技術領域：

本發明屬于分子生物學和醫學領域，具體涉及一種棒狀桿菌屬細菌和克氏棒狀桿菌多重熒光定量pcr引物、探針、試劑盒和檢測方法。

背景技術：
：

近年來在醫院臨床實踐中，發現非哺乳期乳腺炎發病率逐漸增高，甚至超過哺乳期乳腺炎。肉芽腫性乳腺炎是一種重要的非哺乳期乳腺炎癥疾病，臨床表現為乳腺腫塊、膿腫竇道或潰瘍，病變遷延不愈，反復發作，容易誤診誤治。肉芽腫性乳腺炎病因復雜，涉及局部創傷、自身免疫、細菌感染等因素。近年來國內、外越來越多的研究表明棒狀桿菌屬細菌感染在肉芽腫性乳腺炎病變發展過程中發揮重要作用。最近，本團隊通過高通量測序技術進行細菌宏基因組測序，明確了棒狀桿菌是我國肉芽腫性乳腺炎發病的主要致病菌。

棒狀桿菌為一種革蘭氏染色陽性桿菌，因菌體的一端或兩端膨大呈棒狀而得名。胞壁多糖主要是阿拉伯糖和半乳糖。與分枝桿菌屬和放線菌屬相似，有交叉反應，其歸類于放線菌目棒狀桿菌科。近年研究顯示，該菌屬的多數菌種可作為條件致病菌在宿主抵抗力降低時引起各類感染?？耸习魻顥U菌是一種革蘭陽性短小棒狀桿菌。在普通培養基上難以生長，而在含tween80的血平板中生長良好。由于其親脂生長的特點，又因女性乳腺組織中脂肪含量較高，故與臨床上女性感染性乳腺炎有關。該菌不含分枝菌酸、無芽孢，過氧化氫酶和七葉甙反應陽性，對利福平和萬古霉素敏感。

分離培養法是臨床上最常用的細菌鑒定技術，一般將分離物無菌劃盤接種于5％綿羊血瓊脂平板，于35℃培養24-96小時。根據不同的培養特性，細菌/菌落的形態、革蘭氏染色情況及生化特性(如借助美國remel公司的rapidcbplussystem)等進行鑒別確認。由于棒狀桿菌屬細菌及克氏棒狀桿菌屬于難培養細菌，存在耗時長，準確性差，陽性率低的問題，無法滿足臨床診治的需求。

熒光定量pcr是一種核酸分析技術，因其具有操作簡單、快捷方便，價格低廉等優點，目前使用最廣泛。設計特異性引物和探針可對靶標序列雙重識別，特異性好、假陽性低。此外，該技術綜合了pcr擴增技術、熒光標記及信號獲取技術，具有很高的靈敏度，可檢測數個拷貝。通過熒光信號的采集可以直接對產物進行定量，線性關系好、線性范圍寬。由于擴增和檢測在同一管內完成，無需開蓋，不存在污染的問題。因此通過熒光定量pcr來檢測棒狀桿菌，具有準確、快速的優點，將為肉芽腫性乳腺炎的有效防治提供重要的技術支撐手段。

技術實現要素：
：

本發明的目的在于克服現有技術的不足，提供一種棒狀桿菌屬細菌和克氏棒狀桿菌多重熒光定量pcr檢測引物、探針、試劑盒和檢測方法。

為解決上述技術問題，本發明采用的技術方案是：為了鑒別棒狀桿菌屬細菌，針對靶基因23srrna基因設計特異性引物和探針；為了鑒別克氏棒狀桿菌種，針對靶基因16srrna基因設計特異性引物和探針。

通過查找美國國立衛生研究院國立醫學圖書館生物信息技術中心http://www.ncbi.nlm.nih.gov/(ncbi)網站上23srrna和16srrna基因的序列，并結合文獻，分別設計棒狀桿菌屬細菌及克氏棒狀桿菌的特異性引物和探針。

本發明的第一個目的是提供一種棒狀桿菌屬細菌和克氏棒狀桿菌多重熒光定量pcr檢測引物，其特征在于，所述的檢測引物如下所示：

針對棒狀桿菌屬細菌：23srrna-f：5’-tgatagctggttctccccgaa-3’(其核苷酸序列如seqidno.1所示)，23srrna-r：5’-cgatctgggctgtttccct-3’(其核苷酸序列如seqidno.2所示)；

