嗜酸乳桿菌的復合發酵菌劑以及制備該菌液的方法
【專利摘要】本發明嗜酸乳桿菌的復合發酵菌劑以及制備該菌液的方法屬于生物菌在飼料中應用的【技術領域】，涉及一株優選的LAg12-7嗜酸乳桿菌，特別涉及含有該菌的復合發酵菌劑以及制備該菌液的方法，以及該復合發酵菌劑用于將食品工業廢棄物、飼料原料和輔料發酵后，制備成反芻動物微生態功能飼料的方法。LAg12-7嗜酸乳桿菌的產酸、耐酸和抑菌性能好，并能與枯草芽孢桿菌和啤酒酵母菌有很好的配伍，使發酵飼料中pH值迅速降至4.0以下，快速抑制有害微生物，并使有益菌始終處于優勢狀態，可使發酵飼料能長期保質。本發明制備的反芻動物微生態功能飼料的工藝簡單易行、生產成本低、飼喂方便、保質期長，而且可提高日糧纖維素等的消化率、經濟效益好。
【專利說明】嗜酸乳桿菌的復合發酵菌劑以及制備該菌液的方法
【技術領域】
[0001](本申請是分案申請，原案為中國專利申請201210399518.8)本發明屬于微生物有益菌在飼料中應用的【技術領域】，涉及一株優選的嗜酸乳桿菌，特別涉及含有該嗜酸乳桿菌的復合發酵菌劑，以及該復合發酵菌劑用于將食品工業廢棄物作為飼料原料與輔料混合后發酵，制備成反芻動物微生態功能飼料的方法。
【背景技術】
[0002]微生態功能飼料是由多種有益微生物對有關飼料原料進行發酵處理后的飼料，其中的微生物和代謝產物與相關動物體內的自然微生態體系相吻合和營養互補。利用微生物發酵技術生產的微生態功能飼料，對于開發利用飼料資源，提高飼料利用率，調節動物體內微生態平均，替代抗生素，防治某些疾病，具有積極意義。
[0003]用于生產發酵飼料的原料十分廣泛，從早期的石油、甲醇、乙醇等碳氫化合物到目前的食品加工副產物、廢棄物、農作物秸桿等。其中對利用餅柏作為原料生產發酵蛋白飼料的研究報道較多，該類發酵的目的是去除其中的抗營養因子和毒素，以提高加工副產物在配合飼料中的用量比例。而對食品加工廢棄物，如玉米黃漿水、玉米噴漿纖維、醬糟、木薯渣等，因其酸堿性和含鹽量不適合現有發酵菌的發酵工作，而未用發酵菌將玉米黃漿水、玉米噴漿纖維、醬糟、木薯渣等進行發酵制造飼料。
[0004]下面是現在玉米黃漿水、玉米噴漿纖維、醬糟、木薯渣在飼料應用方面存在的問題:
[0005]玉米黃漿水是指在玉米淀粉生產過程中分離出來的懸濁液，其中BOD值高達
1.5mg/g,富含有機物質，一股工廠均排放入江、河、湖泊，造成了嚴重的污染。據測定，玉米黃漿水的水分含量達90.01% (許劍秋，2002)，將玉米黃漿水濃縮成含水60%左右的濃縮液稱為玉米黃漿液，其粗蛋白 可達含量10~15%。
[0006]噴漿玉米纖維是玉米黃漿水與玉米皮的混合干燥物，水分含量10%左右，粗蛋白22~24%，粗纖維11~13%左右。對于利用噴漿玉米纖維生產發酵飼料的尚未見文獻報道。
[0007]醬糟是指用大豆、大米、麩皮等釀造醬油以后剩下的糟渣，含干物質41.47%，粗蛋白質12.72%，粗脂肪5.31%，粗纖維21.43%，無氮浸出物0.62%，灰分4.12%，鈣0.08%，磷0.04% (蘇玉賢，2001)。目前多數企業將醬糟烘干以后制成醬糟粉作飼料利用，但干燥過程能耗高。
[0008]木薯渣是用木薯生產淀粉或酒精后的廢料，新鮮木薯渣的水分含量85.0%以上，烘干后的木薯渣的水分含量10.0~12.0%，蛋白含量4.0%左右，粗纖維含量12%.0，適口性較差，直接用作飼料的價值較低。
