一種轉Cry1Ab抗蟲基因水稻品系mfb-MH86的檢測方法
【專利摘要】本發明提供了一種轉Cry1Ab抗蟲基因水稻品系mfb-MH86的檢測方法。所述方法是轉化體mfb-MH86中外源基因Cry1Ab表達框在水稻染色體上插入片段及其5’端旁側特異序列SEQ?ID?NO:1和3’端旁側特異序列SEQ?ID?NO:2，以及基于這2段序列建立的特異性PCR擴增鑒定技術。PCR所用LB端正向引物依據SEQ?ID?NO:1中1-390位序列設計，反向引物依據SEQ?ID?NO:1中391-2000位序列設計；PCR所用RB端正向引物依據SEQ?ID?NO:2中1-1300位序列設計，反向引物依據SEQ?ID?NO:2中1301-2000位序列設計。該PCR方法可作為特異性鑒定轉基因水稻品系mfb-MH86及該品系的衍生系的有效手段。
【專利說明】—種轉CryIAb抗蟲基因水稻品系mfb_MH86的檢測方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于生物【技術領域】，特別是涉及一種轉CrylAb抗蟲基因水稻品系mfb-MH86的檢測方法及其所依賴的轉化體特異序列。
【背景技術】
[0002]水稻是我國乃至世界最主要的糧食作物之一。水稻也是蟲害發生較為嚴重的作物之一。我國水稻田間害蟲有600多種上，其中分布廣泛且為害較為嚴重的是二化螟、三化螟、稻縱卷葉螟等鱗翅目害蟲。據統計，每年我國由蟲害造成的損失占水稻總產量的5%以上，高達一千萬噸，每年用于水稻害蟲防治的費用都在135億元人民幣以上。而在水稻品種及野生稻中沒有抗鱗翅目害蟲的種質資源可以利用。以轉基因技術為核心的品種設計技術則可以將遠緣物種的抗性基因導入水稻中，從而使現有品種獲得高抗蟲特性。目前已經有多個轉基因水稻品系獲準進入環境釋放和生產性試驗。對轉基因作物的有效監管是轉基因作物安全利用的前提和保障。轉基因作物外源序列插入片段旁側序列是轉基因植物品系的最重要的分子身份證。因此，外源插入片段的旁側序列是建立轉基因作物品系特異性檢測方法的重要技術資料。
[0003]mfb-MH86是福建省農業科學院生物技術研究所和中國科學院遺傳與發育生物學研究所共同研發的抗二化螟、三化螟、稻縱卷葉螟以及大螟的具有廣泛應用前景的轉基因水稻品系。利用插入位點旁側序列特異性地鑒定轉基因品種(品系)是目前鑒定轉基因作物最可靠最特異的檢測方法，是準確鑒別區分同一轉化體及其衍生品系的方法。
[0004]利用插入位點旁側序列鑒定轉基因品系，該方法已在鑒定克螟稻、Bt汕優63、科豐6號和科豐8號品系中建立。mfb-MH86是最新研發的抗蟲轉基因水稻品系，尚無任何相關轉基因水稻mfb-MH86外源基因插入片段的旁側序列文章報道和專利。

【發明內容】

[0005]本發明的目的在于提供一種轉CrylAb抗蟲基因水稻品系mfb_MH86的檢測方法，利用插入位點旁側序列特異性地鑒定轉基因品種(品系)，根據轉基因水稻品系mfb-MH86外源基因插入片段的旁側序列特征提供了該轉基因品系的特異性PCR檢測方法。
[0006]為實現上述目的，本發明采用如下技術方案:
所述方法是轉化體mfb-MH86中外源基因CrylAb表達框在水稻染色體上插入片段及其5’端旁側特異序列SEQ ID NO:1和3’端旁側特異序列SEQ ID NO: 2，以及基于這2段序列建立的特異性PCR擴增鑒定技術。
[0007]所述的5’端旁側特異序列為LB端旁側序列，其序列如SEQ ID N0:1所示；所述的3’端旁側特異序列為RB端旁側序列，其序列如SEQ ID NO: 2所示。
[0008]依據LB端旁側序列設計的一對特異性引物為:
正向引物為 B70-1F:5’ -ATTGAAAGATGGGTGAAGGG-3’，
反向引物為 Bb86-L3:5’ -TCTTCATCTGAGCAAACATAAAC-3’。[0009]所述的特異性引物:正向引物為依據SEQ ID NO:1中1_390位序列設計，反向引物依據SEQ ID NO:1中391-2000位序列設計。
