一株降解afb1的枯草芽孢桿菌的制作方法
【專利摘要】本發明涉及一株降解AFB1的泰山枯草芽孢桿菌；于2013年9月13日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號CGMCC?No?8186,其16srDNA如SEQ.NO.1所示。經實驗證明，將其發酵液與發霉飼料于37℃下共同作用72h，發酵液產生的活性物質能降解發霉飼料中的AFB1，且效率高，作用效果溫和，安全性高，不影響原有品質，而且具有操作簡單、成本低等優點，適合在飼料方面規模應用。
【專利說明】—株降解AFB1的枯草芽孢桿菌
(-)發明領域
[0001]本發明涉及從一株降解AFBl的枯草芽孢桿菌。
(二)發明背景
[0002]黃曲霉毒素(Aflatoxius, AF)是由黃曲霉(Aspergillus flavus)、寄生曲霉(Aspergillums nomius)、特異曲霉(A.nomius)、假溜曲霉(A.pseudotamarii)等幾種真菌產生的次生代謝產物，對人類和畜禽的健康危害很大。1960年6月，在英國倫敦郊區的10萬只火雞突然發病死亡，追究原因是從巴西進口的花生柏被一種來自真菌的有毒物質污染。剖檢后發現肝臟出血，腎臟腫脹，因病因不明，被定為火雞χ病。后經過研究發現，火雞的死亡原因由飼料中分離出的黃曲霉所產生的熒光物質造成的，將此物質命名為黃曲霉毒素，該結果引起了全世界的關注。后來經過許多學者的研究證明，黃曲霉毒素不但可以引起中毒，長期食用被其污染的食品還可引發癌癥，具有很強的毒性、致癌性、致突變性和致畸性，它可通過食物和飼料直接危害人類和動物的健康.[0003]黃曲霉素B1 (AFBl)廣泛存在于飼料原料中如玉米、高粱、花生粉、豆柏、棉籽柏等。到目前為止，黃曲霉毒素仍是對畜牧業威脅最大的霉菌毒素之一。各種動物對黃曲霉毒素均具有很高的敏感性。Madden等(1999年)報道，日糧中含0.2mg / kg黃曲霉毒素即可引起家禽采食量和增重降低，降低程度與黃曲霉毒素濃度有關。Prasad (2002年)研究了AFBl對家禽的影響發現，單一劑量AFBl的平均半數致死量(LD50) (mg / kg體重)雞6.5~16.5、鴨0.34，鴨比雞更敏感，尤其是雛鴨。對于生長禽日糧中的AFBl的安全值，一般認為不應超過20ug / kg。研究還發現，通過食物鏈進入人體的黃曲霉毒素具有極強的致癌作用，嚴重威脅人類健康，因此，解決谷物糧食和動物飼料的黃曲霉毒素污染是一個世界性難題。
[0004]傳統的黃曲霉毒素去毒方法有物理和化學方法，包括氨化法、堿法、高溫法、氧化法、吸附劑法，這些方法存在 效果不穩定、營養成分損失較大以及難以規模化生產等缺點；因此，黃曲霉毒素污染的控制急切需要一種高效率、特異性強以及對飼料和環境沒有污染的技術。黃曲霉毒素生物降解，是指黃曲霉毒素分子的毒性基團被微生物產生的次級代謝產物或者所分的胞內、胞外酶分解破壞，同時產生無毒的降解產物的過程。毒素生物降解是一種化學反應的過程，不是對毒素的物理性吸附作用。利用微生物或其代謝產物進行解毒具備以上優勢，代表了生物解毒的新方向，且生物酶催化方法具有專一性強、轉化效率高的特點備受研究者的關注。
(三)
【發明內容】

[0005]為了解決上述問題，本發明從泰山土壤中分離得到一株降解AFBl的泰山枯草芽孢桿菌；經實驗證明，泰山枯草芽孢桿菌發酵液及其產生的活性物質降解AFBl的效率高，作用效果溫和，安全性高，不影響原有品質，適合在食品及飼料方面規模應用。