針對克氏棒狀桿菌：16srrna-f：5’-agaaccttacctgggcttga-3’(其核苷酸序列如seqidno.3所示)，16srrna-r：5’-cgctcgttgcgggactta-3’(其核苷酸序列如seqidno.4所示)。

用上述檢測引物對克氏棒狀桿菌的基因組dna進行多重熒光定量pcr擴增，能夠同時擴增出上述2個基因序列的片段。設計這類引物是本領域技術人員能夠輕易完成的，優選的，特異性引物可用常規的合成技術進行合成，本領域的技術人員能夠理解的。

本發明的第二個目的是提供一種棒狀桿菌屬細菌和克氏棒狀桿菌多重熒光定量pcr檢測探針，其特征在于，所述的檢測探針如下所示：

針對棒狀桿菌屬細菌：5’-gtcccgctmaaccawccagt-3’(其核苷酸序列如seqidno.5所示)，m代表a或c堿基，w代表a或t堿基；

針對克氏棒狀桿菌：5’-actggatgcggccaga-3’(其核苷酸序列如seqidno.6所示)；

探針的5’端標記有熒光報告基團，3’端標記有熒光淬滅基團，兩探針的5’端標記的熒光報告基團是不同的熒光報告基團。

優選，所述的熒光報告基團為vic、hex或fam，所述的熒光淬滅基團為bhq1或mgb。

所設計的特異性探針可用常規的合成技術進行合成，本領域的技術人員能夠理解的。

所述的檢測引物或檢測探針，用于taqman熒光定量pcr技術檢測棒狀桿菌屬細菌及克氏棒狀桿菌。

本發明的第三個目的是提供一種棒狀桿菌屬細菌和克氏棒狀桿菌多重熒光定量pcr檢測試劑盒，其特征在于，包括2×prmixextaq、上述的檢測引物和檢測探針。

本發明的第四個目的是提供一種非疾病的診斷和治療目的的棒狀桿菌屬細菌和克氏棒狀桿菌多重熒光定量pcr檢測方法，其特征在于，包括以下步驟：提取樣品的基因組dna作為模板，使用上述的檢測引物和檢測探針進行多重熒光定量pcr擴增，反應結束后，根據探針標記的熒光報告基團的熒光信號，讀取并記錄樣品的pcr擴增循環次數ct，根據各樣品的ct值，按照建立的判斷標準，判斷樣品中是否含有棒狀桿菌屬細菌和克氏棒狀桿菌。

所述的多重熒光定量pcr擴增的擴增反應體系優選為：20μl；模板dna1μl，2×prmixextaq10μl，終濃度均為200nmol/l的上述的各檢測引物，終濃度均為400nmol/l的上述的各檢測探針，余量為ddh2o。

所述的多重熒光定量pcr擴增程序優選為：60℃1分鐘并收集熒光信號，95℃5分鐘；95℃15秒，56℃20秒，65℃50秒并收集熒光信號，40個循環；最后60℃1分鐘并收集熒光信號。

本發明的第五個目的是提供上述的檢測引物和檢測探針在檢測棒狀桿菌屬細菌和克氏棒狀桿菌中的應用。

結果判斷標準：如果針對棒狀桿菌屬細菌探針的熒光報告基團通道的多重熒光定量pcr擴增曲線曲線上升且ct值小于40，則判斷為棒狀桿菌屬細菌陽性，如果40<ct<42，判斷為可疑，可以加大模板量，重復擴增，如果得到相同的實驗結果，則判斷為棒狀桿菌屬細菌陽性，否則為陰性，如果無ct值或ct>40，則判斷為陰性。如果針對克氏棒狀桿菌探針的熒光報告基團通道的多重熒光定量pcr擴增曲線曲線上升且ct值小于40，則判斷為克氏棒狀桿菌陽性，如果40<ct<42，判斷為可疑，可以加大模板量，重復擴增，如果得到相同的實驗結果，則判斷為克氏棒狀桿菌陽性，否則為陰性，如果無ct值或ct>40，則判斷為陰性。

