高靈敏監測POPs的轉熒光蛋白基因魚的制作與應用的制作方法

文檔序號：11230094閱讀：1124來源：國知局

本發明涉及基因工程與環境科學領域，特別是涉及一種高靈敏監測pops的轉熒光蛋白基因魚的制作與應用。

背景技術：

生物監測是指從生物學角度評價環境質量狀況的過程，通過觀測生物個體、種群或群落對環境質量及其變化所產生的反應和影響，進而闡明其所處環境污染的性質、程度和范圍，包括生物種群及群落調查、急性慢性毒性試驗、水體微生物測試和魚類組織污染物分析。德國是最早開展生物監測的國家，早在20世紀初，已經開展利用水生生物監測水質的工作，時至今日，歐盟、美國等發達國家均已建立了相對比較完備的環境生物監測體系。中國起步相對較晚，1993年隨著《水生生物監測手冊》的出版，初次建立了國家水生生物監測網，開始在全國范圍內開展水生生物監測工作。直至21世紀初，生物監測工作才再次得到重視。

目前傳統的生物監測方法，耗時費力，且不能用于直觀監測。2001年，mattingly等證實人的cyp1a1啟動子在tcdd的誘導下在48hpf前胚胎中可以觀察到gfp的局部表達，但不能用于活體直觀監測。2004年，nebert等公布了利用luc轉基因斑馬魚監測芳香烴類pops的專利(專利號：us20040147030)，但是該技術所使用的斑馬魚所轉基因為luc，檢測持續性有機物靈敏度低，同時也不能解決外源基因在受體魚中的整合、表達和遺傳問題；此外，檢測luc基因表達需要特殊儀器。因而，他們所研制的轉luc基因斑馬魚一直未能在環境有毒污染物的監測中得到實際應用。ngghb(2013)制作了轉綠色熒光蛋白青鳉以及kun-heekima(2013)制作了轉綠色熒光蛋白斑馬魚，這個綠色熒光蛋白前帶有可以誘導的cyp1a啟動子，在進行tcdd暴露后青鳉和斑馬魚熒光表達均有不同程度的增強，但是這些轉基因魚只在實驗室內進行毒物的檢測，并沒有將其應用到環境監測中來，并且綠色熒光在顯微鏡觀察下腹部具有明顯的背景值，不便于觀察。因此構建熒光蛋白斑馬魚并在環境中進行有效應用是當前急需解決的問題。

技術實現要素：

鑒于以上所述現有技術的缺點，本發明的目的在于提供一種監測pops的轉熒光蛋白基因魚的制作與應用，用于解決現有技術中監測環境中有毒物質時靈敏度低、不便于觀察等問題。

為實現上述目的及其他相關目的，本發明第一方面提供一種監測pops的轉熒光蛋白基因魚的培養方法，包括如下步驟：

1)獲取響應啟動子：提供能被pops誘導表達的基因的啟動子序列，設計引物，擴增得到對持續有機污染物有響應的啟動子，即響應啟動子；

2)載體構建：將步驟1)獲得的響應啟動子連接到載體中，得到連接有響應啟動子的載體，即響應載體，所述響應載體還包括熒光蛋白序列；

3)注射培養：將核酸酶與步驟2)獲得的響應載體共同注射至魚的受精卵，培養獲得能夠監測水體中pops的轉熒光蛋白基因魚。

進一步地，步驟1)中，被pops誘導表達的基因選自cyp1a基因。

進一步地，步驟1)中，所述響應啟動子選自cyp1a啟動子，所述cyp1a啟動子含有如seqidno.1所示的序列。

進一步地，步驟3)中，所述魚選自斑馬魚，當然，其他魚類也可適用。根據魚的種類擴增其cyp1a啟動子序列。

進一步地，所述pops選自tcdd、pahs中的至少一種。pahs包括但不限于nap、phe、baa、bap、bghip。

進一步地，步驟1)中，提取并純化魚的基因組dna，通過巢式pcr獲得響應啟動子。

進一步地，步驟1)中，巢式pcr第一輪反應的引物為cyp1a-nested-f和cyp1a-nested-r，cyp1a-nested-f的序列如seqidno.2所示，cyp1a-nested-r的序列如seqidno.3所示。

進一步地，步驟1)中，巢式pcr第二輪反應的引物為cyp1a-apa1-f和cyp1a-apa1-r，cyp1a-apa1-f的序列如seqidno.4所示，cyp1a-apa1-r的序列如seqidno.5所示。

進一步地，步驟2)中，所述響應載體帶有i-scei大范圍核酸酶轉移系統。

進一步地，步驟2)中，所述熒光蛋白選自mcherry。

進一步地，步驟1)中，將pcr產物與peasy-blunt3cloningvector連接，獲得peasy-cyp1apromoter質粒。

進一步地，步驟2)中，采用轉染試劑將響應載體瞬時轉染至細胞中，污染物暴露，篩選得到對pops有響應效果的響應載體，轉入下一步進行注射。

進一步地，步驟3)中，所述核酸酶選自i-scei酶。

進一步地，步驟3)中，將核酸酶與步驟2)獲得的響應載體共同注射至魚的受精卵，培養獲得f0代魚，篩選獲得對pops有響應的f0代魚，將有響應的f0代魚與野生型魚雜交，收集魚卵，污染物暴露，篩選得到對pops有響應的f1代魚，f1代魚再次與野生型魚雜交，收集魚卵，污染物暴露，篩選得到對pops有響應的f2代魚，將f2代魚自交，獲得f3代魚，從f3代魚中篩選得到對pops有響應的純系轉熒光蛋白基因魚。

本發明第二方面提供上述方法培養獲得的轉熒光蛋白基因魚。

本發明第三方面提供上述轉熒光蛋白基因魚在監測水體pops中的應用。

本發明第四方面提供一種響應載體，所述響應載體帶有i-scei大范圍核酸酶轉移系統，所述響應載體包括響應啟動子序列以及熒光蛋白序列。

進一步地，所述響應啟動子選自cyp1a啟動子，所述cyp1a啟動子含有如seqidno.1所示的序列。

進一步地，所述熒光蛋白選自mcherry。

本發明第五方面提供上述響應載體用于培養熒光蛋白基因魚的用途。

如上所述，本發明的一種監測pops的轉熒光蛋白基因魚的制作與應用，具有以下有益效果：本發明針對目前傳統水環境pops(持續性有機污染物)監測方法繁瑣，且需昂貴的儀器及專業的技術人員，不能實現對環境pops進行有效的監測等缺陷，本發明利用pcr技術原理，從魚的自身獲得對pops敏感的cyp1a基因啟動子，并構建攜帶i-scei大范圍核酸酶轉移系統和熒光蛋白的pi-scei-cyp1apromoter-mcherry質粒，最后通過顯微注射技術，獲得可以對水體中pops進行簡單、高效、直觀監測的轉紅色熒光斑馬魚。因此，與傳統的pops監測手段相比，本發明提供了一種方便快捷的生物監測手段，對實現pops實時監測有重要的推動作用。

