華東葡萄株系白河-35-1抗逆基因 VpSBP16的制作方法
【專利摘要】本發明中公開了華東葡萄株系白河-35-1抗逆基因VpSBP16，該基因完整開放閱讀框序列全長1674bp，編碼558個氨基酸。 申請人:構建了pCAMBIA2300-35S-VpSBP16過量表達載體，通過花絮浸染法將其導入模式植物擬南芥。結果表明在擬南芥中過量表達VpSBP16明顯提高了擬南芥對于滲透脅迫，失水處理，長期干旱以及鹽脅迫的耐受力。此外，在脅迫條件下，轉基因株系中的活性氧（ROS）的積累也是明顯少于野生對照。在含有氯化鈉（NaCl）和甘露醇（Mannitol）的培養基上，VpSBP16轉基因株系的萌發率顯著高于野生對照。在鹽脅迫培養基上，轉基因株系的根長也明顯長于對照。以上結果都表明VpSBP16基因在擬南芥中的過量表達提高了植株的抗鹽脅迫和干旱脅迫的能力。
【專利說明】華東葡萄株系白河-35-1抗逆基因VpSBPI 6
【技術領域】
[0001]本發明涉及植物抗逆基因鑒定及基因工程【技術領域】，特別涉及華東葡萄株系白河-35-1抗逆基因VpSBP16。
【背景技術】
[0002]Squamosa啟動子結合蛋白(Squamosa promoter Binding Protein, SBP)是一類植物特有的轉錄因子。它最初是由金魚草(Antirrhinum majus)中分離。之后,SBP基因陸續從擬南芥、白樺樹，衣藻、水稻、苔蘚、玉米和番茄中分離。這些SBP轉錄因子家族具有許多重要的生物學功能，包括孢子發生、枝條發育、花發育、葉原基的形成、營養生長和生殖生長之間的轉換、葉片的發育、環境信號和病原菌應答。
[0003]在自然生長環境中，植物經常暴露于復雜多變的生物與非生物脅迫中。為了改善植物對脅迫和疾病的抵抗能力，研究各種脅迫途徑中抗逆基因的功能是很重要的。但現有的關于SBP基因的研究主要集中在植物的生長發育方面，關于SBP基因在抗逆方面的研究還很少。因此，在本研究中，我們通過收集分析公開可用的葡萄芯片數據庫研究了了葡萄中SBP-box基因對各種生物和非生物脅迫以及激素處理的反應
[0004]干旱、鹽堿、寒冷，高溫以及病原菌的侵害等一系列生物和非生物脅迫對植物的生長發育和農作物的產量造成了不可逆的傷害。調控各種脅迫應答基因的轉錄表達是植物對一系列的生物和非生物脅迫的響應的一種重要方式。很多轉錄因子如WRKY，bZip，AP2/ERF和MYB等都響應干旱、鹽堿、寒冷等逆境脅迫，從而提高植物體對逆境脅迫的耐受力。
[0005]迄今為止，關于SBP-box基因功能方面的研究主要集中在一些重要的生物發育過程中。而對于SBP基因在脅迫中發揮作用的研究還很少。但也有研究表明，在擬南芥中，SBP-box基因可以通過與參與防御反應途徑的基因相互作用來對各類的生物和非生物脅迫做出響應。此外，已有研究表明AtSPLH基因參與了細胞程序性死亡，且在伏馬毒素BI的敏感性方面有重要作用。在研究中， 申請人:也發現第I組葡萄SBP-box基因可能在抵抗病原菌感染方面起到了關鍵作用，如VvSBP17基因在歐洲葡萄品種霞多麗感染黑木病后，表達量上調表達；葡萄VvSBP7基因在高抗株系感染霜霉病后出現下調表達；VvSBP17，VvSBP7和VvSBP5基因在成熟葡萄果實感染葡萄卷葉病毒III后，基因的表達水平都顯著增加。此外，對野生葡萄進行鹽脅迫和外源激素處理結果顯示，處于第二組中VvSBP3和VvSBPie的基因表達量也發生了明顯的改變。
[0006]細胞膜具有選擇透過性，這是植物維持正常生理功能的重要條件之一。他可以阻止不需要或對細胞有害的物質進入細胞，是植物的一種自我保護。但當植物長期處于逆境時，細胞膜的選擇透性降低甚至消失，細胞內物質就會大量外滲，從而引起植株電導率的變化。可以通過這種變化來了解植株細胞膜的受傷害程度進而說明所測植株的抗逆性強弱。