如果只有棒狀桿菌屬細菌陽性，克氏棒狀桿菌陰性，則表明樣品中含有棒狀桿菌屬細菌，但不是克氏棒狀桿菌。如果棒狀桿菌屬細菌和克氏棒狀桿菌均為陽性，則表明樣品中含有棒狀桿菌屬細菌，至少一種棒狀桿菌屬細菌為克氏棒狀桿菌。如果棒狀桿菌屬細菌和克氏棒狀桿菌均為陰性，則表明樣品中不含有棒狀桿菌屬細菌。

本發明針對棒狀桿菌屬細菌23srrna基因及克氏棒狀桿菌16srrna基因序列，設計特異性引物和探針，利用多重熒光定量pcr，鑒定生物樣本中是否存在棒狀桿菌屬細菌及克氏棒狀桿菌感染，對臨床的針對性選擇抗生素使用具有重要指導作用，合理的抗生素使用可有效縮短肉芽腫性乳腺炎的病程、避免手術切除乳腺組織，極大減輕患者生理和心理創傷，對肉芽腫性乳腺炎的臨床診治提供病因學依據。

本發明的有益效果是：(1)陽性檢測準確率高達100％，重復性好，沒有假陽性；(2)通量高，一次可以對96個樣本進行檢測；(3)靈敏度高，每次檢測的dna用量僅需20ng；(4)檢測所需時間短，從樣本dna提取到檢測結果出來最快只需要4個小時；(5)價格優惠。

附圖說明：

圖1是克氏棒狀桿菌和棒狀桿菌屬細菌雙陽性的多重熒光定量pcr擴增曲線圖。

圖2是克氏棒狀桿菌陰性和棒狀桿菌屬細菌陽性的多重熒光定量pcr擴增曲線圖。

圖3是陰性對照的多重熒光定量pcr擴增曲線圖。

具體實施方式：

以下實施例是對本發明的進一步說明，而不是對本發明的限制。

實施例1：

1、基因組dna提?。?/p>

1.1試劑、耗材和儀器

1.1.1試劑和耗材：基因組dna提取試劑盒(tianampgenomicdnakit,dp304-02；天根公司)含：緩沖液ga；裂解液gb；緩沖液gd；漂洗液pw；洗脫緩沖液te；蛋白酶k(20mg/ml)；吸附??；收集管(2ml)；1.5ml無菌收集管，無水乙醇。

1.1.2儀器：eppendorf5430r離心機，恒溫水浴鍋(江蘇金壇市環宇科技儀器)，振蕩儀(大龍興創公司)，nanodrop2000微量紫外分光光度計(美國thermo公司)。

1.2待測人乳房膿液總dna模板的準備

1.2.1用一次性拭子或一次性注射器采取患者乳房中膿液，使用天根公司的血液基因組dna提取試劑盒(主要成分為：緩沖液ga；裂解液gb；緩沖液gd；漂洗液pw；洗脫緩沖液te；蛋白酶k；吸附柱cb3；收集管；1.5ml無菌收集管)提取人乳房膿液總dna為待測dna模板，具體步驟如下：

①將200μl膿液轉移至1.5ml離心管，加入20μl蛋白酶k溶液，混勻；

②加入200μl緩沖液gb，充分顛倒混勻，70℃恒溫加熱10分鐘，裂解細胞；

③加200μl無水乙醇，充分混勻15秒，簡短離心，去除管蓋內壁的水珠；

④將所得混合溶液轉移到吸附柱cb3中，12000rpm離心30秒，倒掉離下的廢液，將吸附柱cb3放回收集管；

⑤向吸附柱cb3內加500μl已經加入適量無水乙醇的緩沖液gd，12000rpm離心30秒，倒掉離下的廢液，將吸附柱cb3放回收集管；

⑥向吸附柱cb3內加600μl已經加入適量無水乙醇的漂洗液pw，12000rpm離心30秒，倒掉離下的廢液，將吸附柱cb3放回收集管；

⑦重復⑥；

⑧繼續12000rpm離心2分鐘，倒掉離下的廢液，將吸附柱cb3放回收集管，徹底晾干吸附材料中的漂洗液；

⑨將吸附柱cb3轉入一個干凈的離心管，向吸附膜中間懸空滴加50μl的洗脫緩沖液te，室溫放置5分鐘，12000rpm離心2分鐘，將dna溶液收集到離心管中。

1.2.2取2μl的dna溶液，采用nanodrop2000微量紫外分光光度計(美國thermo公司)對提取的dna濃度質量進行測定，將提取的基因組dna模板稀釋到20ng/μl。

