區分赤霉病受感小麥產毒素類型的lamp引物組及其應用的制作方法
【專利摘要】本發明涉及一種區分赤霉病受感小麥產毒素類型的LAMP引物組，由檢測產DON毒素和檢測產NIV毒素的LAMP引物組成，其中：檢測產DON毒素的LAMP引物為：SEQIDNo.1所示的正向內引物、SEQIDNo.2所示的反向內引物、SEQIDNo.3所示的正向外引物、SEQIDNo.4所示的反向外引物；檢測產NIV毒素的LAMP引物為：SEQIDNo.5所示的正引向內物、SEQIDNo.6所示的反向內引物、SEQIDNo.7所示的正向外引物、SEQIDNo.8所示的反向外引物。應用中分別利用含檢測產DON毒素的LAMP引物的試劑盒A和檢測產NIV毒素的LAMP引物的試劑盒B同時對提取的禾谷鐮刀菌的DNA進行平行的LAMP擴增，根據擴增結果直觀區分赤霉病受感小麥產毒素類型。
【專利說明】區分赤霉病受感小麥產毒素類型的LAMP引物組及其應用
【技術領域】
[0001]本發明屬與基因工程領域，涉及一種區分赤霉病受感小麥產毒素類型的LAMP引物組及其應用。
【背景技術】
[0002]由鐮刀菌引起的赤霉病(Fusarium head blight or scab)是危害小麥、大麥、燕麥、玉米等多種禾谷類作物的一種重要病害，在小麥上尤其嚴重，主要集中在小麥開花期侵染，在種子灌漿成熟期致病，不僅造成產量減產，同樣鐮刀菌產生的毒素存留并累積在作物籽粒中，影響谷物的產量和質量。在我國，禾谷鐮刀菌(Fusariumgraminearum Schwabe)是赤霉病的主要病原菌，其產生B型單端孢霉烯族毒素，主要包括脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(Deoxynivalenol,簡稱DON )和雪腐鐮刀菌烯醇(Nivalenol,簡稱NIV)。而且這兩種毒素對人畜具有高度危害性，致使人和動物出現嘔吐、腹瀉、頭暈等癥狀，因而準確快速鑒別小麥赤霉病菌產DON或NIV毒素的類型對小麥產前和產后的管理及品質評價具有指導作用。
[0003]小麥赤霉病菌產毒素類型的檢測方法有三種，一是化學測定法，該方法需要昂貴的儀器設備及復雜的樣品純化制備程序、所需時間長、技術含量要求也較高；二是免疫法，該方法操作簡單，費用較低，但因為檢測出的毒素中常含有一些其它衍生物，所以測定的結果往往偏高；三是PCR 法，該方法需要特定PCR儀器、反應時間相對長，且結果需瓊脂糖電泳-EB檢測，易引起EB環境污染等問題。
[0004]而環式等溫擴增(LAMP:loop-mediated isothermal amplification)技術是在核酸檢測的基礎上進一步提高靈敏度的方法，具有等溫擴增、不需要特定PCR儀器、反應時間短等優點，對擴增結果的檢測，僅需添加熒光染料，通過肉眼觀察顏色變化來判定結果，從而實現快速擴增、簡便檢測的核酸檢測方法；該方法簡便、結果可靠，可廣泛用于植物檢疫、食品安全檢測分析。但是將其用于毒素分類并未見報道。

【發明內容】

[0005]本發明的目的是，提供區分赤霉病受感小麥產DON或NIV毒素的LAMP引物組及其應用。
[0006]本發明的目的是通過如下技術方案實現:一種區分赤霉病受感小麥產毒素類型的LAMP引物組，其特征在于:LAMP引物組由檢測產DON毒素的LAMP引物和檢測產NIV毒素的LAMP引物組成，其中:檢測產DON毒素的LAMP引物為:SEQ ID N0.1所示的正向內引物D0N-FIP、SEQ ID N0.2所示的反向內引物D0N_BIP、SEQ ID N0.3所示的正向外引物D0N-F3、SEQ ID N0.4所示的反向外引物D0N-B3 ;檢測產NIV毒素的LAMP引物為:SEQ ID N0.5所示的正引向內物NIV-FIP、SEQ ID N0.6所示的反向內引物NIV_BIP、SEQ ID N0.7所示的正向外引物NIV-F3、SEQ ID N0.8所示的反向外引物NIV-B3組成的。
