之間，兩端數值包括在內。在一個實施方式中，Z2和Z3的氨基酸殘基總數是108。在更一個實施方式中，Z2和Z3的氨基酸殘基總數是109。
[0033]Z4可以是氨基酸序列，其包括來自于SEQ ID NO:11 (hlgGl)的224-330、SEQ IDNO:12(hIgG2)的 220-326、SEQ ID NO:24(hIgG3)的 271-377 或 SEQ ID NO:13(hIgG4)的221到327位置的氨基酸殘基的90或更多個、或100或更多個連續氨基酸殘基。Z4可以是SEQ ID NO:11 的 224-330、SEQ ID NO:12 的 220_326、SEQ ID NO:24 的 271-377 或 SEQ IDNO: 13的221到327位置的氨基酸殘基的氨基酸序列。
[0034]根據實施方式，Z3-Z4是選自以下的氨基酸序列:⑴由SEQ ID NO: 11的118到223位置的氨基酸殘基的C-端部分和SEQ ID NO:11的224到330位置的氨基酸殘基的N-端部分組成的連續氨基酸序列，(ii)由SEQ ID NO:12的114到219位置的氨基酸殘基的C-端部分和SEQ ID NO: 12的220到326位置的氨基酸殘基的N-端部分組成的連續氨基酸序列，(iii)由SEQ ID NO:24的165到270位置的氨基酸殘基的C-端部分和SEQ IDNO:24的271到377位置的氨基酸殘基的N-端部分組成的連續氨基酸序列，和(iv)由SEQID NO: 13的115到220位置的氨基酸殘基的C-端部分和SEQ ID NO: 13的221到327位置的氨基酸殘基的N-端部分組成的連續氨基酸序列。
[0035]根據本發明的一個實施方式，多肽的氨基酸殘基總數是從154到288。
[0036]在一個實施方式中，Y可以是氨基酸序列，其包括SEQ ID NO:11的99-113位置的氨基酸殘基的至少一部分，P可以是O或I ;Z2可以是氨基酸序列，其包括SEQ ID N0:12的111-147位置的氨基酸殘基的至少一部分；和Z3可以是氨基酸序列，其包括SEQ ID NO:11的 118-223、SEQ ID NO:12 的 114-219、SEQ IDNO:24 的 165-270 或 SEQ ID NO:13 的 115到220位置的氨基酸殘基的至少一部分。在這個實施方式中，當P是I時，Zl可以是氨基酸序列，其包括SEQ ID NO:11的90到98位置的氨基酸殘基的至少一部分。
[0037]在進一步的實施方式中，Z3可以是SEQ ID NO:11的118-223、SEQID NO:12的
114-219,SEQ ID NO:24 的 165-270 或 SEQ ID NO:13 的 115-220 位置的 73 到 106 個連續氨基酸殘基，并且Z2和Z3的氨基酸殘基總數可以是110。Z2可以是SEQ ID NO: 12的111-116位置的氨基酸殘基，和Z3可以是SEQ ID NO:11的120-223、SEQ ID NO:12的116_219、SEQID NO:24的167-270或SEQ ID NO:13的118到220位置的氨基酸序列。
[0038]在另一個實施方式中，Y可以是氨基酸序列，其包括SEQ ID NO: 14的99到162位置的氨基酸殘基的至少一部分，P可以是I或0(零)；Z2可以是氨基酸序列，其包括SEQ IDNO:14的163-199位置的氨基酸殘基的至少一部分；和Z3可以是氨基酸序列，其包括SEQID NO:13的121到220位置的氨基酸殘基的至少一部分。在這個實施方式中，當P是I時，Zl可以氨基酸序列，其包括SEQ ID NO:14的90到98位置的氨基酸殘基的至少一部分。