附圖說明

圖1顯示為本發明實施例的pi-scei-cyp1apromoter-mcherry質粒圖譜。

圖2顯示為本發明實施例的細胞熒光驗證圖。

圖3顯示為本發明實施例中采用tcdd暴露轉紅色熒光斑馬魚之后的熒光驗證圖。

圖4顯示為本發明實施例中不同pahs暴露轉紅色熒光斑馬魚之后的熒光圖。

圖5顯示為本發明實施例中各土樣提取液暴露轉紅色熒光斑馬魚之后的熒光圖。

圖6顯示本發明實施例中各土樣提取液暴露轉紅色熒光斑馬魚之后的熒光強度定量圖。

圖7顯示為本發明實施例中各土樣的pahs含量圖。

具體實施方式

以下通過特定的具體實例說明本發明的實施方式，本領域技術人員可由本說明書所揭露的內容輕易地了解本發明的其他優點與功效。本發明還可以通過另外不同的具體實施方式加以實施或應用，本說明書中的各項細節也可以基于不同觀點與應用，在沒有背離本發明的精神下進行各種修飾或改變。

實施例1

一、cyp1a啟動子擴增

1、斑馬魚基因組dna提?。喝∫吧蚢b斑馬魚，剪取尾鰭20-30mg于蒸餾水中漂洗數次，吸水紙吸干表面水分，置于1.5ml離心管中，眼科剪剪碎，按takara組織提取試劑盒操作說明，加入組織裂解液200μl，蛋白酶k20μl，rna酶10μl，漩渦混勻，置于56℃水浴鍋裂解2-3h，至無明顯組織塊。后續按試劑盒說明進行基因組dna的提取與純化。采用的試劑盒為takaramninbestuniversalgenomicdnaextactcionkitver5.0，貨號：9765，供應商：寶生物工程(大連)有限公司。cyp1a基因是根據文獻查找，根據前人的實驗結果得到，其具體公開于：zeruthg1,pollenzrs.isolationandcharacterizationofadioxin-induciblecyp1a1promoter/enhancerregionfromzebrafish(daniorerio)zebrafish2(3),197-210(2005)。

2、pcr擴增：根據在ncbi上查詢所得cyp1a啟動子序列，其序列如seqidno.1所示，用primer5引物設計軟件進行引物設計。利用hsdnapolymerase進行巢式pcr，第一輪反應采用引物cyp1a-nested-f(其序列如seqidno.2所示)和cyp1a-nested-r(其序列如seqidno.3所示)，pcr反應體系為50μl，具體包括：5xprimestarbuffer(mg²⁺plus)10μl、dntpmixture(2.5mmeach)4μl、cyp1a-nested-f+rmix1μl、hsdnapolymerase0.5μl、zebrafishgenomedna1μl、ddh2o33.5μl；pcr反應程序為：98℃預熱2min，98℃變性10s，55℃退火15s，72℃延伸3min，共30個循環，最后72℃延伸10min；以第一輪反應液為模板進行第二輪pcr反應，引物為cyp1a-apa1-f和cyp1a-age1-r，cyp1a-apa1-f序列如seqidno.4所示，cyp1a-age1-r序列如seqidno.5所示，反應體系同第一輪反應，反應退火溫度提高到58℃，待反應結束后，采用1％瓊脂糖凝膠電泳檢測pcr產物，利用天根瓊脂糖凝膠回收試劑盒(該試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司)回收目的條帶，回收方法按試劑盒操作說明進行操作。

3、目的片段連平端載體并測序：膠回收pcr產物與peasy-blunt3cloningkit(貨號：cb301-01生產商：北京全式金生物技術有限公司)連接，克隆反應體系為5μl，具體包括：pcr產物50ng、peasy-blunt3cloningkit1μl，總體積不足5μl時，用水補足至5μl，25℃反應18min，反應結束后將連接產物加入50μltrans1-t1感受態細胞中，輕彈混勻，冰浴30min，42℃熱激30s，立即置于冰上2min，加入250μl平衡至室溫的lb培養基，在200rpm(搖床轉速)、37℃下培養1h。5000rpm離心1min，棄掉部分上清，剩余部分混勻，取全部菌液涂la平板，37℃過夜培養。次日菌落pcr挑取陽性克隆，搖菌過夜，提質粒送江蘇金維智生物科技有限公司測序，測序結果與ncbi序列進行比對，與預期結果一致，該載體命名為peasy-cyp1apromoter。

二、質粒構建

1、質粒酶切回收目的條帶：將質粒peasy-cyp1apromoter和質粒pi-scei-cmv-mcherry質粒(實驗室已有質粒，其序列如seqidno.12所示)用賽默飛快切酶apai和agei進行雙酶切，37℃恒溫水浴鍋放置30min，瓊脂糖凝膠電泳回收cyp1apromoter片段和pi-scei–mcherry骨架。cyp1apromoter即cyp1a啟動子，其序列如seqidno.1所示，pi-scei–mcherry骨架序列如seqidno.10所示?？烨忻竌pai和agei均購自賽默飛世爾科技(中國)有限公司。mcherry序列如seqidno.8所示。

2、采用t4dna連接酶(購自賽默飛世爾科技(中國)有限公司)進行連接反應：20μl反應體系包括10×buffer2μl、cyp1apromoter片段50ng、pi-scei–mcherry骨架100ng、t4dna連接酶0.2μl、余量為水。pcr儀中22℃連接1h，取10μl加入100μl感受態中，輕彈混勻，冰浴30min，42℃熱激90s，立即置于冰上2min，加入850μl平衡至室溫(25℃)的lb培養基，180rpm、37℃培養1h。5000rpm離心1min，棄掉部分上清，剩余混勻，取全部菌液涂la平板，37℃過夜培養。次日菌落pcr挑取陽性克隆，搖菌過夜，提質粒酶切鑒定，陽性質粒送江蘇金維智生物科技有限公司測序，測序結果與預期一致，該載體命名為pi-scei-cyp1apromoter-mcherry，圖1所示為pi-scei-cyp1apromoter-mcherry質粒圖譜。pi-scei-cyp1apromoter-mcherry的序列如seqidno.9所示。