[0007]一種上述LAMP引物組的應用，其特征在于:a)將檢測毒素DON的LAMP引物建立試劑盒A，將檢測毒素NIV的LAMP引物建立試劑盒B ；
b)分離赤霉病受感小麥的禾谷鐮刀菌，提取該禾谷鐮刀菌的DNA，以提取的DNA為模板，分別利用試劑盒A和試劑盒B同步進行平行的LAMP擴增；
c)平行LAMP擴增產物分別進行瓊脂糖凝膠電泳，在紫外光下檢測結果，存在梯度彌散性條帶為陽性；或分別在擴增產物中添加SYBR Green，顏色變為綠色的為陽性，顏色保持橙色不變的為陰性；
d)根據c步驟的檢測結果直觀區分，試劑盒A呈陽性的赤霉病受感小麥產DON毒素，試劑盒B呈陽性的赤霉病受感小麥產NIV毒素，試劑盒A和試劑盒B均呈陰性的赤霉病受感小麥即不產DON毒素也不產NIV毒素。
[0008]在上述LAMP引物組的應用中:所述的試劑盒A包含:1.6μ M的SEQ ID N0.1、1.6 μ M 的 SEQ ID N0.2、0.2 μ M 的 SEQ ID N0.3、0.2 μ M 的 SEQ ID N0.4、1.6mM 的 dNTPs、IM 的 betaine、20mM 的 Tris-HCl、10ml^3 KClUOmM 的(MM)2SO4、4mM 的 MgS04、0.1% 的Triton X_100、8U Bst DNA polymerase 500 單位,制備成檢測溶液,其中 Tris-HCl 的 pH為8.8 ;所述的試劑盒 B 包含:1.6μΜ 的 SEQ ID N0.5、1.6 μ M 的、SEQ ID N0.6、0.2 μ M 的 SEQID N0.7、0.2μΜ 的 SEQ ID N0.8,1.6mM 的 dNTPs、IM 的 betaine、20mM 的 Tris-HCl、IOmM的 KClUOmM 的(MM)2SO4、4mM 的 MgS04、0.1% 的 Triton X_100、8U Bst DNA polymerase500單位，制備成檢測溶液，其中Tris-HCl的pH為8.8。
[0009]在上述LAMP引物組的應用中:提取待檢測微生物的DNA，以提取的DNA為模板，分別利用試劑盒A和試劑盒B同步進行平行的LAMP擴增是指:提取待檢微生物的DNA，同時取I μ I DNA溶液，分別加入24 μ I的試劑盒A或試劑盒B檢測溶液中同步進行LAMP，LAMP反應條件均為:60-65°C，60-90min ;80°C，10min。
[0010]在上述LAMP引物組的應用中:試劑盒A的LAMP反應條件優選64°C，60min ;80°C，IOmin ;試劑盒 B 的 LAMP 反應條件優選 62°C，60min ;80°C，lOmin。
[0011]本發明的優點在于:采用環式等溫擴增(LAMP)技術對是在核酸檢測的基礎上進一步提高靈敏度的方法，具有等溫擴增、不需要特定PCR儀器、反應時間短等優點，對擴增結果的檢測，僅需添加熒光染料，通過肉眼觀察顏色變化來判定結果，從而實現快速擴增、簡便檢測的核酸檢測方法，實現對受感小麥產DON或NIV毒素分類。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0012]圖1 (a)和圖1 (b)是通過試劑盒A的LAMP擴增檢測對小麥赤霉病菌產DON毒素類型的靈敏性；圖1 (a) LAMP擴增產物的瓊脂糖電泳圖(M:DL2000 DNA Marker[DNA分子量標準，最大條帶為2000bp]，l-7依次為25 μ I的反應體系中分別含有100ng、10ng、lng、100pg、10pg、lpg、100fg DNA的擴增結果);圖1(b) LAMP擴增產物的顏色顯色圖(25 μ I的反應體系中分別含有100ng、10ng、lng、IOOpgUOpg小麥赤霉病菌DNA的反應管顯綠色，呈陽性反應；25μ I的反應體系中分別含有O[水]、lpg、100fg小麥赤霉病菌DNA的反應管顯橙色，呈陰性反應)。