[0039]在進一步的實施方式中，Y可以是SEQ ID NO:14的99-162位置的氨基酸殘基的C-端側的20個連續氨基酸殘基或更多個、30個連續氨基酸殘基或更多個、40個連續氨基酸殘基或更多個、50個連續氨基酸殘基或更多個、或60個連續氨基酸殘基或更多個。Z2可以是SEQ ID NO: 14的163到170位置的氨基酸殘基，Z3可以包括SEQ ID NO:11的124-223、SEQ ID NO:12 的 120-219、SEQ ID NO:24 的 171-270 或 SEQ ID NO: 13 的 121-220 位置的氨基酸殘基的C-端側的71-100個連續氨基酸殘基。Z2和Z3的氨基酸殘基總數可以是108。
[0040]在一個實施方式中，多肽可以由選自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID N0:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:26 和 SEQ IDNO:27 的核苷酸序列編碼。多肽是選自 SEQ ID NO:18, SEQ ID NO: 19、SEQ ID NO: 20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:28 和 SEQ ID NO:29 的氨基酸序列。
[0041]在一個實施方式中，多肽在它的N-端與生物活性分子融合，與所述生物活性分子的天然形式(native form)的循環半衰期比較,該生物活性分子顯示增加的循環半衰期。該生物活性分子可以是多肽、蛋白質或非肽(apeptide)。該生物活性分子可以是多肽、肽或蛋白質藥物。生物活性分子可以是可溶性蛋白質，例如但不限于:激素、細胞因子、生長因子、共刺激分子、激素受體、細胞因子受體、生長因子受體或短肽。該生物活性分子可以是EPO或它的變體/片段、p40或它的變體/片段(例如，含有Asn303Gln置換的p40變體)、G-CSF 或它的變體 / 片段、TNF 受體、GM-CSF、IL-U IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-10、IL-1O 受體、TGF-β 'TGF-β 受體、IL-17、IL-17 受體、因子 VI1、CXCL_11、FSH、人生長激素、骨形態生成蛋白-1 (bone morphogenetic protein-1, BMP-1)、CTLA4、Η)_1、GLP-1> β 動物纖維素(betacellulin)、OPG、RNAK、α 干擾素(interferon-alpha)、β 干擾素(interferon-beta)或它們的變體/片段。該生物活性分子可以是分泌性蛋白，其可以是成熟的形式。
[0042]在一個實施方式中，提供產生根據權利要求1的多肽的方法，其中該方法包括以下步驟:(i)將編碼所述多肽的DNA分子引入哺乳動物宿主細胞，(ii)將細胞在其培養基中在所述多肽可以被表達的條件下生長；和(iii)收獲表達的多肽。哺乳動物宿主細胞可以是CHO、COS或BHK細胞。
[0043]在另一個實施方式中，提供以下方法:(i)減少自身免疫性疾病的癥狀、預防或治療自身免疫性疾病，(?)抑制移植排斥，或(iii)治療或預防內毒素誘導的休克，其包括施用治療有效量的以上所述多肽，其中該多肽融合到生物活性分子。
[0044]在一個實施方式中，提供分離的核酸分子，其編碼根據本發明的實施方式的多肽。多肽可以具有選自以下的氨基酸序列:SEQ IDNO:18,SEQ ID NO: 19,SEQ ID NO:20、SEQ IDNO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:28 和 SEQ ID NO:29。核酸分子可以具有以下序列中顯示的核苷酸序列:SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:
4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:26 或 SEQ ID NO:27。核酸分子可以進一步地包括信號序列 或前導序列。
[0045]根據本發明的實施方式，提供包括所述核酸分子的表達載體和含有所述載體的宿主細胞。表達載體的例子包括但不限于pADllEP0-hFc-l、pADllG-CSF-hFc-l、pADllp40N303Q-hFc-l、pADllEPO-hFc-6、pADllG-CSF-hFc-6、pADllp40N303Q-hFc_6、pADllEP0-hFc-5、pADllG-CSF-hFc-5、pADllp40N303Q-hFc_5 和 pADllTNFR-hFc-5。
[0046]在一個實施方式中，提供向哺乳動物遞送生物活性分子的方法，其包括向需要其的哺乳動物施用核酸分子的步驟。
[0047]在另一個實施方式中，多肽包括在N-端到C-端方向由鉸鏈區、CH2結構域和CH3結構域組成的Fe結構域，其中所述鉸鏈區包括人IgD鉸鏈區或人IgGl鉸鏈區的氨基酸殘基的至少一部分；所述CH2結構域包括人IgG4CH2結構域的氨基酸殘基的至少一部分，其中在人IgG4CH2結構域的N-端的4-37個連續氨基酸殘基用人IgG2CH2結構域的N-端部分或人IgD CH2結構域的N-端部分的氨基酸殘基的至少一部分置換，和所述CH3結構域包括人IgG4CH3結構域的氨基酸殘基的至少一部分。
[0048]鉸鏈區可以包括人IgGl的鉸鏈區的氨基酸殘基的至少一部分，所述CH2結構域包括人IgG4CH2結構域的氨基酸殘基的至少一部分，其中在人IgG4CH2結構域的N-端的4_37個連續氨基酸殘基用人IgG2CH2結構域的N-端區的氨基酸殘基的至少一部分置換。
[0049]鉸鏈區可以包括人IgD的鉸鏈區的氨基酸殘基的至少一部分，所述CH2結構域包括人IgG4CH2結構域的氨基酸殘基的至少一部分，其中在人IgG4CH2結構域的N-端的4_37個連續氨基酸殘基用人IgG2CH2結構域的N-端區的氨基酸殘基的至少一部分置換。
[0050]多肽可以進一步包括CHl結構域，其中所述CHl結構域包括人IgGlCHl結構域的氨基酸殘基的至少一部分，并且其中所述CHl結構域偶聯到所述鉸鏈區的N-端。多肽可以進一步包括CHl結構域，其中所述CHl結構域包括人IgDCHl結構域氨基酸殘基的至少一部分，并且其中所述CHl結構域偶聯到所述鉸鏈區的N-端。多肽可以進一步包括偶聯到所述鉸鏈區的N-端的第二多肽，其中該第二多肽是生物活性的非免疫球蛋白多肽。多肽可以進一步包括通過連接體偶聯到所述CHl結構域的N-端或偶聯到所述CH4結構域C-端的生物活性分子，其中所述生物活性分子不是免疫球蛋白多肽。多肽和生物活性分子可以經連接體彼此連接。連接體分子是白蛋白連接體或合成的連接體。該白蛋白連接體包括SEQ IDNO:25 的 321 到 323,318 到 325,316 到 328,313 到 330,311 到 333 或 306 到 338 的氨基酸序列。該合成連接體可以是由Gly和Ser殘基組成的10到20個氨基酸殘基的肽。在一個實施方式中，這種 Gly-Ser 連接體是 GGGGSGGGGSGGGSG (SEQ ID NO:32)。
[0051]本發明也包括含有重組的Fe區的抗體分子，該重組的Fe區如上所述。
[0052]附圖簡述
[0053]圖1顯示雜交Fcs (hybrid Fcs,hFcs)的示意圖，其可以用作以“X”表示的生物活性分子的載體蛋白。