[0009]國內外對利用食品工業廢棄物生產發酵飼料已有一些報道。許劍秋2002年報道了利用白地霉發酵玉米黃漿水生產飼料蛋白粉，但需要壓濾后再烘干，設備投資大，該技術尚處于實驗室研究階段(許劍秋，玉米淀粉廢水生產飼料蛋白，糧食與飼料工業2002年第4期)。聞琦濤等(2000年)利用光合菌(PSB)發酵玉米黃漿水生產PSB菌泥(閏琦濤等，玉米淀粉黃漿水PSB法資源化開發的應用前景，吉林糧食高等專科學校學報，2000年第4期)，該技術需要將發酵液進行菌液分離，使液體達標排放，但同樣也是設備投資較大。

【發明內容】

[0010]本發明要解決的技術問題是提供一種具有優良性能的嗜酸乳桿菌，以及適合以玉米黃漿液、玉米噴漿纖維、醬糟和木薯渣為主要原料的復合發酵菌劑和可以替代反芻動物精料的微生態功能飼料及其制備方法。該飼料可以降低反芻動物飼料成本，增加反芻動物對粗飼料的采食量和日糧粗纖維的消化率，提高反芻動物生產性能和非特異性免疫功能，降低反芻動物發病率，增加反芻動物養殖經濟效益。
[0011]本發明的第一個目的是提供一種耐酸耐膽鹽的嗜酸乳桿菌即LAgl2-7嗜酸乳桿菌；
[0012]本發明的第二個目的是提供含LAgl2_7嗜酸乳桿菌的復合發酵菌劑；
[0013]本發明的第三個目的是提供將復合發酵菌劑制備成復合發酵菌液的方法；
[0014]本發明的第四個目的是提供含復合發酵菌液的反芻動物微生態功能飼料，根據反芻動物的營養需要和日糧配制特點，以食品工業廢棄物為主要原料，添加適當發酵輔料，經LAgl2-7嗜酸乳桿菌和其它多種微生物發酵后，成為可以直接替代反芻動物精料的反芻動物微生態功能飼料；
[0015]本發明的第五個目的是提供含復合發酵菌液的反芻動物微生態功能飼料制備方 法。
[0016]本發明指的LAgl2_7菌株，或LAgl2_7嗜酸乳桿菌是:LAgl2_7Lactobacillusacidophilus LAgl2-7。本發明所提供的LAgl2_7菌株分離自牦牛胃腸道粘膜，經鑒定為嗜酸乳桿菌(Lactobacillus acidophilus)。 LAgl2_7Lactobacillus acidophilus LAg12-7嗜酸乳桿菌保藏日期:2012年8日3日，保藏單位:中國典型培養物保藏中心，保藏單位地址:中國、武漢、武漢大學(電話027-68754052)，存活檢測日期2012年8月7日:保藏號為:CCTCCNO:M2012305 ;該嗜酸乳桿菌具有以下特性:
[0017](I)該菌接種于MAS液體培養基，在37°C條件下培養22小時達到最高生長濃度，0D600 值為 2.86(見圖1)；
[0018](2)該菌接種于MRS液體培養基，在37°C條件下培養36小時以后，培養液的pH值低于3.50(見圖2)；
[0019](3)該菌在ρΗ2.0條件下處理2小時之后的存活率為69.32% (見表1)；
[0020](4)該菌在重量比為0.4%濃度的膽鹽條件處理2小時之后，菌的存活率為53.60% (見表 2)；
[0021](5)該菌對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌和志賀氏菌的抑菌圈分別是:
12.14 ~17.30mm (見表 3)。
[0022]本發明所提供含LAgl2_7嗜酸乳桿菌的反芻動物微生態功能飼料至少具有以下一種功能:
[0023](I)增強反芻動物對粗飼料的采食量和對日糧纖維的消化率:對酒糟的采食量提高4.46%~13.24% (見表6)，粗纖維消化率提高9.73%~19.02% (見表8)；[0024](2)提高反芻動物生產性能和經濟效益:日增重提高7.89%~8.77% (見表7)，毛利潤增加42.94%~76.69% (見表11)；
[0025](3)具有調節反芻動物瘤胃微生物平衡的功能，增加瘤胃纖維分解菌的數量:對黃色瘤胃球菌等、白色瘤胃球菌、嗜酸乳酸桿菌和牛鏈球菌的數量極顯著提高(見表9)；
[0026](4)保護反芻動物機體抗氧化系統、提高非特異性免疫功能，增強抗病力:對血清中總蛋白、白蛋白和三種免疫球蛋白(IgA、IgG和IgM)各指標的濃度明顯提高，對總抗氧化能力和超氧化物歧化酶的活性明顯提高(見表10)。
[0027]本發明涉及菌、菌劑、活化方法、飼料配方和飼料制作方法的技術內容如下:
[0028]l、LAgl2_7嗜酸乳桿菌的獲得
[0029]采用常規乳酸菌的分離、篩選和鑒定方法，從牦牛胃腸道粘膜中分離得到108株乳酸菌，通過生理生化性能測定，產酸、耐酸耐鹽實驗等，從中篩選出一株性能優良的嗜酸乳桿菌，命名為LAgl2-7嗜酸乳桿菌，經冷凍干燥制作成LAgl2-7嗜酸乳桿菌凍干粉。該菌由中國典型培養物保藏中心(武漢大學保藏中心)保藏，其編號為CCTCC M2012305，該菌凍干粉的活菌數可達200億/克。
[0030]2、復合發酵菌劑的配方和復合發酵菌液的制作
[0031]復合發酵菌劑組份按重量比組成為:LAgl2_7嗜酸乳桿菌凍干粉30.0~60.0 %、枯草芽孢桿菌凍干粉20.0~50.0%、啤酒酵母菌凍干粉10.0~30.0%。
[0032]上述LAgl2_7嗜酸乳桿菌同于由中國典型培養物保藏中心(武漢大學保藏中心)保藏，其編號為CCTCC M2012305的LAgl2-7嗜酸乳桿菌，其冰干粉活菌數為200億/克；枯草芽孢桿菌凍干粉購自華辰興業(成都)科技有限公司，其活菌數為200億/克；啤酒酵母菌凍干粉購自安琪酵母股份有限公司，其活菌數為200億/克。
[0033]使用復合發酵菌劑對底物進行發酵前，需將復合發酵菌劑先活化制成合發酵菌液。制備合發酵菌液的方法是:按重量比稱取5.0~15.0 %的紅糖加入80.0~90.0 %的清潔水，待紅糖溶化后，加入復合發酵菌劑0.3~1.0 %、維生素C0.1~0.4 %、尿素2.0~5.0%和磷酸二氫鉀0.1~0.5%，攪拌均勻；保持溫度和時間為:32°C條件下保溫2~3天，保溫期間每天攪拌一次，溶液PH值即能降到4.0以下，獲得活化好的復合發酵菌液。
[0034]3、反芻動物微生態功能飼料的組成配方和制作方法
[0035]根據反芻動物營養需要和飼喂特點，先用重量比為75.0~85.0 %的發酵主料與
10.0~20.0 %的發酵輔料進行混合，再加入2.0~6.0 %的復合發酵菌液進行充分混合制成發酵原料，然后將發酵原料裝入發酵塑料袋中，密封發酵塑料袋使發酵原料在發酵塑料袋中進行發酵。發酵條件為:在環境溫度15~30°C條件下發酵2~3天，獲得成品反芻動物微生態功能飼料；或在環境溫度6~15°C條件下發酵5~7天，獲得成品反芻動物微生態功能飼料。
[0036]以上發酵主料的組成及重量比為:按重量比稱取玉米黃漿液20.0~35.0%、噴漿玉米纖維25.0~45.0 %、醬糟20.0~40.0 %和木薯渣5.0~15.0 %直接混合。