三、質粒熒光誘導效果驗證

1、細胞傳代鋪板：利用人肝癌細胞hepg2進行熒光誘導效果驗證試驗，將25ml細胞培養瓶中細胞消化傳代至96孔細胞培養板中，接種細胞數量為1×10⁴個/孔，培養基為有血清無抗生素高糖dmem培養基。胎牛血清(fbs)含量為10％；dmem，highglucose(貨號：11965175)；胎牛血清(fbs)貨號：10100147。dmem與胎牛血清均購自賽默飛世爾科技(中國)有限公司。

2、細胞轉染：第二天，待上述96孔板中細胞長至70～80％融合，將步驟二中構建好的質粒pi-scei-cyp1apromoter-mcherry利用viafect^tm轉染試劑(名稱：viafect^tmtransfectionreagent；貨號：e4981；供應商：普洛麥格(北京)生物技術有限公司)進行細胞轉染，轉染液體系為：10μldmem、0.1μg質粒、0.3μl轉染試劑，配制混合物時，先加質粒至dmem培養基中混合均勻，然后將轉染試劑直接加入到培養基中，不要沾到離心管壁上，立即吹打混勻，室溫孵育10min。然后將混合物滴加至培養的細胞中，輕輕吹打混合均勻，繼續培養6-8h。

3、tcdd梯度暴露：tcdd設置的濃度梯度為0、0.01、0.05、0.1和0.5nm，按照濃度要求加入完全培養基中，細胞繼續培養24h，利用熒光倒置顯微鏡觀察熒光表達情況，如圖2所示為細胞熒光圖，其中，c圖是指沒有轉染質粒的細胞熒光圖。

四、顯微注射

顯微注射采用eppendorffemtojet4i顯微注射儀。顯微注射前夜，挑取性成熟ab型斑馬魚雌雄魚進行配對，雌雄數量比例為1:1(雌雄斑馬魚各兩條)，雌雄魚用隔板分開，待第二天開燈后根據注射需要依次打開隔板，打開隔板后，雄魚追尾雌魚，數分鐘后雌性斑馬魚即可排卵，收集受精卵用清水簡單清洗，用吸管依次排放在注射凹槽中。取步驟三驗證的重組質粒pi-scei-cyp1apromoter-mcherry，將該重組質粒和i-scei酶共注射到斑馬魚一細胞期胚胎中，注射液體系為10μl：pi-scei-cyp1apromoter-mcherry質粒終濃度20～50ng/μl、10×buffer1μl、i-scei酶0.5μl、酚紅0.5μl，加雙蒸水補足至10μl。注射時，根據毛細玻璃管針尖大小，調試合適的注射壓力和注射時間，注射針從植物極穿過到達動物極，輕踏注射踏板可以看到紅色注射液進入胚胎動物極，輕輕抽出即可完成注射，單個胚胎質粒注射量控制在20-50pg。斑馬魚1細胞期的時間約為0.5h，超過1細胞期的胚胎不進行注射。注射完成后吸取孵化水將胚胎從注射盤上沖洗到一個干凈的培養皿中，28℃恒溫培養，獲得轉基因斑馬魚f0代。

五、純合子篩選

1、斑馬魚基因組dna提?。簩⒉襟E四顯微注射所得斑馬魚胚胎精心飼養至兩月齡。剪取尾部，雙蒸水漂洗數次，吸水紙吸干表面水分，鑷子夾取放入1.5ml離心管中，用眼科剪盡量剪碎，加入100μlctab(hexadecyltrimethylammoniumbromide，十六烷基三甲基溴化銨)裂解液(100mmtris-hclph8.5,0.5medta,10％sds,5mnacl)，同時加入1μl20mg/ml的蛋白酶k漩渦振蕩混勻，55℃水浴裂解2-3h，中間漩渦振蕩混勻數次，直至組織塊完全裂解。加入150μl氯仿，顛倒混勻，12000rpm離心4min，小心吸取上清(約80μl)至新的0.6ml離心管中，加入等體積的異丙醇，顛倒混勻可見絮狀沉淀，12000rpm離心4min，棄上清，加入300μl75％乙醇，顛倒懸浮洗滌沉淀，10000rpm離心4min，棄上清，倒置晾干，加入20μl雙蒸水溶解沉淀，微量分光光度計進行濃度和純度檢測。

2、pcr檢測目的基因：根據注射外源質粒pi-scei-cyp1apromoter-mcherry的序列設計檢測引物，pcr反應采用fasttaqdna聚合酶(購自北京全式金生物技術有限公司)，反應體系為20μl，具體包括：10xbuffer2μl、dntpmix1.6μl、fasttaqdnapolymerase0.1μl、10μm引物cyp1a-jc-f和cyp1a-jc-r的混合液0.4μl、斑馬魚基因組dna模板1μl、雙蒸水14.9μl。反應程序為：94℃3min，94℃5s，55℃15s，72℃10s；共35個循環，72℃延伸5min，16℃保存。反應結束后，采用瓊脂糖凝膠電泳檢測。引物cyp1a-jc-f序列如seqidno.6所示，引物cyp1a-jc-r序列如seqidno.7所示。

3、連接pmd-19t送測序驗證：取上述步驟2中有目的條帶的陽性pcr產物2μl，加入2μl雙蒸水和1μlpmd-19t載體(名稱：pmd-19tvectorcloningkit；貨號：6013；供應商：寶生物工程(大連)有限公司)，加入5μlsolutioni混勻，16℃反應30min。反應結束后，取反應液加入100μl感受態中，用槍頭輕輕攪拌混勻，冰浴30min，42℃熱激1.5min，加入850μllb培養基，180rpm、37℃恒溫搖床活化1h，5000rpm離心1min，棄部分上清，余下部分混勻涂布在具有羧芐青霉素的lb平板(羧芐青霉素在lb培養基中的濃度為100μg/ml)上，37℃倒置過夜培養。次日，菌落pcr驗證，陽性菌落搖菌過夜擴大培養，提質粒送江蘇金維智公司測序，測序結果如seqidno.11所示，與預期一致。

4、f0代陽性轉基因魚后代驗證：取前述步驟四獲得的轉基因斑馬魚f0代，將f0代轉基因斑馬魚與野生斑馬魚進行一對一配對，收集f1代受精卵，次日隨機挑取5顆，按照步驟1-2的方法提取基因組dna，并進行pcr驗證。對pcr擴增獲得陽性條帶的受精卵，加入終濃度為1nm的tcdd進行暴露，暴露2天，熒光顯微鏡觀察熒光。將具有熒光的仔魚挑出進行飼養，直至性成熟。