[0007]活性氧是一類具有比氧分子活潑的氧的某些衍生物，如過氧化氫(H202)、超氧化物的陰離子(O2.-)和羥基(-0H)等。正常條件下，植物細胞中的活性氧(ROS)并不會對植物產生嚴重的傷害，但是髙鹽和干旱脅迫條件下，活性氧平衡被打破，植物細胞產生過量的ROS而無法被及時清除，造成了嚴重氧化傷害，進而影響到了植物正常的生理代謝。所以及時清除過量的ROS，維持植物體內氧平衡，對于改善植物抗逆性具有重要的作用。最近的研究已經表明，各類轉錄因子在活性氧清除方面都有重要的調控作用。水稻中過量表達OsMYB2基因能夠降低ROS含量，從而提高了轉基因水稻的抗旱能力。在H2O2脅迫條件下，香蕉幼苗中MusaffRKY71基因的表達增強，過表達MusaWRKY71可以激活ROS清除系統中過氧化物酶基因的表達。AP2/ERF轉錄因子也參與了清除ROS的過程。在煙草中過量表達JERF3和S1ERF3，水稻中過量表達TERF2和SUBlA都可以增強植株清除活性氧能力，提高對各種脅迫的耐受能力。長期的高鹽脅迫會導致鹽分沉積，通常會使植株體內水勢降低而無法從土壤中吸取水分。這樣就迫使植株處于缺水狀態，構成了生理學上的干旱脅迫。
[0008]植物根系的形成與植物的抗旱和抗鹽性密切相關，有研究表明，在干旱脅迫時，過量表達MYB96可以使擬南芥的根系更加發達。

【發明內容】

[0009]本發明的目的在于，提供華東葡萄株系白河-35-1抗逆基因VpSBP16，并證明了該基因在抗逆方面的功能。
[0010]為了實現上述任務，本發明采用如下的技術解決方案:
[0011]華東葡萄株系白河-35-1抗逆基因VpSBP16，其特征在于，該華東葡萄株系白河-35-1抗逆基因VpSBP16的編碼區序列如下:
[0012]I ATGGGGTCTT GGAGCTACGT TTCACAGGAA AAGGAATTTA TATCTGATGC AGCCGATTTG CAGQXMn
[0013]71 OGCCTGCAAG AAGTAAAAAT GTTTTCATGG GTTGGGMn GAAAACCCCA TGTAGmTG GAAACAGCAT
[0014]141 TTTAGTGTCA AGTCAACAGA TCATTCAGAA TCAGGGTTTT GGGGAATTTG GTATCCCTGA AATGGTCAGA`[0015]211 AAACAATTGC CAGACAATTC MmGGGAT GTTTCATGTG GCAAGGGTGG TGATGGAATA ATGGTTMH
[0016]281 OGAmTGGT ATCCCCAAAT GTCTTTCCCA GAGATGAOGA GTCAAGTTCG AAGCTCTCTA GCTCTGmT
[0017]351 GGAATCTAAC AGCCAGGACT CTTTGCTCAT TGAITTGMG CTCGGAAGGT TTGCTGATCA TAGTGATTTC
[0018]421 CAAMHGTA AACCATCCAA AGCAAACCCC AGHTGCCAT CGGCTGAGTC CTCTACACCA GCAAAGAGAG
[0019]491 nOGAGCTGT GGGCTTGMC TCTCAGACTG CCTTnGCCA AGTTCATGGT TGTAACAAGG ATCTTAGCAG
[0020]561 CTCAAAAGAC TACCACAAGA GGCACAAAGT TTGTGAAGTT CATTCCAAGA CTGCCAAAGT CATTGTGAAT
[0021]631 GGCATTGAAC MAGGTTTTG TCAGCAATGC AGCAGGTTTC ATTTGCTGGC TGAGTTTGAT GATGGTAAGC
[0022]701 GCAGCTGTCG CAAAOGCCTT GCAGGCCACA ATGAAOGTOG GAGGAAACCC CAAGTTGGTA TTCACCCTGG
[0023]771 CAGGGCAGGG AGGTTGCTTC AATCATATAA OGGCTATGCA GGTAATAGAT TTCAGGGGAC TACACTAACA
