一種檢測(cè)煙草黑脛病菌對(duì)殺菌劑敏感性的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種檢測(cè)煙草黑脛病菌對(duì)殺菌劑敏感性的方法，包括以下步驟：用利馬豆液體培養(yǎng)基或燕麥液體培養(yǎng)基稀釋烯酰嗎啉配置各種質(zhì)量濃度的藥劑；將煙草黑脛病菌在利馬豆固體培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)，經(jīng)V8液體培養(yǎng)基誘導(dǎo)得到游動(dòng)孢子懸浮液，將其濃度調(diào)整為1×104個(gè)/mL；將96孔微孔板置于監(jiān)控培養(yǎng)箱中，28℃黑暗條件下培養(yǎng)72h，采用生長(zhǎng)曲線監(jiān)控軟件讀取0-72h小時(shí)黑脛病菌生長(zhǎng)曲線的數(shù)據(jù)；培養(yǎng)0和72h時(shí)，采用濁度測(cè)定軟件測(cè)定590nm每孔黑脛病菌的OD值，按照公式(1)計(jì)算殺菌劑對(duì)黑脛病菌孢子萌發(fā)、菌絲生長(zhǎng)的抑制率，并計(jì)算藥劑對(duì)菌株的EC50值。本發(fā)明檢測(cè)煙草黑脛病菌對(duì)殺菌劑敏感性簡(jiǎn)便、快速、高效、準(zhǔn)確。
【專利說明】一種檢測(cè)煙草黑脛病菌對(duì)殺菌劑敏感性的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體來說涉及一種檢測(cè)煙草黑脛病菌對(duì)殺菌劑敏感性的方法。
[0002]
【背景技術(shù)】
[0003]由煙草黑胚病菌(Phytophthoraparasitica var.nicotianae)引起的煙草黑胚病是世界范圍內(nèi)煙草危害最為嚴(yán)重的病害之一，在煙草整個(gè)生育期內(nèi)均可侵染煙草根系、莖桿以及葉片等多個(gè)組織，通常導(dǎo)致根系壞死、葉片黃化、植株萎蔫、甚至枯死等癥狀。在不采取防治措施的情況下，損失可以達(dá)到100%。目前，煙草黑脛病的防治主要依賴化學(xué)農(nóng)藥，且防治藥劑品種較為單一。苯基酰胺類殺菌劑甲霜靈在煙草上已連續(xù)使用多年，抗藥性問題日益突出，防治效果逐漸降低，及時(shí)進(jìn)行快速高效的敏感性檢測(cè)是黑脛病抗藥性治理的必要前提。此外，新型化學(xué)殺菌劑的開發(fā)需要采用室內(nèi)生物測(cè)定的方法對(duì)病原菌的生物活性進(jìn)行高通量篩選。病原真菌傳統(tǒng)的室內(nèi)生物測(cè)定方法有孢子萌發(fā)法和菌絲生長(zhǎng)速率法。前者通常采用“載玻片法”和“營(yíng)養(yǎng)瓊脂法”，但都涉及顯微鏡下觀察，計(jì)數(shù)較麻煩；后者通常采用“培養(yǎng)皿培養(yǎng)法”，但測(cè)試時(shí)間較長(zhǎng)、工作量大。兩種方法很難作為大批量病原菌敏感性檢測(cè)和高通量篩選殺菌化合物的方法。尋找簡(jiǎn)便、快速、高效和準(zhǔn)確的生物測(cè)定方法成為國(guó)內(nèi)、外病原菌敏感性測(cè)定和殺菌劑高通量篩選的重要目標(biāo)。
