專利名稱：一種黏性末端接頭應用于側翼序列分離的方法
技術領域：
本發明涉及一種側翼序列分離的方法，尤其是涉及一種基于同尾酶設計的黏性末端接頭應用于側翼序列分離的方法
背景技術：
目前應用于側翼序列分離的方法主要有SON-PCR、TAIL-PCR及接頭-PCR。SON-PCR和TAIL-PCR是基于熱不對稱原理發明的PCR方法，這兩種方法由于第二鏈合成的隨機性，以及轉基因株系大多不是單拷貝的緣故，造成引物匹配混亂，導致獲得有用片段的效率不高。接頭-PCR方法可以大大提高有效片段的獲得，現已公布了三種接頭-PCR獲得側翼序列的方法，但都存在一些缺點，如有的方法采用平端連接接頭，使得連接效率低，不利于后期的PCR擴增；有的方法雖然使用黏性末端接頭，提高了連接效率，但可供選擇的酶的種類有限，適用范圍不廣，通用性不高；并且這幾種方法接頭合成費用都很高。

發明內容
本發明要解決的技術問題是，克服現有技術中連接效率和通用性不能兼容，成本高的不足，提供一種連接效率高，通用性高，成本低的黏性末端接頭應用于側翼序列分離的方法。本發明解決所述技術問題所采用的技術方案是，一種黏性末端接頭應用于側翼序列分離的方法，包括如下步驟
1)提取待測基因組DNA;
2)分析已知序列的酶切位點分布情況，選擇一組在已知序列中沒有酶切位點的同尾酶；設計并合成該組同尾酶對應的連接接頭；
3)在同一反應體系中，用該組同尾酶酶切待測基因組；或在不同的反應體系中，分別用同尾酶酶切基因組，形成具有相同的黏性末端的DNA片段；
4)電泳檢測酶切質量，純化后定量DNA片段濃度；將所述接頭與基因組酶切產物(即同尾酶消化的DNA片段)連接，形成“接頭-酶切片段(即同尾酶消化的DNA片段)-接頭”的DNA片段；
5)純化“接頭-酶切片段(即同尾酶消化的DNA片段)-接頭”的DNA片段，用已知序列的特異引物SI和S2與接頭序列設計的引物Al和A2對步驟2)所得“接頭-酶切片段-接頭”的DNA片段進行PCR擴增；
6)回收步驟3)獲得的片段并測序；
7)分析測序結果，獲得已知序列的未知側翼序列；
8)未知側翼序列的驗證。步驟I)中的一組同尾酶指
a 同尾酶 BamHI，Bell, BglII, Bspl43I, MboI, PsuI ；b 同尾酶 NcoI, PscI, BtgI, Ecol30I, FatI, PagI ；C 同尾酶 PstI, Alw21I, BseSI, Mphll03I, SdaI, SduI ；d 同尾酶 NdeI, Csp6I, FspBI, Trull, VspI ；e 同尾酶 NotI, Bspl20I, CfrI, Eco52I ；f 同尾酶 XhoI, BauI, Eco88I, Sail, SmoI ；g 同尾酶 XbaI, BcuI, Ecol30I, NheI, XmaJI ；h 同尾酶 SphI，Xcel，HinlII ；i 同尾酶 EcoRI, Muni, TasI, XapI ；j 同尾酶 Tati, Acc65I, BshNI, Bspl407I, Pfl23II ；k 同尾酶 BshTI, Bsaffl, Cfr9I, CfrlOI, Kpn2I, NgoMIV, SgrAI ；I 同尾酶 Hinll，Bspll9I, Bsul5I, Hin6I, HpaII, MaeII, MspI, NarI, Pspl406I,SsiI, TaqI, XmiI ；
m 同尾酶 MauBI, MluI, Paul, SgsI ；n 同尾酶 Pacl, BstKTI, SfaNI (即 AsiSI), PvuI ；
o同尾酶 SacI，Alw21I, Eco24I, SduI ；p 同尾酶 SspDI，BshNI ；q 同尾酶 Tail, AatII ；
