一種甜葉菊毛狀根誘導和培養生產綠原酸和二咖啡?？鼘幩岬姆椒?br> 【專利摘要】本發明屬于基因工程領域，具體涉及一種采用發根農桿菌遺傳轉化甜葉菊建立毛狀根培養體系生產綠原酸及二咖啡?？鼘幩岬姆椒ā热莅ㄌ鹑~菊外植體制備、發根農桿菌活化培養、懸浮培養及綠原酸和二咖啡?？鼘幩岬纳a。經PCR檢測，證明甜葉菊毛狀根為轉化產生，HPLC檢測表明甜葉菊毛狀根能夠生產綠原酸和二咖啡?？鼘幩?。由于所使用的毛狀根具備在無激素培養基上快速生長的特性，因此該方法操作簡單、成本較低、不受氣候、土地等自然條件的限制等優點。為利用毛狀根培養生產綠原酸和二咖啡?？鼘幩崽峁┝艘环N穩定、可持續的新型藥源和食品功能因子，為今后應用生物反應器進行綠原酸和二咖啡?？鼘幩嵋幠；a提供可靠的來源和物質基礎。
【專利說明】一種甜葉菊毛狀根誘導和培養生產綠原酸和二咖啡?？鼘幩岬姆椒?br> 【技術領域】
[0001]本發明屬于基因工程【技術領域】，具體涉及一種采用發根農桿菌侵染甜葉菊誘導產生毛狀根的方法，并用此毛狀根生產次生代謝產物綠原酸和二咖啡?？鼘幩帷?br> 【背景技術】
[0002]植物能夠產生天然藥用成分，但隨之也帶來植物資源大量消耗的局面。利用植物生物工程生產藥用植物有效成分，能有效保護自然資源、節約土地，對于現代社會可持續發展意義重大。植物遺傳轉化發根農桿菌載體系統具有遺傳和生物合成的穩定性以及毛狀根生長快、易于培養、有效成分高等獨特優勢，為植物次生代謝物的工業化生產提供了廣闊的前景。
[0003]目前，雖然國內外采用發根農桿菌遺傳轉化植物獲得次生代謝產物的毛狀根的相關研究較多，但對遺傳轉化甜葉菊獲得產綠原酸和二咖啡酰奎寧酸毛狀根研究仍為空白。甜葉菊(Stevia rebaubiana),雙子葉植物綱,屬菊料斯臺維亞屬的一種小型多年生草本植物，又名甜草、甜菊、甜茶等。原產南美洲亞熱帶地區，巴拉圭和巴西交界的阿曼拜山脈。我國自1976年開始由南京中山植物園、中國農業科學院等科研單位先后從日本引進甜葉菊試種成功。80年代初向全國各地推廣種植，生產的甜葉菊干葉主要出口日本。甜葉菊植物體內含有很多種物質，包括揮發油，二、三萜類，香豆素類，咖啡酸以及綠原酸等。其中，甜菊糖苷(Stevioside, St)是甜葉菊葉子中的二職類化合物,是天然的高甜度的甜味物質,甜度是蔗糖的200~300倍，一直受到人們的關注。甜葉菊中還含有一類很有價值的成分綠原酸和二咖啡?？鼘幩?，但含量較低，目前尚未得到有效利用。綠原酸，具有抗氧化、抗菌、抗病毒、升高白細胞、免疫調節、抗腫瘤、降血壓、降血脂等作用。同時有研究結果表明，綠原酸是很有希望的抗艾滋病毒(HIV)的先導化合物。二咖啡?？鼘幩崾且活愑煽鼘幩崤c數目不等的咖啡酸通過酯化反應縮`合而成的酚酸類天然成分，廣泛存在于植物界如金銀花、旋覆花等中藥及茶葉、山楂等果樹中，具有抗肝纖維化及脂質過氧化作用。隨著生物工程技術的不斷提高，利用毛狀根進行離體培養快速生產有效成分，已成為藥用植物資源可持續發展的有效途徑之一。

【發明內容】

[0004]本發明的目的在于，提供一種轉基因技術遺傳轉化甜葉菊獲得產藥用成分綠原酸和二咖啡?？鼘幩岬拿珷罡姆椒?，該方法將發根農桿菌Ri質粒的T-DNA導入甜葉菊中，獲得甜葉菊毛狀根，為有效利用甜葉菊資源提供一條新途徑。
[0005]本發明是通過以下技術方案實現的:
[0006]1、甜葉菊種子置于MS、B5、WPM等培養基培養；
[0007]2、采用轉基因方法轉移發根農桿菌的Ri質粒的T-DNA至甜葉菊葉片中，包括以下步驟:[0008]a.發根農桿菌接種在YEB培養基活化；
[0009]b.用發根農桿菌侵染甜葉菊無菌外植體；
[0010]c.發根農桿菌與甜葉菊外植體共培養；
[0011]d.外植體在羧芐西林鈉、頭孢噻肟鈉等抗生素除菌培養。
[0012]3、甜葉菊毛狀根獲得與繼代培養；
[0013]4、甜葉菊毛狀根的分子檢測，方法如下:
[0014]a.提取甜葉菊毛狀根DNA ;
[0015]b.獲得含有rolB和rolC引物的PCR反應體系；
[0016]c.PCR反應擴增毛狀根特有基因rolB和rolC ；