[0024]841 ACOGCATCCT mTATGTCA AGATATACTC CCCAGTGGTC TATTGCCACC AGAGAAATAT GGGATGAGTG
[0025]911 ACTGGTGCAA GCGGATAAM GTTGAAGATG GAACTGACTA TAGTCCTCAA TCMOCATTC CTATAACCAA
[0026]981 TGGGCACCCA CATOCAMGT OOCTAnOOC TACTTTTGAA TTTGAAAAAC A/mVTTCTTC CITTCAAGAC
[0027]1051 AATGGAGCTA ATACAGGAAG TATTTTCAGT GAACACAATA GCCGATATCC ACATGATCTT GCAGATGCAA
[0028]1121 AnCTGGQX GCAnCTTTT HOCMGACA OCTCAmGG AAATGAAGAC TTGTCTGTTT TTGACGCAGG
[0029]1191 ATCTACTGn CAGGGCTTAT CAGGGATTTC AGACTCTGGT CGTGCTCTCT CTCTTCTGTC ATCTCAATCA
[0030]1261 CAGAACTCTT CCAGCCATTC GTCAGGMTT CCCATGATTC A0000CTGAT CATGCCTGGC TGTCATGCCC
[0031]1331 ΑπΑΤΜΤΑΤ AGCTCAAGTC TCTGAGAAGT TCTTGGGAGT CAGC000CAG GTTTCAATGA GTAGGGTGCC
[0032]1401 AAATAAGTTT CTTTCATCTG GGATGAATTC TGCAGAAGGG AACCACCTAG GTCCTATACT AATTTCTGAT[0033]1471 TGTAGTGAGC CAGTGAACTT TGAAGTGACA GATGGGATTT TCCAAGGATC AGATTTTGTA AACACTAAGG[0034]1541 ATTGTCTTCC TTGTGAAACT GGACCCACCA TTGATTTGCT TCAATTGTCA TCACMCTOCATCGAGTTGA
[0035]1611 GCATCAGAGG CAATCAATAC ATGTCAAGCA GGAAAATGAT ACTTTCTGCC TCCGGATAAC GTAA
[0036]本發明首次構建了 pCAMBIA2300-35S-VpSBP16過量表達載體，并通過花絮浸染法將其導入模式植物擬南芥。研究了華東葡萄株系白河-35-1抗逆基因VpSBP16過量表達的轉基因株系和野生對照在滲透脅迫，失水處理，長期干旱以及鹽脅迫處理下的生長情況。
[0037]通過 申請人:的研究表明，本發明的華東葡萄株系白河-35-1抗逆基因VpSBP16，能明顯提高擬南芥對于滲透脅迫，失水處理，長期干旱以及鹽脅迫的耐受力。此外，在脅迫條件下，轉基因株系中的活性氧(ROS)的積累也是明顯少于野生對照。在含有氯化鈉(NaCl)和甘露醇(Mannitol)的滲透培養基上，具有華東葡萄株系白河_35_1抗逆基因VpSBP16的株系萌發率顯著高于野生對照。在鹽脅迫培養基上，具有華東葡萄株系白河-35-1抗逆基因VpSBP16的株系的根長也明顯長于對照。以上結果都表明華東葡萄株系白河-35-1抗逆基因VpSBP16在擬南芥中的過量表達提高了植株的抗鹽脅迫和干旱脅迫的能力。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0038]圖1是氯化鈉和甘露醇引起的滲透脅迫對野生對照(WT)和轉基因株系VpSBP16-l，VpSBP16-14和VpSBP16-47萌發的影響。其中，A圖是在MS培養基的圖片，B圖是在MS培養基+150mM的NaCl滲透培養基圖片，C圖是在MS培養基+400mM甘露醇(Mannitol)滲透培養基圖片，圖D是野生對照WT、轉基因株系VpSBP16-l，VpSBP16-14和VpSBP16_47在圖A、B、C中的相應位置示意。