[0037]發酵輔料的組成及重量比為:按重量比稱取麥麩50.0~65.0%，啤酒酵母粉20.0~35.0 %，碳酸鈣4.0~8.0 %、碳酸氫鈉4.0~8.0 %、氯化鎂1.0~4.0 %直接混合。
[0038]復合發酵菌液的組成及重量比為:紅糖5.0~15.0%、清潔水80.0~90.0%、復合發酵菌劑0.3~1.0%、維生素C0.1~0.4%、尿素2.0~5.0%和磷酸二氫鉀0.1~
0.5%。
[0039]復合發酵菌液的制備方法:按重量比稱取5.0~15.0%的紅糖加入80.0~
90.0 %的清潔水，待紅糖溶化后，加入復合發酵菌劑0.3~1.0 %、維生素C0.1~0.4 %、尿素2.0~5.0%和磷酸二氫鉀0.1~0.5%，攪拌均勻；保持溫度和時間為:32°C條件下保溫2~3天，保溫期間每天攪拌一次，溶液pH值即能降到4.0以下，獲得活化好的復合發酵菌液。
[0040]本發明中:
[0041]玉米黃漿液的含水量為58~60% ;
[0042]噴漿玉米纖維的含水量為10~12% ；
[0043]醬糟的含水量為10~12% ；
[0044]木薯渣的含水量為10~12%。
[0045]上述發酵原料:玉米黃漿液為玉米黃漿水濃縮為含水58~60%的濃縮液，購自魯州生物科技(四川)有限公司；噴漿玉米纖維是玉米黃漿水與玉米皮的混合干燥物，水分含量10~12%，購自魯州生物科技(四川)有限公司；醬糟是生產醬油的余渣經干燥而成，水份含量10~12%，購自成都國釀食品股份有限公司；木薯渣的水份含量為10~12%，購自四川金盛源生物化工有限公司；啤酒酵母粉是在生產啤酒過程中，啤酒發酵液過濾后的余渣經干燥而成，水份含量為10%，購自金威啤酒(成都)有限公司。
[0046]本發明的優點:針對目前國`內對食品加工廢棄物玉米黃漿液、噴漿玉米纖維、醬糟以及木薯渣開發飼料產品的方法單一、設備復雜、能耗較高的現狀，本發明綜合運用微生物發酵技術和動物營養原理，以食品工業廢棄物一玉米黃漿液、玉米噴漿纖維、醬糟和木薯渣為發酵主料，再根據反芻動物的營養需要特點添加發酵輔料，再加入活化后的復合發酵菌液(含LAgl2_7嗜酸乳桿菌、枯草芽孢桿菌和啤酒酵母菌)后，直接裝入發酵塑料袋中進行固態發酵。本發明具有以下優點:
[0047]1、優良的LAgl2_7嗜酸乳桿菌株
[0048]本發明從牦牛胃腸道粘膜中分離的108株乳酸菌中，經反復篩選得到一株性能優良的嗜酸乳桿菌，命名為LAgl2-7嗜酸乳桿菌(微生物保藏編號:CCTCC M2012305)。該菌接種于MRS液體培養基中，在37°C培養22小時即達到最高生長濃度，0D600值為2.86，在MRS液體培養基中37°C條件下培養36小時，培養液的pH值即低于3.50 ;在pH2.0處理2小時之后的存活率為69.32% ;在0.7%%膽鹽濃度處理2小時之后的存活率為53.60% ;對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、志賀氏菌均有較為明顯的抑制作用，經冷凍干燥制作成LAgl2-7嗜酸乳桿菌凍干粉，凍干粉的活菌數為200億/克。
[0049]由于LAgl2_7嗜酸乳桿菌的產酸、耐酸和抑菌性能好，并能與枯草芽孢桿菌和啤酒酵母菌有很好的配伍，使發酵飼料中PH值在24小時以內迅速降至4.0以下，快速抑制有害微生物的生長，并使有益菌始終處于優勢狀態，可使發酵飼料能長期保質。