[0010]依據RB端旁側序列設計的一對特異性引物為:
正向引物為 Bb86-R4:5’ - TGTCTAACTACATCGTCTCTGCC-3’，
反向引物為 B70-7R:5’ -AAGACGAAGTTAGAAGACCA-3’。
[0011]所述的特異性引物:正向引物為依據SEQ ID NO: 2中1-1300位序列設計，反向引物依據SEQ ID NO:2中1301-2000位序列設計。
[0012]一種轉基因水稻品系mfb_MH86外源基因插入片段的旁側序列，所述旁側序列為載體LB旁側序列及其插入水稻基因組中的一段序列，LB端旁側序列如SEQ ID NO:1所示，其中水稻基因組序列為l_390bp，載體LB序列為391-2000bp，該特異性序列為轉CrylAb基因水稻品系mfb-MH86所特有。
[0013]一種轉基因水稻品系mfb_MH86外源基因插入片段的旁側序列，所述旁側序列為載體RB旁側序列及其插入水稻基因組中的一段序列，RB端旁側序列如SEQ ID N0:2所示，其中水稻基因組序列為l_1300bp，載體RB序列為1301-2000bp，該特異性序列為轉CrylAb基因水稻品系mfb-MH86所特有。
[0014]PCR反應產物中含有SEQ ID NO:1序列或SEQ ID N0:2序列。[0015]依賴于外源基因插入片段旁側序列的轉CrylAb基因水稻品系mfb_MH86的PCR檢測方法，可依據LB旁側序列或者RB旁側序列檢測I個插入在水稻5號染色體上的位置。上述2對引物可單獨用于轉基因水稻mfb-MH86及其衍生品系的定性PCR檢測，也可組合同時用于轉基因水稻mfb-MH86及其衍生品系的定性PCR檢測。
[0016]轉基因水稻mfb_MH86所用載體見圖1,用于轉化目的基因CrylAb和選擇標記基因hpt分別位于不同的二個獨立T-DNA區域，其中一個T-DNA區域含有35S啟動子和選擇標記基因hpt ;另一個T-DNA區域含有核基質結合區MAR序列、Ubi啟動子和目的基因CrylAb。
[0017]本發明采用常規方法提取轉基因水稻mfb_MH86 DNA，利用Tail-PCR方法分離得到LB旁側序列2000bp，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，該序列包括水稻基因組序列，位于水稻第 5 號染色體(GeneBank ID: NC-008398.2)的 18342980-18343369 位，其核苷酸序列與SEQ ID NO:1中1-390位的核苷酸序列完全相同；該序列還包括轉化載體pCDMARUBb-Hyg部分序列，其核苷酸序列與SEQ ID NO:1中391-2000位的核苷酸序列完全相同。
[0018]本發明采用常規方法提取轉基因水稻mfb_MH86 DNA，利用Tail-PCR方法分離得到RB旁側序列2000bp，其核苷酸序列如SEQ ID NO: 2所示，該序列包括水稻基因組序列，位于水稻第 5 號染色體(GeneBank ID: NC-008398.2)的 18342980-18343369 位，其核苷酸序列與SEQ ID NO:2中1-1300位的核苷酸序列完全相同；該序列還包括轉化載體pCDMARUBb-Hyg部分序列，其核苷酸序列與SEQ ID NO: 2中1301-2000位的核苷酸序列完全相同。
[0019]本發明的有益效果主要體現在:本發明提供了轉基因水稻mfb_MH86外源基因插入位點的左右邊界旁側序列，以及基于這二段序列的轉化事件特異檢測方法，為轉基因mfb-MH86水稻及其衍生品系的鑒定提供了分子特征和特異的檢測手段。【專利附圖】

【附圖說明】
[0020]圖1:轉化載體pCDMARUBb-Hyg的T-DNA區域結構示意圖。
[0021]圖2: LB端旁側序列Tail-PCR電泳圖。1-3泳道:特異性引物Bb86_Ll、Bb86_L2、Bb86-L3與簡并引物AD6的擴增產物。M: λ -EcoT14 Marker。