[0004]微孔板法(MicropLate method)是利用監(jiān)控培養(yǎng)箱(BioLog OminLog)培養(yǎng)待測(cè)病原菌、生長(zhǎng)曲線監(jiān)控軟件(OminLog-PM)獲取病原菌的生長(zhǎng)曲線，濁度測(cè)定軟件(Microstation)快速檢測(cè)微孔板(96孔)中菌懸液的OD值，以O(shè)D增加值作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，用空白對(duì)照組與藥劑處理組OD增加值的差值來計(jì)算藥劑抑制率的方法。這種方法既能夠獲得藥劑選擇下病原菌的生長(zhǎng)曲線，又能測(cè)得病原菌對(duì)化學(xué)殺菌劑的敏感性。Gerd曾用YBA培養(yǎng)液測(cè)定了啶酰菌胺對(duì)灰霉病菌孢子萌發(fā)及菌絲生長(zhǎng)的綜合抑制效果，但該方法僅能獲得病原菌生長(zhǎng)的濁度值，不能反映病原菌生長(zhǎng)的具體動(dòng)態(tài)特征。
[0005]
【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的在于克服上述問題而提供的一種簡(jiǎn)便、快速、高效、準(zhǔn)確的檢測(cè)煙草黑脛病菌對(duì)殺菌劑敏感性的方法。
[0007]本發(fā)明的一種檢測(cè)煙草黑脛病菌對(duì)殺菌劑敏感性的方法，包括以下步驟:
(1)用利馬豆液體培養(yǎng)基或燕麥培養(yǎng)基稀釋烯酰嗎啉，配置各種質(zhì)量濃度的藥劑；
(2)將煙草黑脛病菌在利馬豆固體培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)4d，取菌落1/3處直徑為5mm的菌絲塊10塊，放入盛有20mL10%V8培養(yǎng)液培養(yǎng)皿中，光照培養(yǎng)4d后菌絲表面形成大量的孢子囊；將形成孢子囊的黑脛病平板置于4°C冰箱低溫處理30min，然后再置于室溫2h，從溶液中收集游動(dòng)孢子懸浮液，將其濃度調(diào)整為I X 104個(gè)/mL，貯存、待用；(3)8通道電動(dòng)移液器將8種不同質(zhì)量濃度的藥劑每孔140 μ L加入到96孔微孔板中，并設(shè)置空白對(duì)照組；無菌條件下，在96孔微孔板中每孔加入I X IO4個(gè)/mL的游動(dòng)孢子懸浮液IOyL;蓋好96孔板板蓋，將96孔微孔板置于監(jiān)控培養(yǎng)箱(BioLog OminLog)中，28°C黑暗條件下培養(yǎng)72h，采用生長(zhǎng)曲線監(jiān)控軟件(OminLog-PM)讀取0_72h小時(shí)黑脛病菌生長(zhǎng)曲線的數(shù)據(jù)；培養(yǎng)O和72h時(shí)，采用濁度測(cè)定軟件(Microstation)測(cè)定590nm每孔黑脛病菌的OD值(處理O和72h的吸光度值分別記為ODtl和OD72)，按照公式(I)計(jì)算殺菌劑對(duì)黑脛病菌孢子萌發(fā)的抑制率，并計(jì)算藥劑對(duì)菌株孢子萌發(fā)的EC5tl值。
【權(quán)利要求】
1.一種檢測(cè)煙草黑脛病菌對(duì)殺菌劑敏感性的方法，包括以下步驟: (1)用利馬豆液體培養(yǎng)基或燕麥培養(yǎng)基稀釋烯酰嗎啉，配置各種質(zhì)量濃度的藥劑； (2)將煙草黑脛病菌在利馬豆固體培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)4d，取菌落1/3處直徑為5mm的菌絲塊10塊，放入盛有20mL10%V8培養(yǎng)液培養(yǎng)皿中，光照培養(yǎng)4d后菌絲表面形成大量的孢子囊；將形成孢子囊的黑脛病平板置于4°C冰箱低溫處理30min，然后再置于室溫2h，從溶液中收集游動(dòng)孢子懸浮液，將其濃度調(diào)整為I X