5、轉紅色熒光斑馬魚純合子篩選：篩選出有紅色熒光表達的f1代，繼續培養至性成熟，再次與野生型斑馬魚雜交，低濃度tcdd暴露獲得有熒光表達的斑馬魚f2代，最后將篩選的f2代斑馬魚培育至性成熟后自交獲得f3代，f3代與野生型雜交，若后代均有熒光表達，則表示該f3代個體為純合子。

六：化學標準品和環境樣品檢測

1、轉熒光斑馬魚胚胎收集：試驗前夜，將轉基因紅色熒光蛋白斑馬魚品性成熟雌雄斑馬魚配對，次日收集胚胎于28℃恒溫培養箱12h，剔除其中未受精的斑馬魚胚胎。

2、化學標準品暴露：tcdd暴露共設置0.05、0.1、0.5、1和5nm五個濃度梯度，五種多環芳烴(pahs)暴露濃度為0μm萘、10μm菲、10μm苯并蒽、1μm苯并芘、10μm苯并苝，用dmso作為對照組，每個濃度梯度設置3個平行樣，每個平行樣放置50顆胚胎。胚胎置于生化恒溫培養箱培養60h，期間注意觀察，及時清除死卵，避免惡化水質。暴露結束，ms-222麻醉，利用nikon體式熒光顯微鏡進行熒光觀察記錄。

3、環境樣品暴露：

3.1、樣品來源：巴基斯坦卡拉奇電子垃圾回收站點土樣，采自卡拉奇三個地區共14個采樣點：lyari(ly124°85'71"n66°99'44"e、ly224°86'51"n67°01'96"e、ly324°88'09"n67°02'26"e、ly424°86'62"n67°08'52"e)、surjanitown(sj125°06'01"n67°06'01"e、sj225°02'77"n67°07'40"e、sj325°05'28"n67°11'83"e、sj425°02'23"n67°11'77"e、sj524°97'53"n66°09'64"e)和jacoblines(jc124°86'81"n67°02'40"e、jc224°85'26"n67°04'39"e、jc324°87'50"n67°04'42"e、jc424°86'99"n67°09'76"e、jc524°89'46"n67°07'64"e)。其中16種pahs含量由該地球化學所分析提供。

3.2、樣品處理：采用quechers方法對土樣中的pahs進行提取。在50ml玻璃離心管中加入4g電子垃圾樣品、4gmgso4和1gnacl，然后加入10ml提取溶劑(按體積計，二氯甲烷：己烷＝1:1)。漩渦振蕩混勻，室溫放置過夜。次日，漩渦振蕩15min，超聲2min，重復兩次。2500rpm離心5min，吸取上清液至30ml玻璃離心管中，加入150mg硫酸鎂和25mgpsa。漩渦振蕩2min，2500rpm離心5min。吸取上清液5ml到8ml棕色樣品瓶中，氮吹儀吹干，加入1mldmso漩渦振蕩重新溶解，振蕩時注意轉速，避免將液體振蕩到蓋子上。

3.3、樣品提取液暴露轉基因熒光斑馬魚胚胎：按步驟1中方法收集轉基因熒光斑馬魚胚胎，采用90mm玻璃培養皿進行暴露，每個培養皿中加入50顆胚胎、30ml去離子水，并加入30μl上述步驟3.2中電子垃圾樣品提取液，對照組加30μldmso，倒八字混勻，置于28℃生化恒溫培養箱中暴露60h，每個樣品三個平行。暴露結束用nikon熒光體式顯微鏡對暴露幼魚進行熒光觀察，并進行熒光強度測定。

4、轉基因熒光斑馬魚檢測結果分析

4.1、化學標準品檢測驗證

利用不同梯度tcdd暴露轉基因熒光斑馬魚結果如圖3所示，斑馬魚熒光強度隨暴露濃度的增加而增加，具有明顯的濃度依賴效應。圖4中pahs暴露結果顯示，萘和菲無明顯的誘導效果，苯并苝有誘導效果但不是很明顯；苯并芘誘導效果最為明顯，可見腹部熒光明顯增強，苯并蒽熒光誘導效果次之。

4.2、電子垃圾掩埋點附近土樣浸提液暴露結果

圖5顯示為各土樣提取液的暴露結果圖，nc是指沒有暴露的對照組結果圖；圖6顯示為各土樣提取液暴露的斑馬魚熒光強度圖，c是指沒有暴露的斑馬魚熒光強度圖。

如圖7所示為各土樣的pahs含量圖，三個地區中，采自lyari的土樣pahs含量最高，其熒光誘導效果也最明顯。熒光強度和樣品中pahs含量總體趨勢一致。但樣品中成分相對比較復雜，不能達到一一對應的效果。

三個地區土樣中pahs含量數據如下表1所示：

表1

綜上所述，本發明針對目前傳統水環境持久性有機污染物(pops)檢測方法繁瑣，且需昂貴的儀器及專業的技術人員，不能實現對環境pops進行有效的檢測等缺陷，本發明利用pcr技術原理，從魚的自身獲得對pops敏感的cyp1a基因啟動子，并構建攜帶iscei大范圍核酸酶轉移系統和熒光蛋白的pi-scei-cyp1apromoter-mcherry質粒，最后通過顯微注射技術，獲得可以對水體中pops進行簡單、高效、直觀監測的轉熒光斑馬魚。因此，與傳統的pops檢測手段相比，本發明提供了一種方便快捷的生物檢測手段，對實現pops實時監測有重要的推動作用。