[0013]圖2 (a)和圖2 (b)是通過試劑盒B的LAMP擴增檢測對小麥赤霉病菌產NIV毒素類型的靈敏性；圖2(a) LAMP擴增產物的瓊脂糖電泳圖(M:DL2000 DNA Marker[DNA分子量標準，最大條帶為2000bp]，l-7依次為25 μ I的反應體系中分別含有lOOng、10ng、lng、100pg、10pg、lpg、100fg DNA的擴增結果);圖2 (b) LAMP擴增產物的顏色顯色圖(25 μ I的反應體系中分別含有lOOng、10ng、lng、IOOpgUOpg小麥赤霉病菌DNA的反應管顯綠色，呈陽性反應；25μ I的反應體系中分別含有O[水]、lpg、100fg小麥赤霉病菌DNA的反應管顯橙色，呈陰性反應)。
[0014]圖3是試劑盒A的LAMP擴增驗證對小麥赤霉病菌產DON毒素類型的可靠性(1_7依次為 JS18、JS1217、A17、JS08、68、127 和 117)。
[0015]圖4是LAMP驗證試劑盒B對小麥赤霉病菌產NIV毒素類型的可靠性(1-7依次為JS18、JS1217、A17、JS08、68、127 和 117)。
【具體實施方式】
[0016]結合具體實施例對本發明作進一步說明。
[0017]實施例1
試劑盒A是檢測小麥赤霉病菌產DON毒素類型的LAMP，它包括:
SEQ ID N0.1，正向內引物 DON-FIP:
5’-TCAACTACCGGCTGCTAGTAGATAGTGGATACGTCTTCCAGGA-3，
SEQ ID N0.2，反向內引物 DON-BIP:
5’-CCTGCCATGTAGAGGTGAGGAGC AGGGGAAGCACAATTGAGATC-3，
SEQ ID N0.3，正向外引物 D0N-F3:
5’-ACAGTTATTCCAAACAGTTCG-3’
SEQ ID N0.4，反向外引物 D0N-B3:
5’-TGACAAGTCCGGTCGCAC-3’
在制備的檢測溶液中:1.6μΜ正向內引物D0N-FIP、1.6yM反向內引物D0N-BIP、
0.2μΜ 正向外引物 D0N-F3、0.2μΜ 反向外引物 D0N-B3、1.6mM dNTPs、IM betaine、20mMTris-HCl (pH8.8)UOmM KClUOmM (NH4) 2S04、4mM MgS04、0.l%Triton X_100、8U Bst DNApolymerase 500 單位。
[0018]實施例2
試劑盒B檢測小麥赤霉病菌產NIV毒素類型的LAMP，它包括:
SEQ ID N0.5，正向內引物 NIV-FIP:
5’-CTATCTGCAGAACTCGAATTGCTCCATATCACTCACATATCCAT-3’
SEQ ID N0.6，反向內引物 NIV-BIP:
5’-ACATCGTCCAGGATGTAGTCTAGCAGGCTCAAGGTAAAGCG-3，
SEQ ID N0.7，正向外引物 NIV-F3:
5’-CACCTTGATGTGGTTGCC-3’
SEQ ID N0.8，反向外引物 NIV-B3:
5’-GCATACATAGTACTGGCGAT-3’
在制備的檢測溶液中:1.6μΜ正向內引物NIV-FIP、1.6yM反向內引物NIV-BIP、0.2 μ M 正向外弓 I 物 NIV-F3、0.2 μ M 反向外引物 NIV-B3、I.6mMdNTPs、IM betaine、20mMTris-HCl (pH8.8)UOmM KClUOmM (NH4) 2S04、4mM MgS04、0.l%Triton X_100、8U Bst DNApolymerase 500 單位。