2、熒光定量pcr：

熒光定量pcr反應包括pcr體系配制，擴增循環及信號收集3個步驟。

2.1儀器和耗材：熒光定量pcr儀(美國abi公司，appliedbiosystems)，96孔板(香港帝恩公司)，粘性封口膜(美國thermo公司)，prmixextaq(probeqpcr)(大連takara公司)。

2.2序列查找和引物探針設計：

通過查找美國國立衛生研究院國立醫學圖書館生物信息技術中心http://www.ncbi.nlm.nih.gov/(ncbi)網站上棒狀桿菌屬細菌23srrna基因(其核苷酸序列如seqidno.8所示)和克氏棒狀桿菌16srrna基因(其核苷酸序列如seqidno.7所示)的序列，分別設計棒狀桿菌屬細菌及克氏棒狀桿菌的引物和探針。

針對棒狀桿菌屬細菌的檢測引物和檢測探針：

檢測引物：23srrna-f：5’-tgatagctggttctccccgaa-3’(其核苷酸序列如seqidno.1所示)，23srrna-r：5’-cgatctgggctgtttccct-3’(其核苷酸序列如seqidno.2所示)；檢測探針：5’-vic-gtcccgctmaaccawccagt-bhq1-3’(其核苷酸序列如seqidno.5所示)，m代表a或c堿基，w代表a或t堿基。

針對克氏棒狀桿菌的檢測引物和檢測探針：

檢測引物：16srrna-f：5’-agaaccttacctgggcttga-3’(其核苷酸序列如seqidno.3所示)，16srrna-r：5’-cgctcgttgcgggactta-3’(其核苷酸序列如seqidno.4所示)；檢測探針：5’-fam-actggatgcggccaga-mgb-3’(其核苷酸序列如seqidno.6所示)。

2.3熒光定量pcr反應體系的配制：

2.3.1pcr反應體系配制，總體積20μl，2×prmixextaq(probeqpcr)(cat.rr390a，大連寶生公司)10μl，基因組dna1μl(總量20ng)，終濃度均為200nmol/l的引物23srrna-f/r和16srrna-f/r(四條引物)，終濃度均為400nmol/l的步驟2.2的探針(兩條探針)，補水至20μl；將配制好的反應體系加入到96孔板中；

2.3.2將一張新的粘性封口膜蓋住96孔板，用軟膠板從中間向四周輕刮封口膜，確保膜封蓋住每一個pcr反應孔；

2.3.3將密封好的96孔板置于離心機上3000rpm離心30s，使液體收集于反應孔底部。

2.4pcr擴增和信號收集

2.4.1pcr儀為美國abi公司7500fast。將96孔板放置在其中，打開7500softwarev2.3軟件，設置實驗名稱、實驗類型、探針信息以及pcr反應條件等，其擴增程序為：60℃1分鐘并收集熒光信號；95℃5min；95℃15s，56℃20s，65℃50s并收集熒光信號，40個循環；最后60℃1分鐘并收集熒光信號。

2.4.2點擊軟件上的run按鈕，開始pcr擴增。taqman探針法的原理是使用5’端帶有熒光報告基團，3’端帶有熒光淬滅基團的taqman探針進行熒光檢測的方法。當探針完整時，5’端的熒光報告基團受到3’端熒光淬滅基團的制約而不能發出熒光。當taqman探針被分解后，5’端的熒光報告基團便會游離出來，發出熒光。pcr反應過程中，taqman探針在退火時與模板dna序列結合，而在延伸時，taqdna聚合酶的5’→3’外切酶活性會水解與模板結合的taqman探針，從而發出熒光。