[0054]圖2 顯示 hFcs 的圖示，其中對源于 IgGl(SEQ ID NO:11)、IgG2 (SEQ ID:12)、IgG4(SEQ ID:13)和IgD(SEQ ID:14)的氨基酸位置進行詳細描述。除非另有說明，本申請全部多肽中氨基酸位置的命名采用相同規則。
[0055]圖3顯示hFcs圖示，其中通過以“AL”表示的白蛋白連接體，在C-端每個hFc偶聯到以“X”表示的生物活性分子。
[0056]圖4顯示與連接體偶聯的hFcs的圖示，其中對源于人白蛋白(SEQ ID NO:25)的白蛋白連接體的氨基酸位置進行詳細描述。
[0057]圖5顯示hFc-6的疏水性分布(hydrophobicity plot)的結果。
[0058]圖6 (a)顯示使用特異性 ELISA 分析的MabThera? (Rituximab)、hlgGl、I;nbrel?(etanercept)、EP0-hFc-5、G-CSF-hFc-5、p40N303Q-hFc_5 的 Fe y RI 結合活性結果；圖 6 (b)顯不使用特異性 ELISA 分析的MabThera? (Rituximab)、hlgGl、Enbrel? (etanercept)、EP0-hFc-5、G-CSF-hFc-5、p40N303Q-hFc-5 的 Clq 結合活性結果。
[0059]圖7 (a)顯示在人F36E細胞系中與EPO生物活性相比較的EPO-1gGlFc、EPO-hFc-1、EP0-hFc-5、EP0-hFc-6 和 Aranesp? (derbepoetin alfa)的生物活性結果；圖7(b)顯示在小鼠造血細胞系(NFS-6O)中 Neu丨asla? (pegfilgrastim)和 G-CSF-hFc-5 的體外生物活性結果；圖7(c)顯示在人PBMCs中p40和p40N303Q-hFc_5的體外生物活性結果；圖7 (d)顯示在鼠科L929細胞中Enbrel? (etanercept)和TNFR-hFc-5的體外生物活性結果；和圖 7(e)顯示在人 WISH 細胞中 thFc-l-AL(O)-1FN-β 和 thFc-1-AL(3)-1FN-β的體外生物活性結果。
[0060]圖8(a)顯示經SC途徑(左圖)和IV途徑(右圖)向獼猴施用的Aranesp?(derbepoetin alfa)、EPO-hFc-l或EP0_hFc_5的體內半衰期的結果；圖8(b)顯示經皮下注射途徑(左圖)和靜脈注射途徑(右圖)向Sprague Dawley大鼠施用的LEUCOSTIM?(非格司亭)和G-CSF-hFc-Ι的藥物動力學的結果；圖8(c)顯示經皮下注射途徑向獼猴施用的Enbrel? (etanercept)的藥物動力學的結果；圖8((1)顯示經皮下注射途徑向SpragueDawley大鼠施用的TNFR-hFc-5和Enbrel? (etanercept)的藥物動力學的結果。[0061]圖9(a)顯示經皮下注射途徑(左上圖)和靜脈注射途徑(右下圖)向獼猴施用的Aranesp? (derbepoetin alfa)和EP0_hFc_5的體內生物活性的結果，圖9 (b)顯不經皮下
注射途徑(上圖)和靜脈注射途徑(下圖)向Sprague Dawley大鼠施用的LKU(X)STlMfe(非格司亭)和G-CSF-hFc-Ι的體內生物活性的結果。
[0062]實現本發明的最佳方式
[0063]本發明提供雜交人免疫球蛋白Fe片段，其從N-端到C-端包括鉸鏈區、CH2結構域和CH3結構域，其中該鉸鏈區是人IgD鉸鏈區或人IgGl鉸鏈區的至少部分氨基酸序列；CH2結構域是人IgG4CH2結構域，在CH2結構域的N-端區一部分被人IgG2CH2或人IgD CH2結構域的N-端區的4-37氨基酸殘基替代。當被連接到生物活性分子，例如生物活性多肽的生物活性分子，用于產生Fe融合蛋白時，這種雜交Fe片段使Fe融合蛋白的非特異免疫反應最小化，延長生物活性多肽的生物活性分子的血清半衰期，并使生物活性多肽的生物活性分子的活性最優化。