[0019]實施例3在LAMP反應中驗證試劑盒A對小麥赤霉病菌產DON毒素類型的靈敏性。
[0020]為了驗證LAMP方法的靈敏性，選擇已知產DON毒素的菌株JS05，用分光光度計測濃度后(I μ g/ul)后，進行10倍比稀釋后作為模板，分別取稀釋后的各濃度DNA I μ I溶液，加入24 μ I實施例1制備的檢測溶液進行LAMP反應，反應條件為64°C，60min, 80°C，IOmin ；反應結束后，LAMP反應液4μ I進行電泳檢測，結果顯示:1-5號泳道為含有lOOng、10ng、lng、100pg、10pg DNA的擴增結果，它們有明顯彌散性條帶，6_7泳道為含有IpgUOOfgDNA的擴增結果，它們和陰性對照水沒有條帶，電泳結果表明LMAP反應的靈敏度達到IOng ;在反應結束后，加入染料SYBR Green后觀察顏色變化，其中1-5號管為含有lOOng、10ng、lng、IOOpgUOpg DNA的擴增結果，它們的顏色變為綠色，6-7號管為含有IpgUOOfgDNA的擴增結果，它們和陰性對照水結果相同，為橙色；通過顏色變化判定結果證明，試劑盒A對產DON毒素菌的檢測靈敏度也達到IOpg (圖1 (a)和圖1 (b))。
[0021]實施例4在LAMP反應中驗證試劑盒B對小麥赤霉病菌產NIV毒素類型的靈敏性。
[0022]為了驗證LAMP方法的靈敏性，選擇已知產NIV毒素的菌株JS70，用分光光度計測濃度后(I μ g/ul)后，進行10倍比稀釋后作為模板，分別取稀釋后的各濃度DNA I μ I溶液，加入24 μ I實施例2制備的檢測溶液進行LAMP反應，反應條件為62°C，60min, 80°C，IOmin ；反應結束后取LAMP反應液4μ I進行電泳檢測，結果顯示，1-4號泳道為含有lOOng、10ng、lng、IOOpg DNA的擴增結果，它們都有明顯彌散性條帶，5號泳道為含有IOpg DNA的擴增結果，它的條帶弱，6-7為含有IpgUOOfgDNA的擴增結果，它們和陰性對照水沒有條帶，電泳結果表明LMAP反應的靈敏度達到10ng。在反應結束后，加入染料SYBR Green后觀察顏色變化，其中1-4號管為含有lOOng、10ng、lng、IOOpg DNA的擴增結果，它們顏色變為綠色，5號為含有IOpg DNA的擴增結果，它的顏色為淡綠，6-7為含有lpg、IOOfgDNA的擴增結果，它們和陰性對照水結果相同，為橙·色；通過顏色變化判定結果表明，試劑盒B對產NIV毒素菌的檢測靈敏度也達到IOpg (圖2 (a)和圖2 (b))。
[0023]實施例5在LAMP反應中驗證試劑盒A對小麥赤霉病菌產DON毒素類型的可靠性 為了驗證試劑盒A在LAMP方法中的可靠性，選擇已知產DON毒素的菌株JS18、JS1217、
A17 (從病麥粒中分離得到的是不同的禾谷鐮刀菌菌株)和一個不產DON和NIV毒素的菌株JS08以及產NIV毒素的菌株68、127、117 (從病麥粒中分離得到的是不同的禾谷鐮刀菌菌株)，分別提取微生物的DNA作為模板，分別取I μ I DNA溶液，加入24 μ I實施例1制備的試劑盒A進行LAMP反應，反應條件為64°C，60min, 80°C，IOmin ;反應結束后，每管加入2 μ ISYBR Green，觀察顏色變化，結果顯示1_3號管對應產毒素菌株JS18、JS1217、A17，它們的顏色均為綠色，證實它們是產DON毒素的，實驗結果與實際情況相符，4-7管對應產毒素菌株為JS08、68、127和117，它們以及水顏色為橙色，證實不產DON毒素，也與實際情況相符(附圖3)。
[0024]實施例6在LAMP反應中驗證試劑盒B對小麥赤霉病菌產NIV毒素類型的可靠性 同實施例5—致，同樣選擇已知產DON毒素的菌株JS18、JS1217、A17 (從病麥粒中分