[0039]圖2是轉基因擬南芥種子分別在MS培養基(左圖)，MS培養基+150mM氯化鈉的滲透培養基和MS培養基+400mM甘露醇的滲透培養基(右圖)上的萌發率。
[0040]圖3是VpSBPie轉基因擬南芥增強了對滲透脅迫的抗性。野生對照(WT)和轉基因株系 VpSBP16-l，VpSBP16-14 和 VpSBP16_47 在 MS 培養基(A 圖)，MS 培養基 +150mM 氯化鈉的滲透培養基(B圖)以及MS培養基+400mM甘露醇的滲透培養基(C圖)上分別培養14天，35天，20天后的生長情況。
[0041]圖4是在MS培養基(A圖)和鹽脅迫培養基(B、C圖，即MS培養基+150mM氯化鈉、MS培養基+400mM甘露醇的滲透培養基)上生長14天和35天的野生對照，VpSBP16_l，VpSBP16-14和VpSBP16-47轉基因株系擬南芥根長的代表圖。
[0042]圖5是MS培養基中野生對照(WT)和轉基因株系VpSBP16_l，VpSBP16_14和VpSBP16-47幼苗的失水處理及電導率測定(A圖)在50min內，野生對照(WT)和轉基因株系VpSBP16-l，VpSBP16-14和VpSBP16-47培養基幼苗的失水過程比較。將苗齡十天的無菌苗從萌發培養基中拔出放于自然環境中進行失水處理。每隔十分鐘稱量一次鮮重，失水量通過兩次時間的鮮重差來計算。(B圖)失水處理50min時，WT, VpSBP16_l，VpSBP16_14andVpSBP16-47幼苗的電導率。星號表示與野生對照相比有顯著差異(*P〈0.05)。
[0043]圖6是野生對照，轉基因株系VpSBP16-l，VpSBP16_14和VpSBP16_47的盆栽苗對鹽脅迫的反應。左圖為處理以前的植株代表圖，右圖為鹽脅迫一周后的植株代表圖。
[0044]圖7是野生對照和轉基因株系VpSBP16-l，VpSBP16-14和VpSBP16_47盆栽苗對干旱脅迫的反應。左圖為處理以前的植株代表圖，中間圖為干旱處理18天后植株代表，右圖為復水3天后的植株代表。
[0045]圖8是野生對照和轉基因株系VpSBP16-l，VpSBP16-14和VpSBP16_47盆栽苗在非生物脅迫條件下活性氧積累的染色圖。
[0046]圖9是脅迫相關基因在野生對照和轉基因株系(VpSBP16_l，VpSBP16_14，VpSBP16-47)中的表達。選取在MS培養基上生長兩周的幼苗提RNA并反轉錄后利用實時定量PCR技術測定脅迫基因表達量。
[0047]以下結合附圖和實施例對本發明作進一步詳細描述。
【具體實施方式】
[0048] 申請人:利用同源克隆技術，根據歐洲葡萄黑比諾基因組序列采用反轉錄PCR(Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction, RT-PCR),以華東葡萄白河-35-1葉片總RNA反轉錄合成cDNA第一鏈為模板，首次擴增了華東葡萄株系白河-35-1抗逆基因VpSBP16，該基因完整開放閱讀框序列全長1674bp，編碼558個氨基酸。
[0049]分析表明它們均包括一個高度保守的SBP結構域，該結構域包含兩個C2HCH型的鋅指結構和一個雙向核定位信號。經過亞細胞定位和轉錄活性分析表明，它們都可以定位到核里且都具有轉錄激活活性。
[0050]為了一步研究華東葡萄株系白河-35-1抗逆基因VpSBP16在植物抵御各種脅迫中的具體功能， 申請人:構建了 pCAMBIA2300-35S-VpSBP16過量表達載體，將其在野生擬南芥植株中過量表達。發現具有華東葡萄株系白河-35-1抗逆基因VpSBP16的株系在滲透脅迫培養基上的種子萌發率顯著高于野生對照，而且經過長期培養后，發現具有華東葡萄株系白河-35-1抗逆基因VpSBP16的植株可以在滲透培養基上長出強壯根系，健康的子葉和真葉，而野生對照在種子萌發后，子葉和根系無法正常生長直至植株枯黃變褐死亡。在研究中， 申請人:對成苗轉基因植`株進行了鹽脅迫和干旱處理并利用化學染色的方法分別檢測了在失水處理以及鹽脅迫處理后葉片或植株中超氧陰離子自由基(O2.-)和過氧化氫(H2O2)的水平。結果表明在脅迫處理后，與野生對照相比轉基因株系中活性氧積累較少，受的氧化脅迫也較小。說明華東葡萄株系白河-35-1抗逆基因VpSBP16的過量表達可能參與了 ROS的清除過程從而增強了植株的抗脅迫能力。