上述實施例僅例示性說明本發明的原理及其功效，而非用于限制本發明。任何熟悉此技術的人士皆可在不違背本發明的精神及范疇下，對上述實施例進行修飾或改變。因此，舉凡所屬技術領域中具有通常知識者在未脫離本發明所揭示的精神與技術思想下所完成的一切等效修飾或改變，仍應由本發明的權利要求所涵蓋。

sequencelisting

<110>中國科學院重慶綠色智能技術研究院

<120>高靈敏監測pops的轉熒光蛋白基因魚的制作與應用

<130>pcqls171969

<160>12

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>2685

<212>dna

<213>artificial

<220>

<223>cyp1a啟動子序列

<400>1

agccgaacaggagggtaaatagagcagaactagtgaacctcttctcctcctccagctcac60

gcaacgtggccaatctttaacccgcgctacaggtgcgcgcacgcgatgctgtttgatcag120

tttatcgtagcgtgtttcacacagcgataacagtctgaggtcgcaggaactcttcccata180

aacccaccgcagaacaaacactccggctttaacactcctcgtgcttttgtgcatgaaccg240

ctgacatgcacgctctccgacggccacgcgcgtctaccccattctgccagctcttcctgt300

tgacagtcaatgagatgcatgaaaaatgtgtgaaggaatctgcagcagcggttcacaaac360

gcacgcacacactctcacacacacacacctttgcacgcgatgctttacctgttgcttaat420

gagttacgagcgcgtgccagatcagcagagactcaaacatgcaggcaattatcggatgtg480

ttgcaacaaacaatttatttagttcacataattgcctaaaccatcacactgatttatgac540

actttagcttagacagctttaaaagataaataaacatctcgagcatgctgtttaactttt600

catgatttatatattctgattttattgggcttatttatttctcgcataataattatgcgc660

attgagtttgctgtatagtgctctctgtgtgtgtttttaagagttgtgatgaaatgtgag720

attgatttctcagttaatgcacgtcgcttttgtctacaaactgttctgtaaaatattaac780

attattacataacatcaaaaacaccgataagcccagttctgcctaattataaaggctaat840

taagcgtctcatttattaatttatttcatttatttatgttttaaatatatatttgtttac900

atattgcaatttagttggaaatgcatgttaaaaatattagtgctgtataattattaccca960

atcaaaaatgttgcatttgtgttaatattgacatatatatgatcacattacataaatatt1020

gacatatatattattacaatacataaatattgacatatatataataacgttacataaata1080

ttgacatatatgattacgttacataaatattgacatatatataattacgttacataaata1140

ttgatatatatataattacattacataaatattagcatatatatatatataattacataa1200

atattgacatatatatttaattacaatacataaatattgacatatatataattacattac1260

ataaatattgacatatatgattacattacataaatattgacatatataattacgttacat1320

aaatgttgagatatatatacaattacaatacataaatattggcatatatataattacgat1380

aaataaatattgacatatatatatatataattacaatacataaatattgacatatatgat1440

tacgttacataaatattgacacatatatattacattacataaatattgataaatatataa1500

ttacatacataaatattggcatatatattacgttacataaatattgatatatatataatt1560

acattacataaatattagcatatatatatatataattacataaatattgacatatatatt1620

taattacaatacataaatattgacatatatataattacattacataaatattgacatata1680

tgattacattacataaatattgacatatataattacgttacataaatgttgagatatata1740

tacaattacaatacataaatattggcatatatataattacgataaataaatattgacata1800

tatatatatataattacaatacataaatattgacatatatgattacgttacataaatatt1860

gacacatatataattacattacataaatattgataaatatataattacaatacataaata1920

ttggcatatataattacgttacataaatattgacatatatttgattttattaaataaata1980

ttggcatatatataattacattacataaatattgacatatatatgattacattgcataaa2040

tattgacatatatatatatatatttacttactttacataaatattgacatatttgactta2100

gtccctttaatcaggggtcgctactgcggaatgaaccgccaacttatccagcatagtttt2160

tacgcagcagatgcccttccagctgcaacccaacactgggaaacacacataccctctcat2220

tcacacgcacactcatacactacggccaatttagttcatcagttcccctatagtgcatgt2280

gtttggactgtggggaaaaccggagcacccggaggaaacccacgccatgcaaacttcaca2340

cagaaatgccagctgacccagctcgaaccagcgatcgtgctactcactgcactttataaa2400

tatatatttttcattcataacttttatatacattttacatagtcttttgtaccatgtatg2460

tgtgcgtgtgttacatacatcaatctccttcccacagtttagatatgtgtgaggtgagtg2520

tgtgtaattactcagggagtttactcagtgcaatcgatcagcctgtaataaaatctcagc2580

ccttctcagcatcaaagcctcctgcgctcggtgacgtcacgcggaggacagccaatcacg2640

gcgagctctgcgctataaaagatttaccgctggaatagtgcagca2685

<210>2

<211>25

<212>dna

<213>artificial

<220>

<223>cyp1a-nested-f

<400>2

acaaaacaactcacagaaatcaacc25

<210>3

<211>26

<212>dna

<213>artificial

<220>

<223>cyp1a-nested-r

<400>3

taagacaaaaccattgacatcagact26

<210>4

<211>32

<212>dna

<213>artificial

<220>

<223>cyp1a-apa1-f

<400>4

gggccccagccgaacaggagggtaaatagagc32

<210>5

<211>31

<212>dna

<213>artificial

<220>

<223>cyp1a-age1-r

<400>5

accggtgctgcactattccagcggtaaatct31

<210>6

<211>23

<212>dna

<213>artificial

<220>

<223>cyp1a-jc-f

<400>6

atgtgtgaggtgagtgtgtgtaa23

<210>7

<211>20

<212>dna

<213>artificial

<220>

<223>cyp1a-jc-r

<400>7

gtcggaggggaagttggtgc20

<210>8

<211>708

<212>dna

<213>artificial

<220>

<223>mcherry序列

<400>8

atggtgagcaagggcgaggaggataacatggccatcatcaaggagttcatgcgcttcaag60

gtgcacatggagggctccgtgaacggccacgagttcgagatcgagggcgagggcgagggc120

cgcccctacgagggcacccagaccgccaagctgaaggtgaccaagggtggccccctgccc180

ttcgcctgggacatcctgtcccctcagttcatgtacggctccaaggcctacgtgaagcac240

cccgccgacatccccgactacttgaagctgtccttccccgagggcttcaagtgggagcgc300