離得到的不同的禾谷鐮刀菌菌株)和一個不產DON和NIV毒素的菌株JS08以及產NIV毒素的菌株68、127、117 (從病麥粒中分離得到的是不同的禾谷鐮刀菌菌株)，分別提取微生物的DNA作為模板，分別取I μ I DNA溶液，加入24 μ I實施例2制備的試劑盒B進行LAMP反應，反應條件為62°C:，60min，80°C:，10min;反應結束后，每管加入2 μ 1 SYBR Green，觀察顏色變化，結果顯示5-7號管對應產毒素菌株68、127、117，它們的顏色變為綠色，證實是產NIV毒素，實驗結果與實際情況相符，1-4管對應產毒素菌株為JS18、JS1217、A17和JS08，它們及水顏色為橙色，證實不產NIV毒素，也與實際情況相符(附圖4)。
[0025]實施例7利用試劑盒A和試劑盒B從赤霉病的感病小麥粒中對赤霉病菌產毒素類型進行分類的方法
從未知赤霉病菌產毒類型的赤霉病感病小麥鑒定產毒類型的方法，包括:
感病小麥粒中禾谷鐮刀菌的分離:
把采回的小麥赤霉病病穗籽粒用70%乙醇表面消毒，在滅菌濾紙上晾干，放到PDA培養基上于25°C恒溫培養。培養2-3天后，待培養基長出紅色菌落，得到病原菌的初分離物。將PDA培養基上培養得到的初分離物用滅菌過的挑針挑取少量至綠豆湯培養基中，25°C175r/min下震蕩培養，4-5天后可產生分生孢子。吸取10 μ L孢子懸浮液，沿著PDA平板底部的一條直線在培養基上均勻畫線，25°C恒溫培養24h，取單一菌落，轉移至新的PDA平板中，25°C恒溫培養，即得到純化的菌株。
[0026]從禾谷鐮刀菌中提取DNA:
a)用滅菌牙簽刮取PDA平板上的小麥赤霉菌絲少量，裝入1.5 ml滅菌離心管中；
b)加入150 μ ILysis buffer [Lysis buffer (pH 8.0) =Tris-HCl 200 mM、EDTA 50mM、NaCl 20 mM、SDS 1%],用帶有玻璃鉆頭的電鉆研磨I min ;再加入350μ ILysisbuffer沖洗鉆頭，渦旋混勻后室溫放置10 min ；
c)12000 rpm,4°C離心10 min,吸取上清液轉入新1.5 ml離心管中；
d)加入等體積無水乙醇，顛倒混勻，-20°C冰箱放置120 min;
e)12000 rpm，4°C離心 10 min ；
f)沉淀用70%乙醇洗滌，12000 rpm，4°C離心1 min，倒掉液體，晾干至無酒精味；
g)加入50μ I1ddH20溶解，用于LAMP擴增的模板。
[0027]小麥赤霉病菌產毒素類型的LAMP檢測:
小麥赤霉病菌產DON毒素類型的LAMP檢測:同時取1 μ 1DNA溶液，分別加入實例I所述的試劑盒A和實施例2所述的試劑盒B ;其中:
試劑盒A的總體積為25 μ 1 ;反應條件為:64°C,60min ；80°C, 1Omin ;擴增結束后添加2 μ I1SYBR Green,顏色呈現綠色，以此判斷產DON毒素；顏色是沒有變化的橙色,則判斷小麥赤霉病不產DON毒素。
[0028]試劑盒B 的總體積為 25ul ;反應條件為:62°C，60min ;80°C，IOmin ;以 SYBR Green作為反應指示劑，擴增結束后產NIV毒素的LAMP反應體系的顏色呈現綠色，以此判斷小麥赤霉病菌產NIV毒素；顏色是沒有變化的橙色，則判斷小麥赤霉病不產DON毒素。
[0029]利用本實施例的方法，采集源于江蘇鹽城、南京、無錫的自編號分別為001、002、
003、004、005、006、007、008、009、010、011、012、013、014、015、016、017、018、019、020 的未知赤霉病菌產毒類型的赤霉病感病小麥進行實驗室分類，其結果記錄在表1中表示不產DON和NIV毒素)。
[0030]表1鑒定赤霉病菌產毒素類型統計
【權利要求】