步驟2)中所述接頭由兩條單鏈互補配對形成，形成的雙鏈能與一組同尾酶消化的所有片段連接；兩條單鏈長度都為48-52bp，形成雙鏈后一端為平端，一端帶有同一組同尾酶的互補序列；黏性端的5’端堿基磷酸化。步驟3)中，特異引物SI和特異引物S2是根據已知序列設計的嵌套引物，特異引物SI在特異引物S2的外側；特異引物SI和特異引物S2的退火溫度為70°C ±2°C。步驟3)中，引物Al和引物A2是根據接頭序列設計的兩條同向嵌套引物，與待測基因組的同源性不超過40%，引物Al在引物A2的外側；引物Al的退火溫度為60°C ±2°C，引物A2的退火溫度為70°C ±2°C。步驟3)中，所述PCR擴增包括兩輪反應，第一輪反應的引物為特異引物SI與引物Al，第二輪反應的引物為特異引物S2與引物A2 ;第一輪反應模板為酶切連接產物(即“接頭-酶切片段-接頭”片段)，反應程序為①98°C預變性3min ;②5循環(98°C 10s,70°C5-10min) ;25 循環(98°C 10s,60°C 30s, 72°C 5-lOmin)③最后延伸 72°C IOmin 4°C保存；第二輪反應模板為第一輪反應產物，反應程序為①98°C預變性3min;②35循環(980C 10s，70°C 5-10min);③延伸72°C IOmin ； 4°C保存；所用PCR酶為擴增長片段的DNA聚合酶。步驟4)中，當回收片段濃度> 20ng/yl時，將回收片段直接送交測序，測序引物為特異引物S2和引物A2 ;當回收片段濃度<20ng/yl時，先連到T載體，然后再測序。步驟6)中所述側翼序列的驗證方法為PCR方法，模板為待測基因組DNA ;上游引物根據已知序列的一端設計，下游引物根據所測側翼序列的一端設計，PCR產物大小為300-800bp ;進行普通PCR后能擴增出預期大小片段，則證明分離得到的側翼序列正確。所述引物Al 的序列為5’ - GTACAACGTGTCACTCTGGAGCAC - 3’，引物 A2 的序列為5’ - CTGGAGCACCTCTGCACGACGACCTGCGC - 3'；
特異引物SI和特異引物S2，由實驗者根據其所得已知序列設計，不同的實驗所用的特異引物不同。本發明所釆用的限制性內切酶全部為產生黏性末端的限制性內切酶，共有17組同尾酶，84種限制性內切酶(見表1)，幾乎可以應用于所有物種的基因組側翼序列的分析。為了增加所獲得側翼序列的可信度，通過幾種同尾酶之間的組合，可以對同一位點的側翼序列進行驗證，也可以獲得不同位點的側翼序列。
表I 17組同尾酶及其匹配接頭
權利要求
1.一種黏性末端接頭應用于側翼序列分離的方法，其特征在于，包括以下步驟 .1)提取待測基因組DNA; .2)分析已知序列的酶切位點分布情況，選擇一組在已知序列中沒有酶切位點的同尾酶；設計并合成該組同尾酶對應的連接接頭； .3)在同一反應體系中，用該組同尾酶酶切待測基因組；或在不同的反應體系中，分別用同尾酶酶切基因組，形成具有相同的黏性末端的DNA片段； .4)電泳檢測酶切質量，并定量DNA片段濃度；將所述接頭與基因組酶切產物連接，形成“接頭-酶切片段-接頭”的DNA片段； .5)純化“接頭-酶切片段-接頭”的DNA片段，用已知序列的特異引物SI和S2與接頭序列設計的引物Al和A2對步驟2)所得“接頭-酶切片段-接頭”的DNA片段進行PCR擴增； .6)回收步驟3)獲得的片段并測序； .7)分析測序結果，獲得已知序列的未知側翼序列； .8)未知側翼序列的驗證。
2.根據權利要求I所述的黏性末端接頭應用于側翼序列分離的方法，其特征在于，步驟I)中的一組同尾酶指a 同尾酶 BamHI，Bell, BglII, Bspl43I, MboI, PsuI ；b 同尾酶 NcoI, PscI, BtgI, Ecol30I, FatI, PagI ；c 同尾酶 PstI, Alw21I, BseSI, Mphll03I, SdaI, SduI ；d 同尾酶 NdeI, Csp6I, FspBI, Trull, VspI ；e 同尾酶 NotI, Bspl20I, CfrI, Eco52I ；f 同尾酶 XhoI, BauI, Eco88I, Sail, SmoI ；g 同尾酶 XbaI, BcuI, Ecol30I, NheI, XmaJI ； h 同尾酶 SphI，Xcel，HinlII ；i 同尾酶 EcoRI, Muni, TasI, XapI ；j 同尾酶 