2.5結果分析：

7500softwarev2.3軟件展示的多重熒光定量pcr擴增曲線圖(如圖1所示)，表示了熒光信號強度與pcr擴增循環數之間的關系。fam曲線為fam探針信號曲線，該曲線上升且樣品ct值小于40表明膿液中含有克氏棒狀桿菌；vic曲線為vic探針信號曲線，該曲線上升且樣品ct值小于40表明膿液中含有棒狀桿菌屬細菌；rox曲線為參比染料rox信號，作用是減小人為誤差的影響，起校正作用。由于克氏棒狀桿菌隸屬于棒狀桿菌屬，因此若fam曲線上升，則vic曲線必然上升。圖1表示克氏棒狀桿菌陽性，棒狀桿菌屬細菌陽性；圖2表示克氏棒狀菌陰性，棒狀桿菌屬細菌陽性，圖3表示陰性對照。

3、棒狀桿菌屬細菌和克氏棒狀桿菌的靈敏度

3.1棒狀桿菌屬細菌的靈敏度：

3.1.1將谷氨酸棒狀桿菌(corynebacteriumglutamicum)atcc13032的23srrna基因(其核苷酸序列如seqidno.8所示)克隆至pmd8-t載體上，獲得棒狀桿菌屬細菌陽性質粒。

3.1.2取1×10⁷copies/ml的棒狀桿菌屬細菌陽性質粒進行10倍梯度稀釋，獲得濃度分別為1×10⁶copies/ml、1×10⁵copies/ml、1×10⁴copies/ml、1×10³copies/ml、1×10²copies/ml和50copies/ml的棒狀桿菌屬細菌陽性質粒樣品dna作為模板dna，每個梯度3個重復，共18個樣本。

3.1.3以針對棒狀桿菌屬細菌的檢測引物和檢測探針為引物和探針，按照實施例1步驟2的熒光定量pcr反應體系和熒光定量pcr擴增程序進行熒光定量pcr擴增。1×10⁶copies/ml、1×10⁵copies/ml、1×10⁴copies/ml、1×10³copies/ml和1×10²copies/ml的擴增反應曲線上升且ct值都小于40，判斷為棒狀桿菌屬細菌陽性。上述結果表明：本發明的棒狀桿菌屬細菌的檢測引物和檢測探針的檢測下限為1×10²copies/ml。

3.2克氏棒狀桿菌的靈敏度：

3.2.1將克氏棒狀桿菌(corynebacteriumkroppenstedtii)dsm44385的16srrna基因(其核苷酸序列如seqidno.7所示)克隆至pmd8-t載體上，獲得克氏棒狀桿菌陽性質粒。

3.2.2取1×10⁷copies/ml的克氏棒狀桿菌陽性質粒進行10倍梯度稀釋，獲得濃度分別為1×10⁶copies/ml、1×10⁵copies/ml、1×10⁴copies/ml、1×10³copies/ml、1×10²copies/ml、50copies/ml的克氏棒狀桿菌陽性質粒樣品dna作為模板dna，每個梯度3個重復，共18個樣本。

3.2.3以針對克氏棒狀桿菌的檢測引物和檢測探針為引物和探針，按照實施例1步驟2的熒光定量pcr反應體系和熒光定量pcr擴增程序進行熒光定量pcr擴增。1×10⁶copies/ml、1×10⁵copies/ml、1×10⁴copies/ml、1×10³copies/ml和1×10²copies/ml的擴增反應曲線上升，且ct值都小于40，判斷為克氏棒狀桿菌陽性。上述結果表明：本發明的克氏棒狀桿菌的檢測引物和檢測探針的檢測下限為1×10²copies/ml。

4、棒狀桿菌屬細菌和克氏棒狀桿菌的特異性

4.1棒狀桿菌屬細菌的特異性

分別以白喉棒狀桿菌atcc39255、假白喉棒狀桿菌cmcc38203、痤瘡棒狀桿菌atcc6919、潰瘍棒狀桿菌atcc9015、谷氨酸棒狀桿菌atcc13032、結膜干燥棒狀桿菌atcc373、克氏棒狀桿菌dsm44385、牛棒狀桿菌atcc7715、鳥分枝桿菌亞種副結核分枝桿菌atcc19698、星狀諾卡氏菌atcc19247和粘性放線菌atcc15987的基因組dna為模板，以實施例1步驟2的針對棒狀桿菌屬細菌的檢測引物和檢測探針作為引物和探針，按照實施例1步驟2的熒光定量pcr反應體系和熒光定量pcr擴增程序進行熒光定量pcr擴增。擴增結果表明，白喉棒狀桿菌atcc39255、假白喉棒狀桿菌cmcc38203、痤瘡棒狀桿菌atcc6919、潰瘍棒狀桿菌atcc9015、谷氨酸棒狀桿菌atcc13032、結膜干燥棒狀桿菌atcc373、克氏棒狀桿菌dsm44385和牛棒狀桿菌atcc7715均為棒狀桿菌屬細菌陽性；鳥分枝桿菌亞種副結核分枝桿菌atcc19698、星狀諾卡氏菌atcc19247和粘性放線菌atcc15987均為棒狀桿菌屬細菌陰性。上述結果表明：本發明的針對棒狀桿菌屬細菌的檢測引物和檢測探針的特異性高，與分枝桿菌屬、諾卡氏菌屬和放線菌屬無交叉反應。