[0064]根據本發明的一種實施方式中的Fe融合蛋白中，設計IgD CH2結構域的N-端與IgG4CH2結構域的剩余部分的組合，使得在兩個不同Ig亞基重組處產生的融合蛋白的區域是疏水性的。產生的融合蛋白的疏水區應位于折疊蛋白內部，其最小化不期望的非特異免疫反應。
[0065]如本文所用，術語“Fe片段”或“Fe”是指蛋白質，其含有免疫球蛋白的重鏈恒定區I (CHl)、重鏈恒定區2 (CH2)和重鏈恒定區3 (CH3)，并且不含有所述免疫球蛋白的重鏈和輕鏈的可變區以及輕鏈恒定區I (CLl)。它可以進一步地包括在重鏈恒定區的鉸鏈區。雜交Fe或雜交Fe片段在本文有時稱為“hFc”。
[0066]另外，本發明的Fe片段可以是以具有天然糖鏈、與天然糖鏈相比增加的糖鏈、與天然糖鏈相比減少的糖鏈的形式，或者可以是以去糖基化的形式。通過本領域常見方法，例如化學方法、酶學方法和使用微生物的基因工程方法，可以獲得免疫球蛋白Fe糖鏈的增加、減少或去除。從Fe片段去除糖鏈引起與第一補體成分Cl的Clq部分的結合親和力的銳減以及抗體依賴性細胞介導的細胞毒作用(ADCC)或補體依賴性細胞毒作用(CDC)的減少或喪失，因此不會誘導不必要的體內免疫反應。就這點而言，在一些情況下，去糖基化或非糖基化(aglycosylated)形式的免疫球蛋白Fe片段作為藥物載體可能更適合于本發明的目標。
[0067]如本文所用，術語“去糖基化”是指糖部分從Fe片段通過酶進行去除，和術語“非糖基化”(aglycosylation)意思是通過原核生物、優選地大腸桿菌產生未糖基化形式的Fe片段。
[0068]如本文所用，術語“雜交(雜合)”是指編碼不同來源的兩種或更多種免疫球蛋白Fe片段的序列是以單鏈免疫球蛋白Fe片段出現。
[0069]在一個實施方式中，雜交人Fe在N-端到C-端方向上包括鉸鏈區、CH2結構域和CH3結構域，其中該鉸鏈區是人IgD鉸鏈區或人IgGl鉸鏈區的至少部分氨基酸序列；以及CH2結構域是人IgG4CH2結構域，其在N-端區的一部分被人IgG2CH2或人IgD CH2結構域的N-端區的4-37個氨基酸殘基替代。該雜交人Fe可以經過共價鍵在它的N-端連接到生物活性分子的C-端。
[0070]在另一個 實施方式中，生物活性分子-雜交Fe融合多肽可以用下式表示:[0071]N' -X-(Zl)p-Y-Z2-Z3-Z4-C/，或
[0072]N' - (Zl)p-Y-Z2-Z3-Z4-(連接體 h-X-C'
[0073]其中N'是多肽的N-端和C'是多肽的C-端；Zl表示氨基酸序列，其包括SEQ IDNO:11的90到98位置的氨基酸殘基的至少C-端部分，或SEQ ID NO: 14的90-98位置的氨基酸殘基的至少一部分，表示氨基酸序列，其包括SEQ ID NO: 11的99到113位置的氨基酸殘基的至少C-端部分，或SEQ ID NO:14的99到162位置的氨基酸殘基的至少一部分；Z2表示氨基酸序列，其包括SEQ ID NO: 12的111到147位置的氨基酸殘基的至少N-端部分，或SEQ ID NO:14的163到199位置的氨基酸殘基的至少N-端部分；Z3表示氨基酸序列，其包括 SEQ ID NO:11 的 118-223、SEQ ID NO:12 的 114_219、SEQ ID NO:24 的 165-270或SEQ ID NO:13的115到220位置的氨基酸殘基的至少C-端部分；Z4表示氨基酸序列，其包括SEQ IDNO:13的221-327位置的氨基酸殘基的至少N-端部分，并且P和q每個均是O或I的整數，其中Z2和Z3的氨基酸殘基總數可以是80和140之間，兩端數值包括在內，連接體是連接體分子，以及X是感興趣的生物活性分子。