gtgatgaacttcgaggacggcggcgtggtgaccgtgacccaggactcctccctgcaggac360

ggcgagttcatctacaaggtgaagctgcgcggcaccaacttcccctccgacggccccgta420

atgcagaagaagaccatgggctgggaggcctcctccgagcggatgtaccccgaggacggc480

gccctgaagggcgagatcaagcagaggctgaagctgaaggacggcggccactacgacgct540

gaggtcaagaccacctacaaggccaagaagcccgtgcagctgcccggcgcctacaacgtc600

aacatcaagttggacatcacctcccacaacgaggactacaccatcgtggaacagtacgaa660

cgcgccgagggccgccactccaccggcggcatggacgagctgtacaag708

<210>9

<211>6612

<212>dna

<213>artificial

<220>

<223>pi-scei-cyp1apromoter-mcherry質粒序列

<400>9

ctaaattgtaagcgttaatattttgttaaaattcgcgttaaatttttgttaaatcagctc60

attttttaaccaataggccgaaatcggcaaaatcccttataaatcaaaagaatagaccga120

gatagggttgagtgttgttccagtttggaacaagagtccactattaaagaacgtggactc180

caacgtcaaagggcgaaaaaccgtctatcagggcgatggcccactacgtgaaccatcacc240

ctaatcaagttttttggggtcgaggtgccgtaaagcactaaatcggaaccctaaagggag300

cccccgatttagagcttgacggggaaagccggcgaacgtggcgagaaaggaagggaagaa360

agcgaaaggagcgggcgctagggcgctggcaagtgtagcggtcacgctgcgcgtaaccac420

cacacccgccgcgcttaatgcgccgctacagggcgcgtcccattcgccattcaggctgcg480

caactgttgggaagggcgatcggtgcgggcctcttcgctattacgccagctggcgaaagg540

gggatgtgctgcaaggcgattaagttgggtaacgccagggttttcccagtcacgacgttg600

taaaacgacggccagtgagcgcgtagggataacagggtaatgcgcgcgtaatacgactca660

ctatagggcgaattgggtaccgggccccaacaggagggtaaatagagcagaactagtgaa720

cctcttctcctcctccagctcacgcaacgtggccaatctttaacccgcgctacaggtgcg780

cgcacgcgatgctgtttgatcagtttatcgtagcgtgtttcacacagcgataacagtctg840

aggtcgcaggaactcttcccataaacccaccgcagaacaaacactccggctttaacactc900

ctcgtgcttttgtgcatgaaccgctgacatgcacgctctccgacggccacgcgcgtctac960

cccattctgccagctcttcctgttgacagtcaatgagatgcatgaaaaatgtgtgaagga1020

atctgcagcagcggttcacaaacgcacgcacacactctcacacacacacacctttgcacg1080

cgatgctttacctgttgcttaatgagttacgagcgcgtgccagatcagcagagactcaaa1140

catgcaggcaattatcggatgtgttgcaacaaacaatttatttagttcacataattgcct1200

aaaccatcacactgatttatgacactttagcttagacagctttaaaagataaataaacat1260

ctcgagcatgctgtttaacttttcatgatttatatattctgattttattgggcttattta1320

tttctcacataattattatccgcattgagtttgctgtattaagagttgtgatgaaatgtg1380

ggattgatttctcagttaatgcacgtcgcttttgtctacaaactgttctgtaaatattaa1440

cattacattacataacatcaaaaaacactgataagcccagttctgccttaattataaagg1500

ctaattaagcgtctcatttattaatttatttcatttatttatgttttaaatatatatttg1560

tttacatattgcaaatttagttggaaatgcatgttaaaaatattagtgctgtataattat1620

tacccaatcaaaaatgttgcatttgtgttaaatattgacatatatatgatcacattacat1680

aaatattgacatatatatgattacaatacataaatattgacatatatatatataataatg1740

ttacataaatattgacatatatgattacgttacataaatattgacatatatataattact1800

ttacataaatattgatatatatataattacattacataaatatgagcatatatatataat1860

tacattacataaatattgacatatatatttaattacaatacataaatattgacatatata1920

taattacattacataaatattgacatatatgattacattacataaatattgacatatata1980

agtacgttacataaatattgagatatatatatataattacaatacataaatattggcata2040

tatataattacgttacataaatattgacatatatatatatatatatatatatatatatat2100

atatatatatatatatatatatataattacaatacataaatattgacatatatgattacg2160

ttacataaatattgacacatatataattacgttacataaatattgacatatatataatta2220

cgtttcataaatattgacatatatataataacgatacataaatattgacatatatatgat2280

tacaatacataaatattggcataattaaaatgacattacataaatattgacatatatatg2340

actatattacaaaaatattgacatatatatatatacacacacacacacatatatatatac2400

aattacgttgaatcaatattgacatatatatgaatgaattacaaaaatattgacatatat2460

ataataacgttacataaatattgacatatatttgattttattaaataaatattggcatat2520

atataattacattacataaatattgacatatatatgattacattacataaatattgacat2580

atatataataacgttacataaatattgacatatatttgattttattaaataaatattggc2640

atatatatgattacattacataaatattgacatatatatatatatatatatatatatata2700

tatatatatatatatatatatatttactttacataaatattgacatatttgacttagtcc2760

ctttaatcaggggtcgccactgcggaatgaaccgccaacttatccagcatagtttttacg2820

cagcagatgcccttccagctgcaacccaacactgggaaacacacataccctctcattcac2880

acgcacactcatacactacggccaatttagttcatcagttcccctaaagtgcatgtgttt2940

ggactgtggagaaaaccggagcacccggaggaaacccacgccatgcaaactccacacaga3000

aatgccagctgacccagctcgaaccagcgatcgtgctactcactgcactttataaatata3060

tatttttcattcataacttttgtatacattttacatagtcttttgtaccatgtatgtgtg3120

cgtgtgttacatacatcaatctccttcccacagtttagatatgtgtgaggtgagtgtgtg3180

taattactcagggagtttactcagtgcaatcgatcagcctgtaataaaatctcagccctt3240

ctcagcatcaaagcctcctgcgctcggtgacgtccgcggaggacagccaatcacggcgag3300

ctctgcgctataaaagatttaccgctggaatagtgcagcaccggtcgccaccatggtgag3360

caagggcgaggaggataacatggccatcatcaaggagttcatgcgcttcaaggtgcacat3420

ggagggctccgtgaacggccacgagttcgagatcgagggcgagggcgagggccgccccta3480