[0051]對失水50min的所有植株測定電導率發現，野生植株的電導率明顯高于轉基因株系，說明在脅迫條件下，華東葡萄株系白河-35-1抗逆基因VpSBP16的轉入，改善了擬南芥株系的抗逆性。擬南芥中過量表達華東葡萄株系白河-35-1抗逆基因VpSBP16后，在遭受鹽脅迫時，與對照相比，轉基因株系擁有更長和更強壯的根系，這將有利于植株吸收更多的水分，提高植株的抗鹽，抗旱性。
[0052]以下是華東葡萄株系白河-35-1抗逆基因VpSBP16的編碼區序列以及抗各種非生物脅迫功能實驗驗證的具體步驟。
[0053]A、在前期研究獲得18個歐洲葡萄SBP家族基因的基礎上，利用同源克隆技術，以華東葡萄白河-35-1葉片總RNA反轉錄合成cDNA第一鏈為模板，擴增得到了華東葡萄株系白河-35-1抗逆基因VpSBP16序列，該華東葡萄白河_35_1抗逆基因VpSBP16的編碼區序列如下:
[0054]I ATGGGGTCTT GGAGCTACGT HCACAGGAA AAGGAATTTA TATCTGATGC AGCCGATTTG CAGCCCAATT[0055]71 OGCCTGCAAG AAGTAAAAAT GTTTTCATGG GTTGGGMn GAAMOOOCA TGTAGTTATG GAAACAGCAT
[0056]141 TTTAGTGTCA AGTCAACAGA TCATTCAGAA TCAGGGTTTT GGGGAATTTG GTATCCCTGA AATGGTCAGA
[0057]211 AAACAATTGC CAGACAATTC AATTAGGGAT GTTTCATGTG GCAAGGGTGG TGATGGAATA ATGCTTMTT
[0058]281 OGAmTGGT ATCCCCAAAT GTCTTTCCCA GAGATGAOGA GTCMGHOG AAGCTCTCTA GCTCTGmT
[0059]351 GGAATCTAAC AGCCAGGACT CTTTGCTCAT TGATTTGAAG CTCGGAAGGT TTGCTGATCA TAGTGATTTC
[0060]421 CAAAATTGTA AACCATCCAA AGCAAACCCC AGTTTGCCAT CGGCTGAGTC CTCTACACCA GCAAAGAGAG
[0061]491 nOGAGCTGT GGGGTTGAAC TCTCAGACTG OCITTTGCCA AGHCATGGT TGTAACAAGG ATCTTAGCAG
[0062]561 CTCAAAAGAC TACCACAAGA GGCACAAAGT TTGTGMGTT CAHOCAAGA CTGCCAAAGT CAHGTGMT
[0063]631 GGCAHGMC MAGGTTTTG TCAGCAATGC AGCAGGTTTC ATTTGCTGGC TGAGTTTGAT GATGGTAAGC[0064]701 GCAGCTGTCG CAAAOGCCTT GCAGGCCACA ATGAAOGTOG GAGGAAACCC CAAGTTGGTA TTCACCCTGG
[0065]771 CAGGGCAGGG AGGTTGCTTC AATCATATAA OGGCTATGCA GGTAATAGAT TTCAGGGGAC TACACTAACA
[0066]841 ACOGCATCCT TTATATGTCA AGATATACTC CCCAGTGGTC TATTGCCACC AGAGAAATAT GGGATGAGTG
[0067]911 ACTGGTGCAA GCGGATAAM GTTGAAGATG GAACTGACTA TAGTCCTCAA TCMOCATTC CTATAACCAA