[0074]在一個實施方式中，Z3-Z4是選自以下的氨基酸序列:(i)由SEQ ID NO:11的118到223位置的氨基酸殘基的C-端部分和SEQ ID NO:11的224到330位置的氨基酸殘基的N-端部分組成的連續氨基酸序列，(ii)由SEQ ID NO:12的114到219位置的氨基酸殘基的C-端部分和SEQ ID NO:12的220到326位置的氨基酸殘基的N-端部分組成的連續氨基酸序列，(iii)由SEQ ID NO:24的165到270位置的氨基酸殘基的C-端部分和SEQ IDNO:24的271到377位置的氨基酸殘基的N-端部分組成的連續氨基酸序列，和(iv)由SEQID NO: 13的115到220位置的氨基酸殘基的C-端部分和SEQ ID NO: 13的221到327位置的氨基酸殘基的N-端部分組成的連續氨基酸序列。
[0075]根據本發明的一種實施方式，所述多肽的氨基酸殘基總數是從154到288。
[0076]當施用到目標者時，與單獨的X相比較，式N' -X-(Zl) p-Y-Z2-Z3-Z4-C/和N' -(Zl)p-Y-Z2-Z3-Z4-(連接體),-X-C'的多肽增加了生物活性分子X的循環半衰期。
[0077]連接體可以源于人白蛋白(CAA00606SEQ ID NO:25)。該連接體可以包括SEQ IDNO:25 的 321 到 323,318 到 325,316 到 328,313 到 330,311 到 333 或 306 到 338 位的氨基酸序列。可選地，連接體可以是合成的連接體。該合成連接體可以是由總共10-20個Gly和Ser氨基酸殘基組成的肽。在一個實施方式中，該Gly-Ser連接體是GGGGSGGGGSGGGSG (SEQID NO:32)。
[0078]Zl 可以包括人 IgGl (SEQ ID NO: 11)或 IgD (SEQ ID NO:14)的 CHl 結構域的至少一部分。Zl可以包括IgGlCHl結構域的C-端區(SEQ ID NO:11的90-98的位置)或IgDCHl結構域的C-端區(SEQ ID NO:14的90-98的位置)的5到9或7到9個連續氨基酸殘基。在一些實施方式中，Zl可以是IgGlCHl結構域或IgD CHl結構域的5、6、7、8或9個
C-端氨基酸殘基。
[0079]在一些實施方式中，Zl是氨基酸序列，其包括SEQ ID NO:11的90至98位置的氨基酸殘基或SEQ ID NO: 14的90至98位置的氨基酸殘基。Zl可以是由SEQ ID NO:11的90至98的位置或SEQ ID NO: 14的90-98的位置的5到9個氨基酸殘基組成的氨基酸序列。Zl也可以是由SEQ ID NO:` 11的90到98氨基酸殘基或SEQ ID NO:14的90到98的
氨基酸殘基組成的氨基酸序列。[0080]Y可以包括人IgGl或IgD的鉸鏈區的至少一部分。Y可以包括IgGl鉸鏈區(SEQID NO: 11的99到113位置的氨基酸)或IgD的鉸鏈區(SEQ ID NO:14的99到162位置的氨基酸)的C-端的5個或更多個、或10個或更多個的連續氨基酸殘基。在某些實施方式中，Y可以是氨基酸序列，其包括SEQ ID NO: 11的99到113位置的氨基酸殘基、SEQ IDNO:14的158到162位置的氨基酸殘基、SEQ ID NO:14的153到162位置的氨基酸殘基、SEQ IDNO:14的143到162位置的氨基酸殘基、SEQ ID NO:14的133到162位置的氨基酸殘基或SEQ ID NO:14的99到162位置的氨基酸殘基。
