一種基于SYBR Green I熒光定量的牦牛應激型HSPA1A基因組織表達譜建立的制作方法
【專利摘要】本發明公開了一種基于SYBRGreenI熒光定量方法的牦牛應激型HSPA1A基因組織表達譜建立。該表達譜建立包括了如下步驟：（1）牦牛各組織RNA的提取及cDNA合成；（2）引物設計；（3）標準曲線的建立；（4）熒光定量PCR方法的優化和建立；（4）采用建立好的方法檢測牦牛應激型HSPA1A基因在各組織的表達分布；（5）采用相對定量的2–△△CT法進行數據分析，計算出HSPA1A基因各組織的相對表達量；（6）構建HSPA1A基因在牦牛不同組織中的表達譜。本發明采用SYBRGreenI熒光定量方法構建了牦牛應激型HSPA1A基因組織表達譜，該方法避免了設計、標記熒光探針和價格昂貴等問題，并且該方法檢測靈敏度高，特異性強，重復性好，PCR反應結束后，可立即觀察結果，不需要電泳、染色等操作，因此比采用其它方法來建立組織表達譜適用性更強。
【專利說明】—種基于SYBR Green I熒光定量的牦牛應激型HSPA1A基
因組織表達譜建立
【技術領域】
[0001]本發明屬于一種生物【技術領域】，具體涉及一種檢測牦牛應激型HSPAlA基因組織表達分布的SYBR Green I熒光定量PCR方法及對應的組織表達譜的建立。該方法避免了設計、標記熒光探針和價格昂貴等問題，并且該方法檢測靈敏度高，特異性強，重復性好，因此比采用其它方法來建立組織表達譜適用性更強。
【背景技術】
[0002]熱休克蛋白(Heat Shock Protiens, HSPs),也叫熱激蛋白，廣泛分布于真核生物和原核生物中，外界各種各樣的應激源(比如高溫、低溫、缺氧、重金屬等)能夠誘導熱休克蛋白的產生，從而使生物體免受應激因素的損害。HSP70家族是熱休克蛋白家族中最重要的一員，同時也是生物體內高度保守的蛋白質家族之一。該家族成員眾多，其中最常見的可以分為兩類，一類是應激型的HSP70 ;另一類是結構型的HSC70(Heat Shock Cognate，熱應激同源蛋白70)，前者在正常細胞內表達量較低或者不表達，但是在熱應激或者其他應激源的作用下，表達量迅速增加；后者在正常細胞內均有不同程度的表達，受到外界環境應激因素的影響表達量有不同程度的上升，應激型HSP70已成為現階段研究的熱點之一。HSP70對維持細胞內穩態，改善細胞的生存能力和減輕有害應激損傷有非常重要作用。
[0003]HSP70在應激狀態下幫助需要的蛋白質正確折疊，加快正常蛋白質合成的恢復；在細胞保護方面，HSP70表達的增加可以緩解細胞所受傷害，增強機體對應激的抵抗力；同時，HSP70 在抗細胞凋亡、抗氧化和免疫反應中也起著重要作用。HSPAlA是HSP70應激型中的主要類型，對其研究能夠更好地理解HSP70應激型在環境適應中的功能性。牦牛是生活在高原環境下的特有物種，與高原人民的生活息息相關。為了加強牦牛資源的保護和開發利用，以牦牛作為高原模式動物，應激型HSPAlA基因在牦牛各組織的表達譜的建立有助于更好地了解應激型HSPAlA基因在各組織的作用機理，有助于保護牦牛免受高原惡劣環境應激因素的影響，使其能夠更加順利地生產與繁殖。
[0004]目前關于牦牛應激型HSPAlA基因組織表達譜建立還尚未見報告，本發明旨在建立一種基于SYBR Green I熒光定量方法的牦牛應激型HSPAlA基因組織表達譜，該表達譜的建立為進一步研究HSPAlA基因在牦牛的環境的適應性上提供基礎。

【發明內容】

[0005]本發明旨在建立一種基于SYBR Green I熒光定量方法的牦牛應激型HSPAlA基因組織表達譜的建立。該定量方法具有操作簡便，檢測靈敏度高，重復性好，污染少，PCR反應結束后，可立即觀察結果，不需要電泳、染色等操作等優點，因此比采用其它方法來建立組織表達譜適用性更強。
[0006]本發明的技術方案是通過如下步驟來實現的:
1、牦牛各組織RNA的提取分別提取3頭公牦牛11種組織(心、肝、脾、肺、腎、大腸、小腸、肌肉、胃、睪丸、腦)，3頭母牦牛12種組織(心、肝、脾、肺、腎、大腸、小腸、肌肉、胃、卵巢、乳腺、腦)樣品，稱量約Ig后迅速轉移至液氮預冷的研缽中，用研杵研磨組織，期間不斷加入液氮，直至研磨成粉末狀。加入I mL的Trizol，室溫靜置直至樣品完全融化，吸取I mL至無RNA酶的離心管中，加入200 UL的氯仿，劇烈振蕩，室溫靜置5 min0 4 °C >12000 r/min離心15 min，小心吸取500U L上清液,加入等體積的異丙醇,顛倒混勻，室溫靜置10 min。4 °C >12000 r/min離心10min,棄上清,沉淀加入I mL 75 %的乙醇洗漆,4 °C >12000 r/min離心5 min,棄上清,室溫干燥沉淀，以30 μ L DEPC水溶解RNA。
[0007]2、cDNA的反轉錄合成
按照 Fermentas 公司的 RevertAid? First Strand cDNA Synthesis Kit 反轉錄酶說明書，米用 20 111^體系:01丨80 dT18、l u L, 5XReaction B U ffer>4 U L, Ribolock?Rnase Inhibitor (20 u / u I) > I u L, 10 mM dNTP Mix、2 u L, RevertAid?M-M u LV ReverseTranscriptase (200 u / u I) > I uL,模板 I uL,最后用 RNase Free dH20 補足 20 uL,按以下程序進行反轉錄反應:42 °C>60 min ；70 °C、5 min。
[0008]3、引物設計
根據GenBank中登陸的牛HSPAlA (登錄號為NM_174550)、內參P-actin (登錄號為NM_173979)基因序列各設計一對特異性引物。引物序列如下:
HSPAlA:上游引物 5’ -CTCCTGCGTAGGGGTGTTCCA-3’ ；
HSPAlA:下游引物 5’ -GCACCTTAGGCTTGTCTCCGTC-3’ ；
3 -actin:上游引物 5’ -ACATCCGCAAGGACCTCTAC-3’ ；
3 -actin:下游引物 5’ -GCCAATCTCATCTCGTTTTC-3?；
預計擴增長度分別為160bp、170bp。
[0009]4、標準曲線的建立
(I)以25 UL的PCR反應體系:PCR Mix 12.5 U L，上、下游引物各I yL，模板I y L，dH20 9.5 UL;擴增程序為:94 °C預變性 5 min, 94 °C變性 30 s，60 °C退火 30 s，72。。延伸25 s，36個循環，最后72 °C延伸10 min ;分別將HSPAlA和3-actin進行PCR擴增，反應結束后，取PCR產物進行體積分數10g/L的瓊脂糖凝膠電泳，觀察結果并回收、純化產物。
[0010](2)將回收、純化的產物與克隆載體PMD19-T進行連接，轉化DH5a感受態細胞并在Amp+瓊脂平板上涂菌，挑取單個菌落接種于含Amp+的LB液體培養基中。經PCR鑒定后，將陽性重組質粒送往Invitrogen (英濰捷基上海)公司進行測序。
[0011](3)提取經過測序鑒定正確的重組質粒，應用紫外分光光度計測定重組質粒濃度，計算出基因拷貝數，將重組質粒進行10倍梯度稀釋，將其作為標準質粒模板。
[0012](4)取標準質粒模板，構建反應體系，進行SYBR Green I熒光定量PCR擴增，獲得擴增標準曲線。
[0013]5、熒光定量PCR檢測方法的優化和建立。
[0014](I)引物特異性實驗:選用一頭公牦牛的腦組織cDNA為模板進行熒光定量PCR，進行3次重復，并設置以dH20為模板的陰性對照，檢驗設計引物的特異性。
[0015](2)熒光定量PCR反應條件的優化:對熒光定量PCR的循環條件進行了兩步法和三步法的摸索，并將退火溫度從56 °C依次遞增至60 °C，每次遞增I °C，對退火溫度進行優化。