[0068]981 TGGGCACCCA CATOCAMGT OOCTAnOOC TACTTTTGAA TTTGAAAAAC AMMTCTTC CITTCAAGAC
[0069]1051 AATGGAGCTA ATACAGGAAG TATTTTCAGT GAACACAATA GCCGATATCC ACATGATCTT GCAGATGCAA
[0070]1121 ATTCTGGCCC GCATTCTTn HOCAAGACA CCTCATTAGG AAATGAAGAC TTGTCTGTTT TTGACGCAGG
[0071]1191 ATCTACTGTT CAGGGCTTAT CAGGGATTTC AGACTCTGGT CGTGCTCTCT CTCTTCTGTC ATCTCAATCA
[0072]1261 CAGAACTCTT CCAGCCATTC GTCAGGMTT CCCATGATTC ACCCCCTGAT CATGCCTGGC TGTCATGCCC
[0073]1331 ATTATAATAT AGCTCAAGTC TCTGAGAAGT TCTTGGGAGT CAGCCCCCAG GTTTCAATGA GTAGGGTGCC
[0074]1401 AAATAAGTTT CTTTCATCTG GGATGAATTC TGCAGAAGGG AACCACCTAG GTCCTATACT MITTCTGAT
[0075]1471 TGTAGTGAGC CAGTGAACTT TGAAGTGACA GATGGGATTT TCCAAGGATC AGATTTTGTA AACACTAAGG
[0076]1541 ATTGTCTTCC TTGTGAAACT GGACCCACCA TTGATTTGCT TCAATTGTCA TCACAACTCC ATCGAGTTGA
[0077]1611 GCATCAGAGG CAATCAATAC ATGTCAAGCA GGAAAATGAT ACTTTCTGCC TCCGGATAAC GTAA
[0078]B、將華東葡萄株系白河-35-1抗逆基因VpSBP16序列的完整開放閱讀框插入CaMV35S啟動子下游，構建了植株過量表達載體并將其通過農桿菌介導的花絮浸染法將其導入野生型擬南芥哥倫比亞CO。篩選獲得了表現型良好的VpSBP16轉基因株系(VpSBP16-l、VpSBP16-14、VpSBP16_47)。
[0079]C、參見圖1~圖9， 申請人:鑒定了 VpSBP16轉基因株系(VpSBP16-l、VpSBP16_14、VpSBP16-47)能明顯提高擬南芥對于滲透脅迫，失水處理，長期干旱以及鹽脅迫的耐受力。此外，在脅迫條件下，轉基因株系中的活性氧(ROS)的積累也是明顯少于野生對照。在M S萌發培養基中添加氯化鈉(NaCl)和甘露醇(Mannitol )，VpSBP16轉基因株系(VpSBP16_l、VpSBP16-14、VpSBP16-47)的萌發率顯著高于野生對照。在鹽脅迫培養基上，轉基因株系的根長也明顯長于對照。
[0080]以上結果都表明華東葡萄白河-35-1抗逆基因VpSBP16在擬南芥中的過量表達提高了植株的抗鹽脅迫和干旱脅迫的能力。
[0081]以下是 申請人:給出的具體實施例。
[0082]實施例1:過量表達的轉基因株系和野生對照在滲透脅迫情況下的萌發
[0083]三個轉基因株系(VpSBP16-l、VpSBP16-14、VpSBP16-47)和野生對照(WT)在MS 培養基上2d時開始萌發，4d后萌芽率都能達到100%。而在含有氯化鈉和甘露醇的MS滲透培養基上培養14d后，含有氯化鈉的滲透培養基上的轉基因株系(VpSBP16-l、VpSBP16-14、VpSBP16-47)的萌發率分別達到了 81.48%、86.67%、75%，而野生對照(WT)的萌發率只有56.41%,明顯低于轉基因株系(VpSBP16-l、VpSBP16_14、VpSBP16_47)。在含有甘露醇的滲透培養基上，轉基因株系(VpSBP16-l，VpSBP16-14, VpSBP16_47)的萌發率分別達到了89.09%，95.08%，95.91%，而野生對照(WT)的萌發率只有72% (圖1，圖2)。