[0017]d.電泳檢測目標條帶。
[0018]5、甜葉菊毛狀根中綠原酸的含量檢測。
[0019]6、甜葉菊綠原酸和二咖啡?？鼘幩崽崛『图兓?br> [0020]本發明中涉及的縮寫術語、培養基:
[0021]1.外植體一甜葉菊無菌苗切成的莖段以及子葉節；
[0022]2.發根農桿菌培養基:YEB、LB ；
[0023]3.植物基本培養基:MS (Murashige and Skoog, 1962)、B5、WPM、White ;
[0024]4.抗生素:利福平Rif(Rifampicin)、卡那霉素(kan)、頭孢噻I虧鈉Cef (Cefotaxime)、羧節西林鈉 Cb(Carbenicillin)等抗生素。
[0025]本發明方法的有益的效果體現在::
[0026]1、在本發明中，利用轉基因技術，將發根農桿菌Ri質粒的T-DNA導入甜葉菊細胞獲得毛狀根，通過篩選優良無性系，獲得綠原酸和二咖啡?？鼘幩岷肯鄬^高而穩定的毛狀根無性系，為甜葉菊的生產提供一種新型優質的可持續藥源和食品功能因子；
[0027]2、與田間栽培甜葉菊相比，甜葉菊毛狀根可獲得穩定質量和產量，不受自然條件的限制，不占用耕地面積，可以工業化連續生產；
[0028]3、通過人工調控優化培養條件，可顯著提高毛狀根的生長和次生代謝產物的積累，具有可調節性；
[0029]4、該技術在毛狀根培養過程中，不添加任何激素，因此，可以大大降低成本。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0030]附圖1為甜葉菊無菌苗照片。
[0031]附圖2為發根農桿菌誘導產生的毛狀根照片。
[0032]附圖3為毛狀根在固體培養基上快速生長照片。
[0033]附圖4為毛狀根rol基因的PCR檢測照片。
[0034]附圖5為液體培養的甜葉菊毛狀根照片。
[0035]附圖6為甜葉菊毛狀根中綠原酸含量。
【具體實施方式】
[0036]以下實施例僅用于闡述本發明，而本發明的保護范圍并非僅僅局限于以下實施例。所屬【技術領域】的普通技術人員依據以上本發明公開的內容和各參數所取范圍，均可實現本發明的目的。
[0037]實施例1甜葉菊無菌外植體的獲得
[0038]人工去除甜葉菊種子上的冠毛，在20_40°C水浴鍋內保溫1-28小時，濾紙吸干，將甜葉菊種子用70%酒精消毒20-60S，用無菌水沖洗2-3次，再用0.1 %的汞液消毒2-20min，用無菌水沖洗5-6次。接種在固體培養基上，該培養基配方為:MS基本培養基，10~60g/L蔗糖，0.01~lmg/LNAA和O~lmg/L BA,再添加7_8g/L的瓊脂粉。溫度25±2°C條件下培養，黑暗培養10-20d，然后移至光室，光照強度為20001x，光照時間為12h/d，得到無菌苗。
[0039]實施例2發根農桿菌遺傳轉化甜葉菊獲得毛狀根
[0040]1、發根農桿菌的活化
[0041]將發根農桿菌接種于含利福平等抗生素的YEB固體培養基，挑取單菌落，接種在含利福平等抗 生素YEB液體培養基中，溫度28~30°C，轉速50~400r/min，震蕩過夜培養，再取活化后的菌液10-500 μ L加入到10~50mL含Rif等抗生素的YEB(LB)液體培養基中，溫度28°C，50~400rpm震蕩暗培養至OD值為0.5-1.0。
[0042]2、發根農桿菌的重懸浮
[0043]室溫10000~5000rpm離心2_20min,棄上清,菌體用等體積的1/2MS重懸浮,在25-35°C，50-200rpm震蕩暗培養半小時，使菌液濃度達到0D600 = 0.2-1.5左右，用于侵染。
[0044]3、外植體的預培養
[0045]剪取培養在MS固體培養基上的甜葉菊無菌苗葉片和莖段外植體，接種到含有AS的MS培養基中，25°C暗培養2d。
[0046]4、發根農桿菌于甜葉菊共培養
[0047]將上述經預培養的甜葉菊葉片外植體(如幼嫩葉片)，放入含活化好的上述發根農桿菌工程菌的1/2MS懸液中浸泡IOmin (輕輕搖晃使外植體與菌液充分接觸)后，取出浸染后的葉片用無菌吸水紙吸干表面菌液，轉到共培養培養基1/2MS中，暗培養2-6d。