4.2克氏棒狀桿菌的特異性

分別以白喉棒狀桿菌atcc39255、假白喉棒狀桿菌cmcc38203、痤瘡棒狀桿菌atcc6919、潰瘍棒狀桿菌atcc9015、谷氨酸棒狀桿菌atcc13032、結膜干燥棒狀桿菌atcc373、克氏棒狀桿菌dsm44385、牛棒狀桿菌atcc7715、鳥分枝桿菌亞種副結核分枝桿菌atcc19698、星狀諾卡氏菌atcc19247和粘性放線菌atcc15987的基因組dna為模板，以實施例1步驟2的針對克氏棒狀桿菌的檢測引物和檢測探針作為引物和探針，按照實施例1步驟2的熒光定量pcr反應體系和熒光定量pcr擴增程序進行熒光定量pcr擴增。擴增結果表明，白喉棒狀桿菌atcc39255、假白喉棒狀桿菌cmcc38203、痤瘡棒狀桿菌atcc6919、潰瘍棒狀桿菌atcc9015、谷氨酸棒狀桿菌atcc13032、結膜干燥棒狀桿菌atcc373和牛棒狀桿菌atcc7715均為克氏棒狀桿菌陰性；克氏棒狀桿菌dsm44385為克氏棒狀桿菌陽性；鳥分枝桿菌亞種副結核分枝桿菌atcc19698、星狀諾卡氏菌atcc19247和粘性放線菌atcc15987均為克氏棒狀桿菌陰性。上述結果表明：本發明的針對克氏棒狀桿菌的檢測引物和檢測探針的特異性高，與分枝桿菌屬、諾卡氏菌屬和放線菌屬無交叉反應。

對于提取人膿液總dna時需要膿液的量，本發明沒有特別的限制，若膿液很黏稠，則取黃豆粒大小的膿液然后加溶液ga補足至200μl即可，若膿液很少，則用適量無菌1×pbs溶液沖洗拭子，取200μl即可。

由于本發明使用的檢測方法可以快速檢測樣本dna中的克氏棒狀桿菌和棒狀桿菌屬細菌。

棒狀桿菌屬細菌及克氏棒狀桿菌檢測的意義在于如果確診為棒狀桿菌屬細菌或克氏棒狀桿菌感染則對臨床的針對性選擇抗生素使用具有重要指導作用。合理的抗生素使用可有效縮短肉芽腫性乳腺炎的病程、避免手術切除乳腺組織，極大減輕患者生理和心里創傷。