[0022]圖3: RB端旁側序列Tail-PCR電泳圖。1-3泳道:特異性引物Bb86_Rl、Bb86_R2、Bb86-R3與簡并引物AD6的擴增產物。M: λ -EcoT14 Marker。
[0023]圖4: PCR方法檢測驗證圖。泳道1:mfb-MH86 DNA經一對特異性引物Bb86_L3與B70-1F可擴增出1045bp片段；泳道2:明恢86用一對特異性引物Bb86_L3與B70-1F未擴增出特異條帶，M: λ -EcoT14 Marker。
[0024]圖5: PCR方法檢測驗證圖。泳道1:mfb-MH86 DNA經一對特異性引物Bb86_R3與B70-7R可擴增出741bp片段；泳道2:明恢86用一對特異性引物Bb86_R3和B70-7R未擴增出特異條帶.M: λ-EcoT14 Marker。
【具體實施方式】
[0025]實施例1.轉基因水稻mfb_MH86外源基因插入位點旁側序列克隆
一、實驗材料與儀器
1.植物材料:轉基因水稻mfb-MH86
2.試劑:
1)TaqDNA Ploymerase: 天根(TIANGEN)生化科技(北京)有限公司提供
2)PCR擴增引物:生工生物工程(Sangon)(上海)有限公司合成
3)上樣緩沖液:10X Loading Buffer,寶生物工程(大連)有限公司提供
4)Agarose:西班牙瓊脂糖，BIOffEST公司提供
3.實驗儀器
1)高速/ 冷凍高速離心機:Eppenddorf Centrifuge 5415D、Eppenddorf Centrifuge5424、Eppenddorf Centrifuge 5804R
2)PCR儀:GeneAmp PCR System Perkin-Elmer 9600、GeneAmp PCR System2700>BIO-RAD Dyad Disciple Thermal Cycler PTC-0221、Eppendorf Mastercycler pro S
3)電泳儀系統:B10_RADPowerPac Basic 電源、BIO-RAD PowerPac Universal 電源、BIO-RAD sub-cell GT 水平電泳槽、BIO-RAD Wide Min1-sub cell 水平電泳槽
4)凝膠成像系統:AlphaInnotech FluorChem SP (突光/化學光/可見光凝膠成像系
統)
5)移液器:EppendorfResearch可調量程移液器
二、實驗方法
1.水稻基因組DNA提取
I)將2XCTAB溶液置于65°C水浴中預熱。
[0026]2)摘取新鮮的水稻葉片100_200mg，置于1.5mL EP管中，加入適量液氮，用洗凈晾干的尖頭玻璃棒研磨至粉末狀。
[0027]3)向EP管中加入600 μ L預熱的2 X CTAB溶液，混勻。
[0028]4)將EP管置于65°C水浴中溫育20分鐘，期間顛倒I次。[0029]5)從水浴中取出EP管，加入等量氯仿:異戊醇(24:1)，用力上下顛倒或渦旋混勻，至下層液相呈現深綠色。[0030]6)于室溫條件靜置10分鐘，lOOOOrpm，離心10分鐘。
[0031]7)將上層水相上清液轉移至新的1.5mL EP管中，加入2倍體積預凍的無水乙醇，輕輕顛倒混勻后置于一 20°C冰箱沉淀30-60分鐘。
[0032]8)沉淀結束后，1000Orpm,離心10分鐘，小心棄上清。
[0033]9)加入ImL 75%乙醇，渦旋洗滌沉淀。
[0034]10) 5，OOOrpm,離心3分鐘，收集DNA，小心棄液體，剩余少量液體短暫離心,然后用槍頭吸出。
[0035]11)室溫自然干燥，或置于通風處吹干。
[0036]12)加入ddH20或TE(pH8.0)，充分溶解，置4°C備用。
[0037]2.旁側序列的擴增