cgagggcacccagaccgccaagctgaaggtgaccaagggtggccccctgcccttcgcctg3540

ggacatcctgtcccctcagttcatgtacggctccaaggcctacgtgaagcaccccgccga3600

catccccgactacttgaagctgtccttccccgagggcttcaagtgggagcgcgtgatgaa3660

cttcgaggacggcggcgtggtgaccgtgacccaggactcctccctgcaggacggcgagtt3720

catctacaaggtgaagctgcgcggcaccaacttcccctccgacggccccgtaatgcagaa3780

gaagaccatgggctgggaggcctcctccgagcggatgtaccccgaggacggcgccctgaa3840

gggcgagatcaagcagaggctgaagctgaaggacggcggccactacgacgctgaggtcaa3900

gaccacctacaaggccaagaagcccgtgcagctgcccggcgcctacaacgtcaacatcaa3960

gttggacatcacctcccacaacgaggactacaccatcgtggaacagtacgaacgcgccga4020

gggccgccactccaccggcggcatggacgagctgtacaagtccggactcagatctcgagc4080

tcaagcttcgaattctgcagtcgacggtaccgcgggcccgggatccactagttctagagc4140

ggcctatgatgaactctcgagtagatccagacatgataagatacattgatgagtttggac4200

aaaccacaactagaatgcagtgaaaaaaatgctttatttgtgaaatttgtgatgctattg4260

ctttatttgtaaccattataagctgcaataaacaagttaacaacaacaattgcattcatt4320

ttatgtttcaggttcagggggaggtgtgggaggttttttaattcgcggccgggggatcgg4380

tggagctccagcttttgttccctttagtgagggttaattgcgcgcattaccctgttatcc4440

ctacgcgcttggcgtaatcatggtcatagctgtttcctgtgtgaaattgttatccgctca4500

caattccacacaacatacgagccggaagcataaagtgtaaagcctggggtgcctaatgag4560

tgagctaactcacattaattgcgttgcgctcactgcccgctttccagtcgggaaacctgt4620

cgtgccagctgcattaatgaatcggccaacgcgcggggagaggcggtttgcgtattgggc4680

gctcttccgcttcctcgctcactgactcgctgcgctcggtcgttcggctgcggcgagcgg4740

tatcagctcactcaaaggcggtaatacggttatccacagaatcaggggataacgcaggaa4800

agaacatgtgagcaaaaggccagcaaaaggccaggaaccgtaaaaaggccgcgttgctgg4860

cgtttttccataggctccgcccccctgacgagcatcacaaaaatcgacgctcaagtcaga4920

ggtggcgaaacccgacaggactataaagataccaggcgtttccccctggaagctccctcg4980

tgcgctctcctgttccgaccctgccgcttaccggatacctgtccgcctttctcccttcgg5040

gaagcgtggcgctttctcatagctcacgctgtaggtatctcagttcggtgtaggtcgttc5100

gctccaagctgggctgtgtgcacgaaccccccgttcagcccgaccgctgcgccttatccg5160

gtaactatcgtcttgagtccaacccggtaagacacgacttatcgccactggcagcagcca5220

ctggtaacaggattagcagagcgaggtatgtaggcggtgctacagagttcttgaagtggt5280

ggcctaactacggctacactagaaggacagtatttggtatctgcgctctgctgaagccag5340

ttaccttcggaaaaagagttggtagctcttgatccggcaaacaaaccaccgctggtagcg5400

gtggtttttttgtttgcaagcagcagattacgcgcagaaaaaaaggatctcaagaagatc5460

ctttgatcttttctacggggtctgacgctcagtggaacgaaaactcacgttaagggattt5520

tggtcatgagattatcaaaaaggatcttcacctagatccttttaaattaaaaatgaagtt5580

ttaaatcaatctaaagtatatatgagtaaacttggtctgacagttaccaatgcttaatca5640

gtgaggcacctatctcagcgatctgtctatttcgttcatccatagttgcctgactccccg5700

tcgtgtagataactacgatacgggagggcttaccatctggccccagtgctgcaatgatac5760

cgcgagacccacgctcaccggctccagatttatcagcaataaaccagccagccggaaggg5820

ccgagcgcagaagtggtcctgcaactttatccgcctccatccagtctattaattgttgcc5880

gggaagctagagtaagtagttcgccagttaatagtttgcgcaacgttgttgccattgcta5940

caggcatcgtggtgtcacgctcgtcgtttggtatggcttcattcagctccggttcccaac6000

gatcaaggcgagttacatgatcccccatgttgtgcaaaaaagcggttagctccttcggtc6060

ctccgatcgttgtcagaagtaagttggccgcagtgttatcactcatggttatggcagcac6120

tgcataattctcttactgtcatgccatccgtaagatgcttttctgtgactggtgagtact6180

caaccaagtcattctgagaatagtgtatgcggcgaccgagttgctcttgcccggcgtcaa6240

tacgggataataccgcgccacatagcagaactttaaaagtgctcatcattggaaaacgtt6300

cttcggggcgaaaactctcaaggatcttaccgctgttgagatccagttcgatgtaaccca6360

ctcgtgcacccaactgatcttcagcatcttttactttcaccagcgtttctgggtgagcaa6420

aaacaggaaggcaaaatgccgcaaaaaagggaataagggcgacacggaaatgttgaatac6480

tcatactcttcctttttcaatattattgaagcatttatcagggttattgtctcatgagcg6540

gatacatatttgaatgtatttagaaaaataaacaaataggggttccgcgcacatttcccc6600

gaaaagtgccac6612

<210>10

<211>3958

<212>dna

<213>artificial

<220>

<223>pi-scei-mcherry骨架序列

<400>10

ccggtcgccaccatggtgagcaagggcgaggaggataacatggccatcatcaaggagttc60

atgcgcttcaaggtgcacatggagggctccgtgaacggccacgagttcgagatcgagggc120

gagggcgagggccgcccctacgagggcacccagaccgccaagctgaaggtgaccaagggt180

ggccccctgcccttcgcctgggacatcctgtcccctcagttcatgtacggctccaaggcc240

tacgtgaagcaccccgccgacatccccgactacttgaagctgtccttccccgagggcttc300

aagtgggagcgcgtgatgaacttcgaggacggcggcgtggtgaccgtgacccaggactcc360

tccctgcaggacggcgagttcatctacaaggtgaagctgcgcggcaccaacttcccctcc420

gacggccccgtaatgcagaagaagaccatgggctgggaggcctcctccgagcggatgtac480

cccgaggacggcgccctgaagggcgagatcaagcagaggctgaagctgaaggacggcggc540

cactacgacgctgaggtcaagaccacctacaaggccaagaagcccgtgcagctgcccggc600

gcctacaacgtcaacatcaagttggacatcacctcccacaacgaggactacaccatcgtg660

gaacagtacgaacgcgccgagggccgccactccaccggcggcatggacgagctgtacaag720