[0081]Z2可以包括人IgG2CH2結構域的N-端(SEQ ID NO: 12的111到147位置的氨基酸殘基)或IgD CH2結構域的N-端(SEQ ID NO:14的163到199位置的氨基酸殘基)的4到37、6到30、6到12、6到8、8或6個連續氨基酸殘基。在某些實施方式中，Z2可以是人IgG2CH2結構域的6個N-端氨基酸殘基(SEQ ID NO:12的111-116位置的氨基酸殘基)或人IgD CH2結構域的8個N-端氨基酸殘基(SEQ ID NO:14的163-170位置的氨基酸殘基)。
[0082]Z2和Z3的氨基酸殘基總數可以是90和120之間，兩端數值包括在內；或105和115之間，兩端數值包括在內。
[0083]Z4可以是氨基酸序列，其包括IgG4CH3結構域(在SEQ ID NO:11的224_330、SEQID NO:12 的 220-326、SEQ ID NO:24 的 271-377 或 SEQ ID NO:13 的 221 到 327 位置的氨基酸殘基)的90或更多個、或100或更多個連續氨基酸殘基。Z4可以是大于人IgGl、IgG2、IgG3或IgG4CH3結構域的98 %或95 %的氨基酸殘基。在一個示例性實施方式中，TA是包括人IgG CH3結構域全部氨基酸序列的氨基酸序列。例如，Z4是人IgG4CH3結構域的氨基酸序列，對應于人IgG4的氨基酸殘基341-447，如根據EU Index, Kabat編號(其對應于SEQID NO:13的221-327位置的氨基酸殘基)。
[0084]在一個實施方式中`，Y可以是氨基酸序列，其包括人IgGl鉸鏈區的C-端氨基酸殘基(SEQ ID NO: 11的99到113位置)的至少一部分，p可以是I或O ;Z2可以是氨基酸序列，其包括人IgG2CH2的N-端區(氨基酸殘基在SEQ ID NO:12的111-147位置)的至少一部分；和Z3可以是氨基酸序列，其包括人IgG亞類任意一個的C-端區(氨基酸殘基在SEQ ID NO:11 的 118-223,SEQ ID NO:12 的 114-219,SEQ ID NO:24 的 165-270 或SEQ IDNO:13的115到220位置)的至少一部分。在該實施方式中，當P是I時，Zl可以是包括人IgGlCHl結構域的C-端區(SEQ ID NO: 11的90到98位置的氨基酸殘基)的至少一部分的氨基酸序列。例如，Zl可以是SEQ ID NO: 11的90到98位的氨基酸殘基。
[0085]在進一步的實施方式中，Z3可以是人IgG4CH2結構域(在SEQ ID N0:13的
115-220 位置)、人 IgGlCH2 結構域(在 SEQ ID NO:11 的 118-223 位置)、人 IgG2CH2 結構域(在 SEQ ID N0:12 的 114-219 位置)、人 IgG3CH2 結構域(在 SEQ ID NO:24 的 165-270位置)的C-端區的73到106個連續氨基酸殘基，并且Z2和Z3的氨基酸殘基總數可以是110。例如，Z2可以是在SEQ ID NO:12的111-116位置的氨基酸殘基的氨基酸序列，以及Z3可以是在SEQ ID NO: 13的117到220位置的氨基酸殘基的氨基酸序列。
[0086]在另一個實施方式中，Y可以是包括人IgD鉸鏈區的C-端區(SEQ ID NO:14的99到162位置的氨基酸殘基)的至少一部分的氨基酸序列，P可以是I或0(零)；Z2可以是包括人IgD CH2結構域的N-端區(SEQ ID NO:14的163到199位置的氨基酸殘基)的至少一部分的氨基酸序列，和Z3可以是包括人IgG4CH2結構域的C-端區(SEQ ID NO:13的121到220位置的氨基酸殘基)的至少一部分的氨基酸序列。例如，Y可以是在SEQ IDNO:14的158到162、133到162、或99到162位置的氨基酸殘基，Z2可以是在SEQ ID NO:14的163到170位置的氨基酸殘基和Z3可以是在SEQ ID NO:13的121-220位置的氨基
酸殘基。