[0048]5、甜葉菊的除菌培養
[0049]將共培養3d后的甜葉菊葉片用無菌水沖洗數次后用無菌吸水紙吸干葉片表面水分，置于除菌培養基l/2MS+100-500mg/LCb上除菌培養，7_10天后，轉接到1/2MS+400~600mg/L頭孢噻腭鈉(Cef)上，在此期間，甜葉菊葉片的傷口處將會陸續出現白色毛狀根；1-2周后將其轉接到1/2MS+100~300mg/L頭孢噻腭鈉(Cef)上，1_2周后再轉到1/2MS+100~300mg/L頭孢噻腭鈉(Cef)上，兩周后基本除菌完畢后，轉移至不含抗生素的1/2MS培養基上。培養條件為25±2°C，黑暗培養。
[0050]6、毛狀根優質株系的篩選
[0051]挑選除菌徹底、經過PCR檢測的毛狀根，將分枝多、生長快速的毛狀根轉移至1/2MS培養液中，進行繼代培養。
[0052]實施例3甜葉菊毛狀根的分子檢測
[0053]1、甜葉菊毛狀根基因組DNA的提取，方法如下:
[0054]I)取幼嫩甜葉菊毛狀根100-200mg，加入液氮磨成粉末；
[0055]2)將磨成粉末的甜葉菊毛狀根裝入1.5mlEppendorf的離心管中，加入600 μ I經60°C預熱的2XCTAB以及10μ I的巰基乙醇，混勻后置于60°C水浴鍋中40_50min，期間不時顛倒混勻；
[0056]3)待裂解液冷卻至室溫后加入等體積苯酚(pH8.0)，輕柔翻轉混勻，靜置IOmin ；
[0057]4) 12000rpm，離心20min后吸取乳白色上清至新管中，吸取時記下體積；
[0058]5)加入等體積酚:氯仿(1:1)，輕柔翻轉混勻，靜置IOmin ；
[0059]6) 12000rpm,離心20min后吸取乳白色上清至新管中，吸取時記下體積；
[0060]7)加入等體積氯仿，輕柔翻轉混勻，靜置IOmin ；
[0061]8) 12000rpm,離心20min后吸取乳白色上清至新管中，吸取時記下體積；
[0062]9)加入兩倍體積遇冷的無水乙醇，析出絮狀沉淀；
[0063]10)用吸頭將白色絮狀沉淀挑到EP管中，75%乙醇清洗兩次，烘干；
[0064]11)加入無菌水充分溶解后再加入Rnase置于37°C水浴鍋中30min，置于_20°C中備用。
[0065]2 X CTAB提取液(1000ml)的配方如下:
【權利要求】
1.一種獲得產綠原酸和二咖啡?？鼘幩岬奶鹑~菊毛狀根的方法，特征在于采用轉基因技術，用發根農桿菌侵染甜葉菊外植體，包括如下步驟: (1)甜葉菊無菌苗的獲得； (2)采用轉基因方法轉移發根農桿菌的Ri質粒的T-DNA至甜葉菊葉片中，包括以下步驟: a.發根農桿菌接種在YEB培養基活化； b.用發根農桿菌侵染甜葉菊無菌外植體； c.發根農桿菌與甜葉菊外植體共培養； d.外植體在羧芐西林鈉、頭孢噻肟鈉除菌培養。 (3)甜葉菊毛狀根獲得與繼代培養； (4)甜葉菊毛狀根的分子檢測，方法如下: e.提取甜葉菊毛狀根DNA; f.獲得含有rolB和rolC引物的PCR反應體系； g.PCR反應擴增毛狀根特有基因rolB和rolC ； h.電泳檢測目標條帶。 (5)甜葉菊毛狀根中綠原酸和二咖啡?？鼘幩岬暮繖z測； (6)甜葉菊毛狀根中綠原酸和二咖啡酰奎寧酸的提取和純化。
2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于步驟b中的外植體，是由甜葉菊種子經過無菌培養獲得的葉片，并將葉片切成0.1~IOcm2的小塊。
3.根據權利要求1所述的方法，其特征在于步驟d中的羧芐西林鈉、頭孢噻肟鈉濃度分別為 O ~500mg/L 和 O ~1000mg/L。
4.根據權利要求1所述的方法，利用甜葉菊毛狀根提取、純化獲得綠原酸和二咖啡酰奎寧酸，其特征在于生產過程不添加激素，提取和純化過程簡便、成本低。
【文檔編號】C12N15/84GK103695462SQ201310603423
【公開日】2014年4月2日 申請日期:2013年11月15日 優先權日:2013年11月15日
【發明者】陳繼光, 上官新晨, 尹忠平, 吳少福, 付曉, 張清峰, 洪艷平 申請人:江西農業大學