Tati, Acc65I, BshNI, Bspl407I, Pfl23II ；k 同尾酶 BshTI, Bsaffl, Cfr9I, CfrlOI, Kpn2I, NgoMIV, SgrAI ；I同尾酶 Hinll，Bspll9I, Bsul5I, Hin6I, HpaII, MaeII, MspI, NarI, Pspl406I,SsiI, TaqI, XmiI ；m 同尾酶 MauBI, MluI, Paul, SgsI ；n 同尾酶 Pacl, BstKTI, SfaNI, PvuI ；o 同尾酶 SacI，Alw21I, Eco24I, SduI ；p 同尾酶 SspDI，BshNI ；q 同尾酶 Tail, AatII0
3.根據權利要求I或2所述的黏性末端接頭應用于側翼序列分離的方法，其特征在于，步驟2)中所述接頭由兩條單鏈互補配對形成，形成的雙鏈能與一組同尾酶消化的所有片段連接；兩條單鏈長度為48-52bp，形成雙鏈后一端為平端，一端帶有同一組同尾酶的互補序列；黏性端的5’端堿基磷酸化。
4.根據權利要求I或2所述的黏性末端接頭應用于側翼序列分離的方法，其特征在于，步驟3)中，特異引物SI和特異引物S2是根據已知序列設計的嵌套引物，特異引物SI在特異引物S2的外側；特異引物SI和特異引物S2的退火溫度為70°C ±2°C。
5.根據權利要求I或2所述的黏性末端接頭應用于側翼序列分離的方法，其特征在干，步驟3)中，引物Al和引物A2是根據接頭序列設計的兩條同向嵌套引物，與待測基因組的同源性不超過40%，引物Al在引物A2的外側；引物Al的退火溫度為60°C ±2°C，引物A2的退火溫度為70°C ±2°C。
6.根據權利要求I或2所述的黏性末端接頭應用于側翼序列分離的方法，其特征在于，步驟3)中，所述PCR擴增包括兩輪反應，第一輪反應的引物為特異引物SI與引物 Al，第二輪反應的引物為特異引物S2與引物A2 ;第一輪反應模板為酶切連接產物，反應程序為① 98°C預變性 3min ;② 5 循環(98°C 10s, 70°C 5-lOmin) ;25 循環(98°C 10s, 60°C30s, 72 °C 5-10min)③最后延伸72°C IOmin 4°C保存；第二輪反應模板為第一輪反應產物，反應程序為①98°C預變性3min;②35循環(98°C 10s，70°C 5-10min);③延伸72 °C IOmin 4°C保存；所用PCR酶為擴增長片段的DNA聚合酶。
7.根據權利要求I或2所述的黏性末端接頭應用于側翼序列分離的方法，其特征在干，步驟4)中，當回收片段濃度> 20ng/yl時，將回收片段直接送交測序，測序引物為特異引物S2和引物A2 ;當回收片段濃度< 20ng/y I時，先連到T載體，然后再測序。
8.根據權利要求I或2所述的黏性末端接頭應用于側翼序列分離的方法，其特征在干，步驟6)中所述側翼序列的驗證方法為PCR方法，模板為待測基因組DNA ;上游引物根據已知序列的一端設計，下游引物根據所測側翼序列的一端設計，PCR產物大小為300-800bp ；進行普通PCR后能擴增出預期大小片段，則證明分離得到的側翼序列正確。
全文摘要
一種黏性末端接頭應用于側翼序列分離的方法，包括以下步驟1)提取待測基因組DNA；2)選擇同尾酶；設計并合成對應的連接接頭；3)用同尾酶酶切基因組，形成具有相同的黏性末端的DNA片段；4)電泳檢測酶切質量，并定量DNA片段濃度；將所述接頭與基因組酶切產物連接，形成“接頭-酶切片段-接頭”的DNA片段；5)純化“接頭-酶切片段-接頭”的DNA片段，PCR擴增；6)回收步驟3)獲得的片段并測序；7)分析測序結果，獲得已知序列的未知側翼序列；8)未知側翼序列的驗證。本發明之側翼序列分離的方法，連接效率高，通用性高，成本低。
文檔編號C12N15/10GK102634506SQ20121009739
公開日2012年8月15日 申請日期2012年4月6日 優先權日2012年4月6日
發明者余東, 劉瑞芬, 孫學武, 孫志忠, 段美娟, 袁光杰, 袁定陽, 袁貴龍, 袁隆平, 譚炎寧, 趙炳然 申請人:湖南雜交水稻研究中心