[0006]一株泰山枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis),于2013年9月13日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏地址:北京市朝陽區北辰西路I號院3號中國科學院微生物研究所，郵編:100101 ;保藏號CGMCC No8186,其16srDNA如SEQ.N0.1所
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[0007]所述泰山枯草芽孢桿菌形態如下:
[0008]菌落形狀不規則，有皺褶，邊緣波紋狀，灰白色，革蘭氏染色陽性，MR-VP試驗陽性，淀粉水解陽性。
[0009]挑取泰山枯草芽孢桿菌于50ml BPY液體培養基(牛肉提取物5g、蛋白胨10g、氯化鈉5g、葡萄糖5g、酵母浸粉5g和蒸餾水lL，pH=7.0)培養8h后，以6%接種量將此菌液接種于100mlBPY液體培養基中，在37°C、180r/min條件下搖瓶培養24h制得枯草芽孢桿菌發酵液，將其與發霉飼料于37°C下共同作用72h，發酵液產生的活性物質能降解發霉飼料中的AFB I。
[0010]本發明的有益效果主要體現在:
[0011]本研究從泰山土壤中分離了一株枯草芽孢桿菌，將其發酵液與發霉飼料于37°C下共同作用72h，發酵液產生的活性物質能降解發霉飼料中的AFB1，且效率高，作用效果溫和，安全性高，不影響原有品質，而且具有操作簡單、成本低等優點，適合在飼料方面規模應用。
[0012](五)發明附圖
[0013]圖1泰山枯草芽孢桿菌發酵液不同組分對AFBl的降解率。由圖可知，泰山枯草芽孢桿菌對黃曲霉毒素降解的活性物質是一種胞外分泌物，主要存在于其發酵后的上清液中。
[0014]圖2泰山枯草芽孢桿菌發酵后`的上清液熱處理和蛋白酶K處理后對AFBl的降解率。由圖可知，泰山枯草芽孢桿菌對黃曲霉毒素的降解活性物質是發酵上清液中的一種酶.[0015]圖3經泰山枯草芽孢桿菌發酵液處理前后霉變飼料中AFBl含量圖。
[0016]由圖可知，經泰山枯草芽孢桿菌發酵液處理后霉變飼料中AFBl含量由63.5ug/kg降為8.2ug/kg，降解率達到87.1%。說明泰山枯草芽孢桿菌發酵液在實際生產中能高效率的降解霉變飼料中的AFBI。
(六)【具體實施方式】
[0017]實施例1.泰山枯草芽孢桿菌的分離
[0018]采集含淀粉豐富的泰山土壤，80°C的水浴處理I小時，利用稀釋涂布法在含淀粉的平板培養基(牛肉膏5.0g、蛋白胨10.0g、氯化鈉5.0g、可溶性淀粉5.0g、瓊脂20g和蒸餾水1000ml pH=7.2)上培養1_3天后觀察。然后進行初篩與純化，利用顯微鏡進行革蘭氏染色鑒定，確定是否為枯草芽孢桿菌。再復篩，測定其淀粉酶活性，最后確定菌株。
[0019]實驗流程:倒平板_制備梯度稀釋液_涂布_培養_初篩_復篩_純化_保存
[0020]( I)制備土壤稀釋液
[0021]取泰山天外村花壇附近土樣,去除表層5cm,取5_15cm處。用無菌器具采樣100g,裝入無菌塑料袋中扎好，記錄采樣時間地點。將土樣與無菌水充分混合，振搖20min,80°C水浴I小時后取出。無菌吸取Iml 土壤懸液加入盛有9ml無菌水的試管中，充分混勻,制成?ο-1稀釋度的土壤溶液；以此類推，利用上述方法再分別制成10_2、10_3、10_4、10_5不同稀釋度的土壤溶液。
[0022](2)涂布
[0023]無菌吸取10_3、10_4、10_5三個梯度土壤液各0.2ml滴在所述的含淀粉的平板培養基中央。用無菌涂布器涂布。
[0024](3)培養
[0025]將淀粉培養基平板倒置于30度培養箱中培養1-3天。
[0026](4)初篩
[0027]觀察菌落形態，與標準菌株比對，去除非目的菌株；進行革蘭氏染色，顯微鏡下觀察；進行淀粉酶、MR-VP生化試驗，最終得到9株菌株。