IO4個(gè)/mL，貯存、待用； (3)8通道電動(dòng)移 液器將8種不同質(zhì)量濃度的藥劑每孔140μ L加入到96孔微孔板中，并設(shè)置空白對(duì)照組；無菌條件下，在96孔微孔板中每孔加入I X IO4個(gè)/mL的游動(dòng)孢子懸浮液10μ L ;蓋好96孔板板蓋,將96孔微孔板置于監(jiān)控培養(yǎng)箱中，28°C黑暗條件下培養(yǎng)72h,采用生長(zhǎng)曲線監(jiān)控軟件讀取0-72h小時(shí)黑脛病菌生長(zhǎng)曲線的數(shù)據(jù)；培養(yǎng)O和72h時(shí)，采用濁度測(cè)定軟件測(cè)定590nm每孔黑脛病菌的OD值(處理O和72h的吸光度值分別記為ODtl和OD72),按照公式(I)計(jì)算殺菌劑對(duì)黑脛病菌孢子萌發(fā)的抑制率，并計(jì)算藥劑對(duì)菌株孢子萌發(fā)的EC5tl值；
2.如權(quán)利要求1所述的一種檢測(cè)煙草黑脛病菌對(duì)殺菌劑敏感性的方法，其中第(3)步可為下述方法:在無菌條件下，在96孔微孔板中每孔加入I X IO4個(gè)/mL的游動(dòng)孢子懸浮液10 μ L，將其置于監(jiān)控培養(yǎng)箱(BioLog OminLog)中，于28°C黑暗條件下培養(yǎng)24h后，再分別加入140 μ L經(jīng)利馬豆培養(yǎng)基稀釋過質(zhì)量濃度為2、1、0.5,0.25,0.13,0.063,0.031mg/L的烯酰嗎啉藥劑，設(shè)置添加同體積無菌水為空白對(duì)照組；采用池度測(cè)定軟件(Microstation)測(cè)定96孔微孔板590nm的OD值(處理Oh的吸光度值為ODtl),將微孔板繼續(xù)置于監(jiān)控培養(yǎng)箱(BioLog OminLog)中黑暗條件下培養(yǎng),采用生長(zhǎng)曲線監(jiān)控軟件(OminLog-PM)讀取0_72h小時(shí)黑脛病菌生長(zhǎng)曲線的數(shù)據(jù)；于72h后再次測(cè)定OD值(處理72h的吸光度值為OD72),按照公式(I)計(jì)算藥劑對(duì)菌絲生長(zhǎng)的抑制率，并計(jì)算藥劑對(duì)菌株菌絲生長(zhǎng)的EC5tl值。
3.如權(quán)利要求1或2所述的一種檢測(cè)煙草黑脛病菌對(duì)殺菌劑敏感性的方法，其中利馬豆液體培養(yǎng)基的配置方法為:稱取60g利馬豆于800mL無菌水中煮沸Ih,過濾,濾液定容至1L，滅菌、待用；利馬豆固體培養(yǎng)基的配置方法為:稱取60g利馬豆于800mL無菌水中煮沸l(wèi)h，過濾，濾液中添加16g瓊脂粉，煮沸定容至1L，滅菌、待用。
4.如權(quán)利要求3所述的一種檢測(cè)煙草黑脛病菌對(duì)殺菌劑敏感性的方法，其中10%V8液體培養(yǎng)基的配置方法為:100mLV8營(yíng)養(yǎng)液1500rpm離心5分鐘，收集上清液，并加入.0.2gCaC03,加去離子水至1L, pH6.5~7.5,經(jīng)滅菌后分裝待用。
【文檔編號(hào)】C12Q1/04GK103555811SQ201310580090
【公開日】2014年2月5日 申請(qǐng)日期:2013年11月19日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月19日
【發(fā)明者】汪漢成, 王茂勝, 陳慶園, 李文紅, 陸寧, 夏海乾 申請(qǐng)人:貴州省煙草科學(xué)研究院, 貴州省植物保護(hù)研究所