[0084]實施例2:華東葡萄白河-35-1抗逆基因VpSBP16轉基因擬南芥T3代幼苗對滲透脅迫的抗性
[0085]為了進一步測定 VpSBP16 轉基因株系(VpSBP16_l，VpSBP16_14，VpSBP16_47)的抗脅迫能力， 申請人:將播種在滲透培養基中的幼苗繼續生長直至轉基因株系和野生對照出現明顯不同的特征。結果表明，轉基因株系和野生對照在MS培養基上一直都可以正常萌發生長(圖3A)。而在鹽脅迫培養基中，所有植株萌發后都生長比較緩慢。35d后觀察所有植株的生長情況，除了萌發率顯著低于轉基因株系外，還發現野生對照在鹽脅迫培養基上根系較短，生長矮小，幼苗枯黃，基本不能形成正常的子葉且隨著時間的延長，對照不再生長逐漸枯死。而轉基因株系雖然比MS培養基上的苗子生長緩慢，但根系強壯，葉片墨綠，基本可以正常生長(圖3B)。播種在MS培養基+400mM甘露醇滲透培養基中所有種子也均表現出和鹽脅迫類似的特征(圖3C)。表明華東葡萄白河-35-1抗逆基因VpSBP16的過量表達顯著提高了擬南芥植株對滲透脅迫的抗性。
[0086]為了確定 VpSBP16 基因株系(VpSBP16-l，VpSBP16_14，VpSBP16_47)的抗鹽能力是否與根系的伸 長有關，將轉基因株系(VpSBP16-l，VpSBP16-14, VpSBP16_47)和野生對照分別種植于培養皿中垂直培養來觀察根的生長情況。植株生長14d后,在MS培養基中，轉基因株系和野生對照的根系長度沒有明顯的變化，所有植株根系都已達到4.5cm (圖4A)，而鹽脅迫培養基(即MS培養基+150mM氯化鈉、MS培養基+400mM甘露醇的滲透培養基)雖然所有植株的根系伸長都被抑制(圖4B，圖4C)，但轉基因株系(VpSBP16-l，VpSBP16_14，VpSBP16-47)的根系還是明顯長于對照，表明華東葡萄株系白河-35-1抗逆基因VpSBP16的過量表達抵消了部分鹽脅迫對植株根系伸長的抑制作用。
[0087]由于前面研究已經表明華東葡萄株系白河-35-1抗逆基因VpSBP16過量表達提高了擬南芥對甘露醇脅迫的抗性。而甘露醇是一種組織吸收劑，被認為是一種可以模擬干旱的水分脅迫因子。為了進一步測定VpSBP16轉基因株系(VpSBP16-l、VpSBP16_14、VpSBP16-47)對水分脅迫的響應， 申請人:對培養基中的轉基因株系(VpSBP16-l、VpSBP16-14、VpSBP16-47)和野生對照進行了失水處理并測定了處理結束時的電導率。結果表明三個轉基因株系(VpSBP16-l、VpSBP16-14、VpSBP16-47)在整個失水處理過程中，失水率都低于野生對照(圖5A)。在50min時，轉基因株系(VpSBP16-l、VpSBP16-14、VpSBP16_47)的失水率分別為56.99%,54.22%,53.09%,而野生對照(WT)失水率達到了 68.71%，明顯髙于轉基因植株(圖3-12A)。此外，對失水50min的所有植株測定電導率發現，轉基因株系(VpSBP16-l、VpSBP16-14、VpSBP16_47)的電導率分別為 40.04%,33.52%,29.37%,而野生對照(WT)電導率達到了 60.26%，顯著髙于轉基因株系(圖5B)。這些結果表明在失水過程中，轉基因株系受到的滲透傷害顯著低于對照，過量表達的華東葡萄株系白河-35-1抗逆VpSBP16基因提高了植株對失水處理的耐受力。
[0088]這些結果都表明華東葡萄株系白河-35-1抗逆基因VpSBP16在擬南芥中的過量表達明顯提高了植株對滲透脅迫的抗性。
[0089]實施例3:華東葡萄株系白河-35-1抗逆基因VpSBP16轉基因擬南芥T3代植株對鹽脅迫和干旱脅迫的抗性