[0016]6、采用建立好的方法檢測牦牛應激型HSPAlA基因在各組織的表達分布。
[0017](I)反應體系為 20 u L:SYBR Premix Ex Taq?II 10 U L，上、下游引物各 0.8U L,模板 2 u L, dH20 6.4 u L0
[0018](2)擴增程序為:95 °C預變性30 s,95 °C變性5 s，60 °C退火30 s，72 °C延伸20s，39個循環，添加一個溶解曲線，設置以dH20為模板的陰性對照，每個組織進行3次重復。
[0019]7、采用相對定量的2_ AACT法進行數據分析，計算出HSPAlA基因各組織的相對表達量，基于表達量構建HSPAlA基因組織表達譜。【專利附圖】

【附圖說明】
[0020]圖1為HSPAlA熒光定量PCR標準曲線。
[0021]圖2為3-actin熒光定量PCR標準曲線。
[0022]圖3為引物特異性實驗溶解曲線，如圖表明兩引物具有較高的特異性。
[0023]圖4 為 HSPAlA和 P-actin 的溶解曲線，P-actin熔解溫度為 82±0.5°C，HSPAlA熔解溫度為88 ±0.5°C。
[0024]圖5為HSPAlA和P -actin的擴增曲線。
[0025]圖6為公、母牦牛HSPAlA基因各組織的相對表達譜。
【具體實施方式】
[0026]為了使本發明的技術方案更加清楚明白，下面結合具體實施例對本發明作進一步的說明
實施例1:
(I)牦牛各組織RNA的提取
分別提取3頭公牦牛11種組織(心、肝、脾、肺、腎、大腸、小腸、肌肉、胃、睪丸、腦)，3頭母牦牛12種組織(心、肝、脾、肺、腎、大腸、小腸、肌肉、胃、卵巢、乳腺、腦)樣品，稱量約Ig后迅速轉移至液氮預冷的研缽中，用研杵研磨組織，期間不斷加入液氮，直至研磨成粉末狀。加入I mL的Trizol，室溫靜置直至樣品完全融化，吸取I mL至無RNA酶的離心管中，加入200 UL的氯仿，劇烈振蕩，室溫靜置5 min。4 °C >12000 r/min離心15 min，小心吸取500U L上清液,加入等體積的異丙醇,顛倒混勻，室溫靜置10 min。4 °C >12000 r/min離心10min,棄上清,沉淀加入I mL 75 %的乙醇洗漆,4 °C >12000 r/min離心5 min,棄上清,室溫干燥沉淀，以30 ii L DEPC水溶解RNA。
[0027](2) cDNA的反轉錄合成
按照 Fermentas 公司的 RevertAid? First Strand cDNA Synthesis Kit 反轉錄酶說明書，按以下程序進行反轉錄反應:42 0C >60 min ；70 °C、5 min.，反應體系為:oligo dT18I u L ；
5 X Reaction Buffer4 u L ；
Ribolock? Rnase Inhibitor (20 u / u I)I U L ;
10 mM dNTP Mix2 u L ；
RevertAid?M~M u LV Reverse Transcriptase (200 u / u I) I u L ；模板I U L ;
RNase Free dH2010 U L。
[0028](3)引物設計
根據GenBank中登陸的牛HSPAlA (登錄號為NM_174550)、內參P-actin (登錄號為NM_173979)基因序列各設計一對特異性引物，引物由上海Invitrogen (英濰捷基)公司合成。引物序列如下:
HSPAlA:上游引物 5’ -CTCCTGCGTAGGGGTGTTCCA-3’ ；
HSPAlA:下游引物 5’ -GCACCTTAGGCTTGTCTCCGTC-3’ ；
3 -actin:上游引物 5’ -ACATCCGCAAGGACCTCTAC-3 ；
3 -actin:下游引物 5’ -GCCAATCTCATCTCGTTTTC-3?；
預計擴增長度分別為160bp、170bp。