[0028](5)復篩
[0029]分別挑取初篩出的9株菌株(分別編號為:泰山001、泰山002、泰山003、泰山004、泰山005、泰山006、泰山007、泰山008和泰山009)的單菌落于50ml BPY液體培養基(牛肉提取物5g、蛋白胨10g、氯化鈉5g、葡萄糖5g、酵母浸粉5g和蒸餾水lL，pH=7.0)培養8h后，將此菌液以6%接種量接種于100mlBPY液體培養基中，在37°C、180r/min條件下振蕩培養2處后，取80(^1發酵液，加入200 μ I黃曲霉毒素BI (500 μ g/kg)，在37°C黑暗的培養箱中反應72h，以上為處理組；以等量的BPY液體培養基加黃曲霉毒素BI為對照組。采用高效液相色譜HPLC法測定黃曲霉毒素含量。
[0030]黃曲霉毒素 含量測定可分為3個步驟:萃取、凈化、檢測。首先使用甲醇:水(V:V=6:4)溶液對黃曲霉毒素AFBl進行萃取，然后使用免疫親和柱對樣品殘留毒素進行凈化提取(方法參照免疫親和柱使用說明書)；最后用HPLC(柱后光化學衍生)對凈化提取得到的樣品進行檢測。
[0031]HPLC檢測條件為流動相甲醇:水=47:53 ；流速lml/min ;色譜柱C18250mmX4.6mm,0.5ym ;激發波長 365nm，檢測波長 440nm ;進樣量 20ul。
[0032]AFBl降解率(%)=([(對照組AFBl含量-處理組AFBl含量)/對照組AFBl含fi] XlOOo
[0033]結果發現四株菌株對黃曲霉毒素BI (AFBl)具有降解能力，其中一株編號為泰山006的降解能力最強，達到90.12%，將其命名為泰山枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)；于2013年9月13日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號CGMCCNo 8186。
[0034]實施例2.泰山枯草芽孢桿菌的鑒定
[0035](I)泰山枯草芽孢桿菌在BPY瓊脂平板(牛肉提取物5g、蛋白胨10g、氯化鈉5g、葡萄糖5g、酵母浸粉5g、，瓊脂15g和蒸餾水lL，pH=7.0)上，37°C培養48h后，經光學顯微鏡觀察其形狀結構。
[0036](2) 16S rDNA序列的PCR擴增弓丨物設計
[0037]Eubac27F:AGA GTT TGA TCC TGC CTC AG;
[0038]Eubac1492R:GGA TAC CTT GTT ACG ACT T
[0039](3)PCR 反應體系:10XPCR 緩沖液(含 20mmol/L 的 Mg2+) 5 μ 1，20umol/L dNTP4 μ I, 0.10D/ml 引物各 I μ 1，5u/ μ I Taq 酶 I μ I, ddH2033 μ I,總 DNA 模板 50 μ I。
[0040]反應條件:94°C變性 5min;94°C 變性 Imin, 48.2°C 退火 lmin, 72°C 延伸 2min, 35 個循環；72°C延伸lOmin。反應結束后，取5ul PCR產物于1%瓊脂凝膠中電泳，PCR產物經回收純化后連入PGM2T載體，轉化大腸桿菌DH5 α細胞。選擇轉化的陽性克隆提取質粒，由上海生物工程公司完成測序,通過NCBI數據庫搜索證明其與枯草芽孢桿菌同源性達到99.8%，結合其形態和生理生化特征指標，將其鑒定為枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)，命名為泰山枯草芽孢桿菌。