[0050]2、制備反芻動物微生態功能飼料的工藝簡單易行
[0051]本發酵飼料改變一股固態發酵模式，通過菌種組合，將配制好的發酵原料放入發酵塑料袋中，進行好氧與厭氧相結合的立體式節能發酵:前期主要由好氧菌(酵母菌)發酵，消耗掉發酵原料中的氧氣，后期主要由厭氧菌(嗜酸乳桿菌)發酵，使發酵飼料中pH值24小時以內迅速降低至4.0以下，快速抑制有害微生物的生長，同時枯草芽孢桿菌繁殖產生大量纖維素酶、蛋白酶等消化酶。經7~20天發酵即得成品反芻動物微生態功能飼料。可裝載質量40kg發酵原料的塑料袋即是發酵容器，也是成品包裝、貯藏袋和運輸袋，無須再包裝、無須再干燥，直接運送到用戶。
[0052]3、反芻動物微生態功能飼料生產成本低
[0053]本發明以低價的食品工業廢棄物為主要原料，同時對棄物原料采用無須烘干的節能發酵工藝，使飼料的生產成本低。由于通過添加適當發酵輔料和和含LAgl2-7嗜酸乳桿菌的復合發酵菌劑進行發酵后，成為具有較高營養價值的反芻動物微生態功能飼料。在反芻動物精料中添加20~60%的本發明微生態功能飼料，在提高反芻動物生產性能的同時，可降低反芻動物飼料成本4%左右。
[0054]4、反芻動物微生態功能飼料使用方便
[0055]本發明根據反芻動物的營養需要和使用特點設計，使發酵后的微生態功能飼料的營養指標基本達到反芻動物精料的營養指標，用戶在使用時可直接以20~60%的重量比替代反芻動物精料，無須改變或調整原有反芻動物精料配方，使用方便。
[0056]5、反芻動物微生態功能飼料具有多種功能
[0057]本發明的功能飼料含有多種具有活性的有益菌及其具有生物活性的代謝產物，具有增強反芻動物對粗飼料的采食量和對日糧纖維的消化率、提高生產性能和經濟效益、增加瘤胃纖維分解菌的數量、保護機體抗氧化系統、提高非特異性免疫功能、增強抗病力等多種功能。
[0058]6、反芻動物微生態功能飼料保質期長
[0059]本發明的反芻動物微生態功能飼料在環境溫度30°C~40°C條件下保質70~90天；或在環境溫度O~30°C條件下保質150~180天。而現有含嗜酸乳桿菌發酵的飼料在環境溫度30°C~40°C條件下保質15~20天；或在環境溫度O~30°C條件下保質30~40天。
[0060]圖1是LAgl2_7嗜酸乳桿菌的生長曲線；
[0061]圖2是LAgl2_7嗜酸乳桿菌的產酸能力圖。
具體實施例
[0062]實施例1、乳酸菌的篩選及性能測定
[0063]1.1、篩選牦牛胃腸乳酸菌獲得LAgl2_7嗜酸乳桿菌
[0064]MRS培養基:蛋白胨10.00g、酵母膏5.00g、牛肉膏10.00g、葡萄糖20.00g、磷酸氫二鉀2.00g、檸檬酸三氨1.0Og,乙酸鈉5.00g、硫酸鎂0.80g、硫酸錳0.25g、吐溫801ml，用蒸懼水定容至1000ml, pH6.2~6.4,115°C滅菌30min。
[0065]采用常規微生物學方法，從牦牛胃腸道粘膜中分離得到108株乳酸菌，通過產酸、耐酸耐鹽實驗等，從中篩選出一株性能優良的菌株。該菌株經過生理生化鑒定及16SrDNA分子鑒定確定該菌株為嗜酸乳桿菌，命名為嗜酸乳桿菌LAgl2-7，菌株經冷凍干燥制作成凍干粉，凍干粉的活菌數為200億/克。該菌由中國典型培養物保藏中心(武漢大學保藏中心)保藏，其編號為CCTCC M2012305。