序列表

<110>廣東省婦幼保健院

<120>一種棒狀桿菌屬細菌和克氏棒狀桿菌多重熒光定量pcr引物、探針、試劑盒和檢測方法

<160>8

<210>1

<211>21

<212>dna

<213>棒狀桿菌屬細菌

<400>1

tgatagctggttctccccgaa21

<210>2

<211>19

<212>dna

<213>棒狀桿菌屬細菌

<400>2

cgatctgggctgtttccct19

<210>3

<211>20

<212>dna

<213>克氏棒狀桿菌

<400>3

agaaccttacctgggcttga20

<210>4

<211>18

<212>dna

<213>克氏棒狀桿菌

<400>4

cgctcgttgcgggactta18

<210>5

<211>20

<212>dna

<213>棒狀桿菌屬細菌

<400>5

gtcccgctmaaccawccagt20

<210>6

<211>16

<212>dna

<213>克氏棒狀桿菌

<400>6

actggatgcggccaga16

<210>7

<211>1501

<212>dna

<213>克氏棒狀桿菌（corynebacteriumkroppenstedtii）dsm44385

<400>7

cctggctcaggacgaacgctggcggcgtgcttaacacatgcaagtcgaacggaaaggccc60

tgcttgcagggtgctcgagtggcgaacgggtgagtaacacgtgggtgatctgccccttac120

tttgggataagcctgggaaactgggtctaatactggataggaccatgctgtaggtggtgt180

ggtggaaagattttttcggtaagggatgagctcgcggcctatcagcttgttggtggggta240

atggcctaccaaggcgtcgacgggtagccggcctgagagggtggacggccacattgggac300

tgagatacggcccagactcctacgggaggcagcagtggggaatattgcacaatgggcgca360

agcctgatgcagcgacgccgcgtgggggatgacggccttcgggttgtaaactcctttcag420

ccatgacgaagcccttgtggtgacggtagtggtagaagaagcaccggctaactacgtgcc480

agcagccgcggtaatacgtagggtgcgagcgttgtccggaattactgggcgtaaagagct540

cgtaggtggtctgtcgcgtcatttgtgaaagcccggggcttaactccgggttggcaggtg600

atacgggcatgactggagtactgtaggggagactggaattcctggtgtagcggtgaaatg660

cgcagatatcaggaggaacaccggtggcgaaggcgggtctctgggcagtaactgacgctg720

aggagcgaaagcatgggtagcgaacaggattagataccctggtagtccatgccgtaaacg780

gtgggcgctaggtgtgggtttccttccacgggatccgtgccgtagctaacgcattaagcg840

ccccgcctggggagtacggccgcaaggctaaaactcaaaggaattgacgggggcccgcac900

aagcggcggagcatgtggattaattcgatgcaacgcgaagaaccttacctgggcttgaca960

tgcactggatgcggccagagatggttgttccctttgtggctggtgtgcaggtggtgcatg1020

gttgtcgtcagctcgtgtcgtgagatgttgggttaagtcccgcaacgagcgcaacccttg1080

tctcgtgttgccagcatttggttggggactcgcgggagactgccggggttaactcggagg1140

aaggtggggatgacgtcaaatcatcatgccccttatgtccagggcttcacacatgctaca1200

atggctggtacagagagttgcgataccgtgaggtggggctaatctcttaaagccagtctc1260

agttcggattggagtctgcaactcgactccatgaagtcggagtcgctagtaatcgcagat1320

cagcaatgctgcggtgaatacgttcccgggccttgtacacaccgcccgtcacgtcatgaa1380

agttggtaacacccgaagccggtggcctaaactcgttagggagccgtcgaaggtgggatt1440

ggcgattgggacgaagtcgtaacaaggtagccgtaccggaaggtgcggctggatcacctc1500

c1501

<210>8

<211>3087

<212>dna

<213>谷氨酸棒狀桿菌（corynebacteriumglutamicum）atcc13032

<400>8

ttgttgttttgtagggcacacggtggatgccttggcatatcaagccgatgaaggacgtga60

gaggctgcgttatgcctcggggagttgccaactaagcgttgatccgaggatgtccgaatg120

gggaaacccagccgcagtgatgtgtggttacctgccagtgaatgtatagctggtgtggag180

gtttacacggggaagtgaaacatctcagtacccgtaggagaagaaaacaattgtgattcc240

gttagtagtggcgagcgaacgtggatgatggctaaaacttatgtgtgtgatacccggcag300

gggttgcatgtaggtggttgtggggcaatgacgttcatattctgccggatgtgggcatgt360

gctgcgtggttagtggaagtggtgtggaaacacctgccgtagaaggtgagagtcctgtac420

acgaagatcatggtggtgtgtgtggttgttgataccccgagtagcagcgggctcgtggaa480