[0041]實施例3.泰山枯草芽孢桿菌降解黃曲霉毒素活性組分的確定[0042]挑取泰山枯草芽孢桿菌于50ml BPY液體培養基培養8h后，以6%接種量將此菌液接種于100mlBPY液體培養基中，在37°C、180r/min條件下搖瓶培養24h制得枯草芽孢桿菌發酵液。取5ml發酵液，4°C離心20min (8000r/min)，分離上清液與菌體，上清液于4°C備用；離心后的菌體用蒸餾水洗滌，再離心，取菌體加入5ml蒸餾水制得菌懸液備用；再取5ml發酵液，4°C離心20min(8000r/min)，分離上清液與菌體，取菌體加入5ml蒸餾水，進行細胞超聲波破碎后冷凍離心，將離心后的上清液用0.22 μ m大小孔徑的過濾膜抽濾，制得胞內液備用。分別取800 μ I枯草芽孢桿菌上清液、菌懸液、胞內液，各加入200 μ I黃曲霉毒素BI (500 μ g/kg)，在37°C黑暗的培養箱中反應72h ；以等量的BPY液體培養基加黃曲霉毒素BI為對照組用HPLC及柱后光化學衍生的方法對AFBl的降解率進行測定。
[0043]測定結果如圖1:上清液降解AFBl能力最強，降解率達到81.2%，菌懸液的降解能力次之，降解率為16.10%，胞內液的降解能力最差，降解率為2.31%，基本無降解能力。因此泰山枯草芽孢桿菌對黃曲霉毒素降解的活性物質是一種胞外分泌物，主要存在于其發酵后的上清液中。
[0044]實施例4.泰山枯草芽孢桿菌發酵液活性組分性質的研究
[0045]分別取實施例3中制備的泰山枯草芽孢桿菌發酵上清液各10ml，分別進行熱處理(100°C加熱30min)和蛋白酶K (0.01g/ml蛋白酶K與發酵上清液反應2h，以未處理的發酵上清液作對照，用高效液相色譜HPLC及柱后光化學衍生的方法對AFBl的降解率進行測定。
[0046]結果如圖2所示:發酵上清液經過高溫、蛋白酶K處理后，對黃曲霉毒素BI的降解能力明顯降低，分別為20%和35% ;而對照組未處理的發酵上清液對AFBl的降解率為74% ；因此可初步判斷泰山枯草芽孢桿菌降解AFBl起作用的主要是胞外提取液中的一種生物活性酶，對AFBl的降解過程實質上應是降解酶的酶促反應。
[0047]實施例5.泰山枯草芽孢桿菌的應用
[0048]1.急性毒性試驗
[0049]每次每只小鼠最大給藥量0.2mL/g, Id經口灌胃給藥3次，經觀察灌服泰山枯草芽孢桿菌發酵液的小鼠，24h后無死亡現象，也未出現任何明顯的中毒現象。3d后處死小鼠，解剖觀察其心、肝、脾、肺、腎，均無特殊改變。可見泰山枯草芽孢桿菌對小鼠并無明顯的急性毒副作用.[0050]2.泰山枯草芽孢桿菌發酵液對發霉飼料的作用
[0051]取泰山枯草芽孢桿菌發酵液5mL和20g發霉飼料混勻在37°C的培養箱中培養3d，每隔半天充分混勻一次。分別檢測發霉飼料處理前和經枯草芽孢桿菌發酵液處理3d后AFBl的含量。結果表明，經泰山枯草芽孢桿菌發酵液處理后霉變飼料中AFBl含量由63.5ug/kg降為8.2ug/kg,遠低于黃曲霉毒素的國家限量標準，降解率達到87.1%。因此泰山枯草芽孢桿菌發酵液在實際 生產中能高效率降解霉變飼料中的AFBl。見圖3。
【權利要求】
1.一株保藏號為CGMCC N0.8186的泰山枯草芽孢桿菌，已于2013年9月13日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心；其16srDNA如SEQ.N0.1所示。
2.如權利 要求1所述的泰山枯草芽孢桿菌降解黃曲霉素B1的應用。
【文檔編號】C12R1/125GK103820353SQ201310553820
【公開日】2014年5月28日 申請日期:2013年11月8日 優先權日:2013年11月8日
【發明者】柴同杰, 孫玲玉 申請人:山東農業大學