[0087]在這個實施方式中，當P是I時，Zl可以是包括人IgD CHl結構域的C端區(氨基酸殘基在SEQ ID NO:14的90到98位置)的氨基酸序列。例如，Zl可以是SEQ ID NO:14的90到98位的氨基酸殘基。
[0088]在這個實施方式中，Y可以是人IgD鉸鏈區的C-端側(氨基酸殘基在SEQ ID NO:14的99-162位置)的20個連續氨基酸殘基或更多個、30個連續氨基酸殘基或更多個、40個連續氨基酸殘基或更多個、50個連續氨基酸殘基或更多個、或60個連續氨基酸殘基或更多個。Z3可以包括SEQ ID NO:13的121-220位置的氨基酸殘基C-端側的71到100個連續氨基酸殘基。Z2和Z3的氨基酸殘基總數可以是108。
[0089]表1顯示在構建根據本發明的實施方式的hFcs中有用的人IgGl、IgG2、IgG3和IgD片段的氨基酸序列。
[0091]表 I
【權利要求】
1.由下式表示的多肽:
N' -(Zl)p-Y-Z2-Z3-Z4-C/ 其中N'是所述多肽的N-端和C'是所述多肽的C-端； Zl是氨基酸序列，其由在(i)SEQ ID N0:11或(ii)SEQ ID NO: 14的90到98位置的氨基酸殘基組成； Y是氨基酸序列，其由從在SEQ ID NO:14的99到162位置的氨基酸殘基的C-端的5個或更多個連續氨基酸殘基組成； Z2是氨基酸序列，其由從在SEQ ID NO:14的163到199位置的氨基酸殘基的N-端的4個或更多個連續氨基酸殘基組成； Z3是氨基酸序列，其由從在SEQ ID NO: 13的115到220位置的氨基酸殘基的C-端的71個或更多個連續氨基酸殘基組成； Z4是氨基酸序列，其由在SEQ ID NO:13的221到327位置的氨基酸殘基組成；以及 P是O或I的整數。
2.根據前述權利要求1所述的多肽，其中P是O。
3.嵌合多肽，其由權利要求1或2所述的多肽和生物活性多肽組成，其中所述生物活性多肽被融合到所述的多肽的N-端或C-端，并且其中所述生物活性多肽顯示與所述生物活性多肽的天然形式的循環半衰期相比增加的循環半衰期，并且所述生物活性多肽是EPO、G-CSF、TNF 受體或 p40。
4.根據權利要求3所述的嵌合多肽，其中所述生物活性多肽是p40變體，所述p40變體包含Asn303Gln置換。
5.根據權利要求3所述的嵌合多肽，其中: (a)所述生物活性多肽是分泌性蛋白，分泌性蛋白的成熟形式、或抗體的Fab區；和/或 (b)所述多肽和所述生物活性多肽經由連接體例如白蛋白連接體或合成的連接體彼此偶聯。
6.根據權利要求5所述的嵌合多肽，其中: (a)所述白蛋白連接體由SEQID NO:25的321至323、318至325、316至328、313至330,311至333或306至338的氨基酸序列組成；或 (b)所述合成的連接體是由SEQID NO:32所示的肽。
7.編碼前述權利要求1-6任意一項多肽的核酸分子。
8.包括根據權利要求7所述核酸分子的表達載體。
9.產生根據權利要求1-6任意一項所述的多肽的方法，其中所述方法包括下列步驟:(i)將權利要求11的核酸分子引入哺乳動物宿主細胞，(?)將所述細胞在其生長培養基中在所述多肽可以被表達的條件下生長；以及(iii)收獲所表達的多肽。
10.根據權利要求3所述的嵌合多肽在制備用于增加所述生物活性多肽的循環半衰期的藥物中的用途。
11.根據權利要求10所述的用途，其中所述嵌合多肽經靜脈內、皮下、經口、經頰、舌下、經鼻、腸胃外、直腸、陰道或經由肺部途徑施用。
【文檔編號】C12N15/85GK103641919SQ201310554079
【公開日】2014年3月19日 申請日期:2008年5月30日 優先權日:2007年5月30日
【發明者】成永喆, 梁世煥 申請人:浦項工科大學校產學協力團, 格納西尼有限公司