[0066]1.2、LAg12-7嗜酸乳桿菌生長試驗[0067]將嗜酸乳桿菌LAgl2_7轉入MRS液體培養基中37°C活化15~18小。將活化好的菌株以2% (V/V)的接種量轉入MRS液體培養基中厭氧培養，，每隔一定時間取樣測定0D600值，以未接種的培養基作為空白對照。結果可見前20小時LAgl2-7嗜酸乳桿菌繁殖迅速，0D600值持續上升；從20~48小時，菌體密度基本趨于平衡，0D600值穩定在2.86左右，處于生長穩定期，見圖1。
[0068]1.3、LAg12-7嗜酸乳桿菌產酸試驗
[0069]將LAgl2_7嗜酸乳桿菌活化后，接種到MRS液體培養基，在37°C條件下培養，每隔一定時間取樣測定pH值，以未接種的MRS液體培養基的pH為初始pH。結果見圖2，可見培養36小時以后，LAg12-7嗜酸乳桿菌培養液的pH值低于3.50。[0070]LAg12-7嗜酸乳桿菌活化后，接種MRS液體培養基，在37°C條件下培養，培養一定時間后測定發酵液PH，以未接種的MRS液體培養基的pH為初始pH。結果表明，該菌種培養后PH快速下降，培養到36h以后pH下降趨勢趨緩，培養到60h時pH達到3.45.可見培養36小時以后，LAg12-7嗜酸乳桿菌培養液的pH值低于3.50，見圖2。
[0071]1.4、LAg12-7嗜酸乳桿菌耐酸試驗
[0072]將菌種接種在MRS液體培養基上活化2次，以2 % (V/V)的接種量接種到MRS液體培養基中，在37°C條件下培養24h小時，8000rpm/min離心10分鐘，收集菌體，將菌體用pbs (pH6.0)緩沖液洗漆I次,重新懸浮于pbs (pH6.0)緩沖液中。將懸浮液平均分成5分，再次離心收集菌體。將得到的菌體分別懸浮于PH2.0,3.0,4.0、5.0和6.0的pbs緩沖液中，所得到的5份不同pH的pbs菌液，在室溫下放置2小時，進行活菌計數，以pH6.0條件下的活菌數為100%，計算其存活率。
[0073]LAg12-7嗜酸乳桿菌耐酸試驗結果見表1，表明LAgl2_7嗜酸乳桿菌在pH2.0條件下放置2小時后的存活率為69.32%。
[0074]表lLAgl2_7嗜酸乳桿菌在不同pH值下的存活率 (單位:％ )
[0075]
【權利要求】
1.嗜酸乳桿菌的復合發酵菌劑，其特征在于:該復合發酵菌劑的組成和重量比為:LAg12-7嗜酸乳桿菌凍干粉30.0~60.0%、枯草芽孢桿菌凍干粉20.0~50.0%、啤酒酵母菌凍干粉10.0~30.0% ;所述LAgl2-7嗜酸乳桿菌由中國典型培養物保藏中心(武漢大學保藏中心)保藏，其保藏編號為CCTCC M 2012305。
2.將權利要求1所述復合發酵菌劑制備復合發酵菌液的方法:按重量比稱取5.0~.15.0%的紅糖加入80.0~90.0%的清潔水，待紅糖溶化后，加入復合發酵菌劑0.3~1.0%、維生素C 0.1~0.4 %、尿素2.0~5.0%和磷酸二氫鉀0.1~0.5%，攪拌均勻；保持溫度和時間為:32°C條件下保溫2~3天，保溫期間每天攪拌一次，溶液pH值即能降到4.0以下，獲得活化好的復合發酵菌液。
【文檔編號】C12N1/20GK103881944SQ201310558517
【公開日】2014年6月25日 申請日期:2012年10月19日 優先權日:2012年10月19日
【發明者】郭春華, 彭忠利, 羅璠, 柏雪, 王永玲 申請人:西南民族大學, 四川新通達生物飼料科技有限公司