1.一種區分赤霉病受感小麥產毒素類型的LAMP引物組，其特征在于:LAMP引物組由檢測產DON毒素的LAMP引物和檢測產NIV毒素的LAMP引物組成，其中:檢測產DON毒素的LAMP弓丨物為:SEQ ID N0.1所示的正向內引物DON-FIP、SEQ ID N0.2所示的反向內引物D0N-BIP、SEQ ID N0.3所示的正向外引物D0N-F3和SEQ ID N0.4所示的反向外引物D0N-B3 ;檢測產NIV毒素的LAMP引物為:SEQ ID N0.5所示的正引向內物NIV_FIP、SEQ IDN0.6所示的反向內引物NIV-BIP、SEQ ID N0.7所示的正向外引物NIV-F3和SEQ ID N0.8所示的反向外引物NIV-B3。
2.—種權利要求1所述LAMP引物組的應用，其特征在于: a)將檢測毒素DON的LAMP引物建立試劑盒A，將檢測毒素NIV的LAMP引物建立試劑盒B ； b)分離赤霉病受感小麥的禾谷鐮刀菌，提取該禾谷鐮刀菌的DNA，以提取的DNA為模板，分別利用試劑盒A和試劑盒B同步進行平行的LAMP擴增； c)平行LAMP擴增產物分別進行瓊脂糖凝膠電泳，在紫外光下檢測結果，存在梯度彌散性條帶為陽性；或分別在擴增產物中添加SYBR Green，顏色變為綠色的為陽性，顏色保持橙色不變的為陰性； d)根據c步驟的檢測結果直觀區分，試劑盒A呈陽性的赤霉病受感小麥產DON毒素，試劑盒B呈陽性的赤霉病受感小麥產NIV毒素，試劑盒A和試劑盒B均呈陰性的赤霉病受感小麥即不產DON毒素也不產NIV毒素。
3.權利要求2所述LAMP引物組的應用，其特征在于:所述的試劑盒A包含:1.6 μ M的 SEQ ID N0.1、1.6μ M 的 SEQ ID N0.2、0.2μΜ 的 SEQ ID N0.3、0.2μΜ 的 SEQ ID N0.4、1.6mM 的 dNTPs、lM 的 betaine、20mM 的 Tris-HCl、10ml^3 KClUOmM 的(NH4) 2S04、4mM的 MgS04、0.1% 的 Triton X_100、8U Bst DNA polymerase 500 單位，制備成檢測溶液，其中 Tris-HCl 的 pH為 8.8 ;所述的試劑盒 B包含:L 6μ M 的 SEQ ID N0.5、1.6 μ M 的 SEQ IDN0.6、0.2μΜ的 SEQ ID N0.7、0.2 μ M 的 SEQ ID N0.8,1.6mM 的 dNTPs、IM 的 betaine、20mM的 Tris-HClUOmM 的 KClUOmM 的(NH4) 2S04、4mM 的 MgS04、0.1% 的 Triton X_100、8U BstDNA polymerase 500單位，制備成檢測溶液，其中Tris-HCl的pH為8.8。
4.根據權利要求2或3所述的LAMP引物組的應用，其特征在于:提取待檢測微生物的DNA,以提取的DNA為模板，分別利用試劑盒A和試劑盒B同步進行平行的LAMP擴增是指:提取待檢微生物的DNA，同時取I μ I DNA溶液，分別加入24 μ I的試劑盒A和試劑盒B的檢測溶液中同步進行LAMP擴增，它們的LAMP反應條件均為:60_65°C，60_90min ;80°C，lOmin。
5.根據權利要求4所述的LAMP引物組的應用，其特征在于:試劑盒A的LAMP反應條件優選 640C，60min ；80°C，IOmin ;試劑盒 B 的 LAMP 反應條件優選 62°C，60min ；80°C，IOmin0
【文檔編號】C12Q1/68GK103589800SQ201310580088
【公開日】2014年2月19日 申請日期:2013年11月19日 優先權日:2013年11月19日
【發明者】邢宇俊, 仇劍波, 史建榮, 徐劍宏, 吳季榮 申請人:江蘇省農業科學院