tccggactcagatctcgagctcaagcttcgaattctgcagtcgacggtaccgcgggcccg780

ggatccactagttctagagcggcctatgatgaactctcgagtagatccagacatgataag840

atacattgatgagtttggacaaaccacaactagaatgcagtgaaaaaaatgctttatttg900

tgaaatttgtgatgctattgctttatttgtaaccattataagctgcaataaacaagttaa960

caacaacaattgcattcattttatgtttcaggttcagggggaggtgtgggaggtttttta1020

attcgcggccgggggatcggtggagctccagcttttgttccctttagtgagggttaattg1080

cgcgcattaccctgttatccctacgcgcttggcgtaatcatggtcatagctgtttcctgt1140

gtgaaattgttatccgctcacaattccacacaacatacgagccggaagcataaagtgtaa1200

agcctggggtgcctaatgagtgagctaactcacattaattgcgttgcgctcactgcccgc1260

tttccagtcgggaaacctgtcgtgccagctgcattaatgaatcggccaacgcgcggggag1320

aggcggtttgcgtattgggcgctcttccgcttcctcgctcactgactcgctgcgctcggt1380

cgttcggctgcggcgagcggtatcagctcactcaaaggcggtaatacggttatccacaga1440

atcaggggataacgcaggaaagaacatgtgagcaaaaggccagcaaaaggccaggaaccg1500

taaaaaggccgcgttgctggcgtttttccataggctccgcccccctgacgagcatcacaa1560

aaatcgacgctcaagtcagaggtggcgaaacccgacaggactataaagataccaggcgtt1620

tccccctggaagctccctcgtgcgctctcctgttccgaccctgccgcttaccggatacct1680

gtccgcctttctcccttcgggaagcgtggcgctttctcatagctcacgctgtaggtatct1740

cagttcggtgtaggtcgttcgctccaagctgggctgtgtgcacgaaccccccgttcagcc1800

cgaccgctgcgccttatccggtaactatcgtcttgagtccaacccggtaagacacgactt1860

atcgccactggcagcagccactggtaacaggattagcagagcgaggtatgtaggcggtgc1920

tacagagttcttgaagtggtggcctaactacggctacactagaaggacagtatttggtat1980

ctgcgctctgctgaagccagttaccttcggaaaaagagttggtagctcttgatccggcaa2040

acaaaccaccgctggtagcggtggtttttttgtttgcaagcagcagattacgcgcagaaa2100

aaaaggatctcaagaagatcctttgatcttttctacggggtctgacgctcagtggaacga2160

aaactcacgttaagggattttggtcatgagattatcaaaaaggatcttcacctagatcct2220

tttaaattaaaaatgaagttttaaatcaatctaaagtatatatgagtaaacttggtctga2280

cagttaccaatgcttaatcagtgaggcacctatctcagcgatctgtctatttcgttcatc2340

catagttgcctgactccccgtcgtgtagataactacgatacgggagggcttaccatctgg2400

ccccagtgctgcaatgataccgcgagacccacgctcaccggctccagatttatcagcaat2460

aaaccagccagccggaagggccgagcgcagaagtggtcctgcaactttatccgcctccat2520

ccagtctattaattgttgccgggaagctagagtaagtagttcgccagttaatagtttgcg2580

caacgttgttgccattgctacaggcatcgtggtgtcacgctcgtcgtttggtatggcttc2640

attcagctccggttcccaacgatcaaggcgagttacatgatcccccatgttgtgcaaaaa2700

agcggttagctccttcggtcctccgatcgttgtcagaagtaagttggccgcagtgttatc2760

actcatggttatggcagcactgcataattctcttactgtcatgccatccgtaagatgctt2820

ttctgtgactggtgagtactcaaccaagtcattctgagaatagtgtatgcggcgaccgag2880

ttgctcttgcccggcgtcaatacgggataataccgcgccacatagcagaactttaaaagt2940

gctcatcattggaaaacgttcttcggggcgaaaactctcaaggatcttaccgctgttgag3000

atccagttcgatgtaacccactcgtgcacccaactgatcttcagcatcttttactttcac3060

cagcgtttctgggtgagcaaaaacaggaaggcaaaatgccgcaaaaaagggaataagggc3120

gacacggaaatgttgaatactcatactcttcctttttcaatattattgaagcatttatca3180

gggttattgtctcatgagcggatacatatttgaatgtatttagaaaaataaacaaatagg3240

ggttccgcgcacatttccccgaaaagtgccacctaaattgtaagcgttaatattttgtta3300

aaattcgcgttaaatttttgttaaatcagctcattttttaaccaataggccgaaatcggc3360

aaaatcccttataaatcaaaagaatagaccgagatagggttgagtgttgttccagtttgg3420

aacaagagtccactattaaagaacgtggactccaacgtcaaagggcgaaaaaccgtctat3480

cagggcgatggcccactacgtgaaccatcaccctaatcaagttttttggggtcgaggtgc3540

cgtaaagcactaaatcggaaccctaaagggagcccccgatttagagcttgacggggaaag3600

ccggcgaacgtggcgagaaaggaagggaagaaagcgaaaggagcgggcgctagggcgctg3660

gcaagtgtagcggtcacgctgcgcgtaaccaccacacccgccgcgcttaatgcgccgcta3720

cagggcgcgtcccattcgccattcaggctgcgcaactgttgggaagggcgatcggtgcgg3780

gcctcttcgctattacgccagctggcgaaagggggatgtgctgcaaggcgattaagttgg3840

gtaacgccagggttttcccagtcacgacgttgtaaaacgacggccagtgagcgcgtaggg3900

ataacagggtaatgcgcgcgtaatacgactcactatagggcgaattgggtaccgggcc3958

<210>11

<211>602

<212>dna

<213>artificial

<220>

<223>質粒測序結果

<400>11

atgtgtgaggtgagtgtgtgtaattactcagggagtttactcagtgcaatcgatcagcct60

gtaataaaatctcagcccttctcagcatcaaagcctcctgcgctcggtgacgtccgcgga120

ggacagccaatcacggcgagctctgcgctataaaagatttaccgctggaatagtgcagca180

ccggtcgccaccatggtgagcaagggcgaggaggataacatggccatcatcaaggagttc240

atgcgcttcaaggtgcacatggagggctccgtgaacggccacgagttcgagatcgagggc300

gagggcgagggccgcccctacgagggcacccagaccgccaagctgaaggtgaccaagggt360

ggccccctgcccttcgcctgggacatcctgtcccctcagttcatgtacggctccaaggcc420

tacgtgaagcaccccgccgacatccccgactacttgaagctgtccttccccgagggcttc480

aagtgggagcgcgtgatgaacttcgaggacggcggcgtggtgaccgtgacccaggactcc540

tccctgcaggacggcgagttcatctacaaggtgaagctgcgcggcaccaacttcccctcc600

ga602

<210>12

<211>4579

<212>dna

<213>artificial

<220>

<223>pi-scei-cmv-mcherry

<400>12