米用熱不對稱交錯 PCR (Thermal Asymmetric Interlaced PCR, Tail-PCR)擴增與已知DNA序列鄰接的未知旁側序列。根據已知載體pCDMARUBb-Hyg序列，在左邊界設計了 3條嵌套的特異引物分別命名為:Bb86-Ll、Bb86-L2和Bb86_L3 ;在右邊界設計了 3條嵌套的特異引物分別命名為:Bb86-Rl、Bb86-R2、Bb86-R3.詳見表1，將左邊界嵌套的特異引物依次與簡并引物AD6組合進行三輪擴增；右邊界嵌套的特異引物依次與簡并引物AD6組合進行三輪擴增。
[0038]左邊界TaiL-PCR包括3個反應:第一輪反應:25μ I反應體系，包含IXPCRbuffer, 100 μ mol/L dNTPs，0.5 μ mol/L 引物 I Bb86_Ll, 50 μ mol/L AD6，1.0 單位 Taq DNA聚合酶,50-1OOng DNA模板。第二輪(25 μ I反應體系)和第三輪(100 μ I反應體系)反應混合物分別含有0.5 μ mol/L引物2 Bb86_L2、引物3 Bb86_L3和其前一輪產物稀釋物(50Χ)2μ 1、8μ 1，其它反應物同第一輪，具體反應程序見表2。
[0039]右邊界TaiL-PCR反應與左邊界TaiL-PCR反應體系和程序相同，只是三輪擴增的特異性引物分別改為Bb86-Rl、Bb86-R2和Bb86_R3。
[0040]3.PCR產物電泳和回收
LB邊界嵌套的特異引物依次與簡并引物AD6組合進行三輪擴增，擴增產物電泳圖見圖2 ;RB邊界嵌套的特異引物依次與簡并引物AD6組合進行三輪擴增，擴增產物電泳圖見圖3。用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒從瓊脂糖凝膠中回收第三次擴增產物，用于序列測定。
[0041]表1.用于旁側序列分離和鑒定mfb_MH86品系的特異性擴增引物及簡并引物
【權利要求】
1.一種轉CrylAb抗蟲基因水稻品系mfb_MH86的檢測方法，其特征在于:所述方法為轉化體mfb-MH86中外源基因CrylAb表達框在水稻染色體上插入片段及其5’端旁側特異序列和3’端旁側特異序列。
2.一種如權利要求1所述的一種轉CrylAb抗蟲基因水稻品系mfb_MH86的檢測方法，其特征在于:所述的5’端旁側特異序列為LB端旁側序列，其序列如SEQ ID NO:1所示；所述的3’端旁側特異序列為RB端旁側序列，其序列如SEQ ID NO:2所示。
3.一種如權利要求2所述一種轉CrylAb抗蟲基因水稻品系mfb_MH86的檢測方法，其特征在于:依據LB端旁側序列設計的一對特異性引物為:
正向引物為 B70-1F:5’ -ATTGAAAGATGGGTGAAGGG-3’，
反向引物為 Bb86-L3:5 ’ -TCTTCATCTGAGCAAACATAAAC-3，。
4.根據權利要求3所述一種轉CrylAb抗蟲基因水稻品系mfb-MH86的檢測方法，其特征在于:所述的特異性引物:正向引物為依據SEQ ID NO:1中1-390位序列設計，反向引物依據SEQ ID NO:1中391-2000位序列設計。
5.一種如權利要求2所述一種轉CrylAb抗蟲基因水稻品系mfb_MH86的檢測方法，其特征在于:依據RB端旁側序列設計的一對特異性引物為: 正向引物為 Bb86-R4:5’ - TGTCTAACTACATCGTCTCTGCC-3’， 反向引物為 B70-7R:5’ -AAGACGAAGTTAGAAGACCA-3’。
6.根據權利要求5所述一種轉CrylAb抗蟲基因水稻品系mfb_MH86的檢測方法，其特征在于:所述的特異性引物:正向引物為依據SEQ ID NO: 2中1-1300位序列設計，反向引物依據SEQ ID NO:2中1301-2000位序列設計。
【文檔編號】C12Q1/68GK103667475SQ201310648656
【公開日】2014年3月26日 申請日期:2013年12月6日 優先權日:2013年12月6日
【發明者】蘇軍, 顏靜宛, 王 鋒, 胡太蛟, 陳在杰, 林智敏, 李剛 申請人:福建省農業科學院生物技術研究所