tctgctgtgaattagccgggaccacccggtaagcctgaatacttgatatgaccgatagcg540

gattagtaccgtgagggaatggtgaaaagtaccccgggaggggagtgaaatagtacctga600

aaccgtgtgctgtcaatccgtcagagcatcctttgtggtgtgatggcgtgccttttgaag660

aatgagcctgcgagtcagcggcatgtcgcgaggttaacccgtgtggggtagccgtaggga720

aaccgaatcctaacgagggtgattttagtggcatgtcttggacccgaagcggagtgatct780

acccatggccagtgtgaagcagctgtaagaggttgtggaggcgcgaacccacttaggttg840

aaaactgaggggatgagttgtgggtaggggtgaaaggccaatcaaactccgtgatagctg900

gttctccccgaaatgcatttaggtgcagcgtcgtgtgtttcttgccggaggtagagctac960

tggatggtttagcgggaccaacatcttagcgacatcagccaaactccgaatgccggtaag1020

ttagagcacggcagtgagactgcgggggataagcttcgtagtcgagagggaaacagccca1080

gatcgccggctaaggcccctaagggtgtgctaagtggaaaaggaggtggggtcgcgaaga1140

cagccaggaggttggcttagaagcagccatccttgaaagagtgcgtaatagctcactggt1200

cgagtgattccgcgccgacaatgtagtggggcttaagtacaccgccgaagccgcggcaat1260

gatctttataggattgttgggtaggggagcgtcgtgcatgcgttgaagctttggggtgac1320

cttgggtggagtgtgtgcgagtgagaatgcaggcatgagtaacgaatgatgcgtgagaaa1380

cgtatccgccggatgactaagggttcctgggtcaagttaatcttcccagggtgagtcggg1440

gcctaaggcgaggccgacaggcgtagtcgatggataacgggttgatattcccgtacccga1500

gtatgagcgaccatggtgaatcagtgatactaaccacccataagcacccgcgaaaaggct1560

ttgcttttttgtggtgtgtggttgcgtgggacctgatctggtagtagctaagtgatgggg1620

tgacgcagggaggtagctcagccacttattggattgtggtgtaagcgtgtggcacgcagt1680

gttggtaaatccgcactgtttttgtgtgaggcgtgatgcggagcccgtaaagggtgaagt1740

gggtgatcctgtgctgtcgagaaaagcctctagcgatgttgatattcggcccgtacccta1800

aaccgacacaggtagtcaggtagagaatactaaggcgttcgggtgaactgtggttaagga1860

actcggcaaaatgcccccgtaacttcgggagaaggggggccacggcgtgtgaacaacttt1920

tcgttgggagcgtgttgtggtcgcagagaatagagggaagcgactgtttactaaaaacac1980

aggtccgtgcgaagacgtttaagttgatgtatacggactgacgcctgcccggtgctggaa2040

ggttaagaggaccggttaggaaaacttgttttttcgaagctgagaatttaagccccagta2100

aacggcggtggtaactataaccatcctaaggtagcgaaattccttgtcgggtaagttccg2160

acctgcacgaatggcgtaacgacttccctgctgtctcaaccacaggcccggtgaaattgc2220

agtacgagtaaagatgctcgttacgcgcggcaggacgaaaagaccccgggaccttcacta2280

tagcttggtattggtgtttgattcggtttgtgtaggataggtgggagacttcgatcatat2340

gacgctagttgtgtgtgagtcgttggtgaaataccactctgatcggattggatgtcttaa2400

ccttggcccatgatctgggttggggacagtgcctggtgggtagtttaactggggcggttg2460

cctcctaaaatgtaacggaggcgcccaaaggtttcctcagcttggttggtaatcaggtgg2520

tgagtgtaagtgcacaagggagcttgactgtgacactgacaggtggagcagggacgaaag2580

tcgggactagtgatccggcacctacttgtggttgtggtgtcgctcaacggataaaaggta2640

ccccggggataacaggctgatcttccccaagagtccatatcgacgggatggtttggcacc2700

tcgatgtcggctcgtcgcatcctggggctggagtaggtcccaagggttgggctgttcgcc2760

cattaaagcggcacgcgagctgggtttagaacgtcgtgagacagttcggtctctatccgc2820

cgcgcgcgttgaaacttgaaggaaggctgtccctagtacgagaggaccgggacggacgta2880

cctctggtgtgccagttgttccgccaggagcagggctggttggctacgtacgggagggat2940

aaccgctgaaagcatctaagcgggaagcctgtttcgagatgaggtttcttttgaggttcc3000

ctagagattatggggttgataggccagatctggaagcactgtgaggtgtggaggtgactg3060

gtactaatttaccgataacaacaaacc3087