[0029](4)標準曲線的建立
①以25 UL的PCR反應體系，擴增程序為:94 °C預變性5 min, 94 °C變性30 S，60 V退火30 S，72 °C延伸25 S，36個循環，最后72 °C延伸10 min ;分別將HSPAlA和P-actin進行PCR擴增，反應結束后，取PCR產物進行體積分數10g/L的瓊脂糖凝膠電泳，觀察結果并回收、純化產物，反應體系為:
PCR Mix:12.5 u L ；
上、下游引物(各):I UL；
模板:I U L ;
dH20:9.5 u。
[0030]②將回收、純化的產物與克隆載體PMD19-T進行連接過夜，連接后的產物直接用于轉化。
[0031]③冰上溶解50 ii L DH5 a感受態細胞，加入10 ii L連接產物，冰浴30 min,然后42.5°C水浴鍋熱激90s，再冰浴15 min，加入940 u L不含抗生素的LB液體培養基，37°C、200rpm振蕩培養Ih,將搖好的菌4000rpm離心2 min,棄600 u L上清液,重懸沉淀,在Amp+瓊脂平板上涂菌，37°C培養14-16h。
[0032]④挑取單個菌落接種于含Amp+的LB液體培養基中。經PCR鑒定后，將陽性重組質粒送往Invitrogen (英濰捷基上海)公司進行測序。
[0033]⑤提取經過測序鑒定正確的重組質粒，應用紫外分光光度計測定重組質粒濃度，計算出基因拷貝數，將重組質粒進行10倍梯度稀釋，將其作為標準質粒模板。
[0034]⑥取標準質粒模板，構建反應體系，進行SYBR Green I熒光定量PCR擴增，獲得擴增標準曲線。
`[0035](5)熒光定量PCR檢測方法的優化和建立
①引物特異性實驗:選用一頭公牦牛的腦組織cDNA為模板進行熒光定量PCR，進行3次重復，并設置以dH20為模板的陰性對照，檢驗設計引物的特異性。由圖2分析可知:3-actin在溶解溫度為Tm=82 V ±0.5 °C、HSPAlA在溶解溫度為Tm=88 V ±0.5 °C時出現單一的特異性峰，表明該引物、該反應特異性良好。
[0036]②熒光定量PCR反應條件的優化:對熒光定量PCR的循環條件進行了兩步法和三步法的摸索，并將退火溫度從56 °C依次遞增至60 °C，每次遞增I °C，對退火溫度進行優化。
[0037](6)采用建立好的方法檢測牦牛應激型HSPAlA基因在各組織的表達分布
擴增程序為:95 °C預變性30 s，95 °C變性5 s，60 °C退火30 s，72 °C延伸20 s，39個循環，添加一個溶解曲線，設置以dH20為模板的陰性對照，每個組織進行3次重復。反應體系為:
SYBR Premix Ex Taq?II10 U L ；
上、下游引物(各)0.8 UL；
模板2 u L ;
dH206.4 u L。
[0038](7)采用相對定量的2_AAG1i進行數據分析，計算出HSPAlA基因各組織的相對表達量，構建組織表達譜。
【權利要求】
1.一種檢測牦牛應激型HSPAlA基因組織表達分布的SYBR Green I熒光定量PCR方法及基因組織表達譜的建立，其特征在于根據牛HSP1A、^ -actin基因序列設計特異性檢測引物，利用Real-time技術對HSPlA基因在不同組織中的表達量進行定量分析。
2.如權利I所述根據牛HSP1A、P-actin基因序列設計特異性檢測引物，所設計引物如下:
3.如權利I所述HSPAlA基因組織表達譜的建立，其特征在于對公牦牛11種組織樣品(心、肝、脾、肺、腎、大腸、小腸、肌肉、胃、睪丸、腦)，母牦牛12種組織樣品(心、肝、脾、肺、腎、大腸、小腸、肌肉、胃、卵巢、乳腺、腦)進行基因相對定量分析，構建組織表達譜。
【文檔編號】C12N15/11GK103614479SQ201310645254
【公開日】2014年3月5日 申請日期:2013年12月5日 優先權日:2013年12月5日
【發明者】蘭道亮, 李鍵, 陳亞冰, 王樹茂 申請人:西南民族大學