[0090]在前面的研究中已經證明華東葡萄株系白河-35-1抗逆基因VpSBP16對模擬鹽脅迫和干旱脅迫處理以及失水處理都有積極的響應。所以 申請人:著重研究了擬南芥成年植株對各種脅迫的反應。
[0091]為了避免外界和人為因素的影響， 申請人:將轉基因植株(VpSBP16-l、VpSBP16_14、VpSBP16-47)和野生對照種植于同一營養缽中。對生長三周的成苗植株進行鹽脅迫處理后，結果顯示鹽脅迫處理一周后，轉基因植株(VpSBP16-l、VpSBP16-14、VpSBP16_47)和野生對照出現了明顯不同的性狀表現。未轉基因的野生植株都出現了較為嚴重的枯黃和皺縮現象，而轉基因株系(VpSBP16-l、VpSBP16-14、VpSBP16-47)雖然也出現了不同程度的黃斑，但生長狀態明顯好于對照(圖6)。
[0092]前面所進行的失水處理屬于短期干旱脅迫。為了進一步證明該基因在抗旱方面的功能， 申請人:對正常澆水生長14d的轉基因植株和野生對照盆栽苗進行了為期18d的干旱脅迫處理。18d后發現野生對照出現了明顯的枯萎凋零，而轉基因株系(VpSBP16-l、VpSBP16-14、VpSBP16-47)雖然也表現出了失水萎蔫，但癥狀比對照要輕。復水三天后，所有轉基因株系(VpSBP16-l、VpSBP16-14、VpSBP16-47)都開始復活，但野生對照全部死亡(圖7)。
[0093]實施例4:VpSBP16轉基因擬南芥在非生物脅迫下活性氧的產生
[0094]植物細胞長期處于逆境脅迫時，活性氧就會大量積累造成氧化傷害，導致細胞損傷甚至死亡。為了驗證華東葡`萄株系白河-35-1抗逆基因VpSBP16對于氧化脅迫的作用， 申請人:利用化學染色的方法分別檢測了在失水處理以及鹽脅迫處理后葉片或植株中超氧陰離子自由基(02._)和過氧化氫(H2O2)的水平。由圖可以明顯的看出在各種非生物脅迫下，用氯化硝基四氮唑藍液(NBT)和二氨基聯苯胺(DAB)染色后各個轉基因株系(VpSBP16-l、VpSBP16-14、VpSBP16-47)都呈現出較淺的顏色，而野生對照染色較重(圖8)。表明在脅迫處理后，與野生對照相比較轉基因株系中活性氧積累比較少，受的氧化脅迫也較小。說明華東葡萄株系白河-35-1抗逆基因VpSBP16的過量表達增強了植株的抗氧化脅迫能力。
[0095]實施例5:脅迫相關基因在野生對照和VpSBP16轉基因株系中的表達
[0096]干旱，高鹽，冷脅迫等都會引起植物缺水使植物處于水分脅迫下。為了進一步了解VpSBPie轉錄因子在植物響應各種脅迫過程中的調控作用，通過實時定量PCR檢測了一些已知功能的脅迫相關基因 AtS0S2，AtS0S3, AtFRYl, AtSADl, AtADH, AtC0R15a, AtKIN2,AtP5CSl，AtRD29B, AtCDPKl和AtCDPK2在野生對照及轉基因株系中的表達量(圖9)。
[0097]實時定量結果表明，在擬南芥中過量表達華東葡萄株系白河-35-1抗逆基因VpSBP16 提高了 AtS0S2，AtS0S3，AtC0R15a和 AtKIN2 的表達量，特別是 AtC0R15a。在三個轉基因株系(VpSBP16-l，VpSBP16-14和VpSBP16_47)中，AtC0R15a基因的表達量分別達到了野生對照的80倍，65倍和35倍；AtS0S3基因的表達量均達到了對照的10倍左右；AtS0S2基因的表達量達到了對照的4倍以上；AtKIN2基因的表達量也比對照上調了 2倍左右。而華東葡萄株系白河-35-1抗逆基因VpSBP16過量表達對于AtFRYl，AtSADl，AtADH, AtP5CSl，AtRD29B, AtCDPKl和AtCDPK2的基因表達表現出了不同程度的抑制作用。
【權利要求】
1.華東葡萄株系白河-35-1抗逆基因VpSBP16，其特征在于，其基因的編碼區序列是:
【文檔編號】C12N15/29GK103695435SQ201310562321
【公開日】2014年4月2日 申請日期:2013年11月11日 優先權日:2013年11月11日
【發明者】王西平, 侯鴻敏 申請人:西北農林科技大學