專利名稱：鑒定優質抗蟲雜交棉中棉所70品種真實性和／或品種純度的ssr分子標記方法
技術領域：
本發明涉及一種鑒定優質抗蟲雜交棉“中棉所70”種子真實性和/或品種純度的SSR標記方法，利用這些特異引物對優質棉花雜交種F1品種“中棉所70”的種子進行真偽鑒別和/或品種純度的鑒定，屬于生物技術應用領域。
背景技術：
棉花是我國重要的經濟作物，在我國國民經濟與社會發展中具有重要地位。近年來，抗蟲雜交棉的成功育成與推廣，推動了我國雜交棉生產的快速發展，并成為世界上雜交棉大面積種植的兩個國家之一(邱新平.棉花雜種優勢的研究與利用進展[J].中國棉花， 2000，27 (10):4-7 )。2006年，我國雜交棉種植面積占全國棉田總面積的33. 2%，長江流域棉區基本實現雜交種化,黃淮海棉區和西北內陸棉區的種植面積逐年擴大。雜交棉生產實踐證明，高質量的種子是雜交棉優勢得以發揮的基礎。種子純度是衡量雜交棉種子質量的主要指標，低純度種子將導致棉花產量和品質的顯著下降。由于在棉花雜交制種過程中，人工去雄不徹底或漏去雄，常會出現假雜交種，導致種子遺傳純度下降，給生產造成巨大的經濟損失，同時，一些不法分子或種子經營單位為追求高額利潤，以劣充好，假冒偽劣種子進入市場并用于生產，造成棉花減產和品質降低，進而影響優良品種的市場銷售信譽及其產業化發展。因此，優良F1代雜交種種子真實性和/或品種純度的快速、準確(簡便、經濟)鑒定成為棉花生產中最為迫切解決的問題之一。目前我國棉種的真實性和/或品種純度鑒定仍主要依靠田間小區種植形態鑒定方法，但形態鑒定受環境影響較大，鑒定工作量大，成本高，耗時長，并受季節限制(匡猛等，分子標記技術在棉花品種鑒定上的研究進展.棉花學報，2009，21 (4): 330-334)。隨著棉花品種數量的日益增加和遺傳基礎的日益狹窄，使得完全根據形態性狀進行棉花品種的辨別越來越困難。近年來，分子生物學的發展使品種鑒定進入到基因水平，以DNA為基礎的 SSR( Simple Sequence Repeat,簡單序列重復)分子標記技術,屬于共顯性標記，在基因組中分布平均，具有檢測位點數量多、多態性高、遺傳穩定、不受環境條件影響等優點，已在棉花遺傳連鎖圖譜的構建、遺傳多樣性研究、標記和定位基因以及分子標記輔助選擇、品種親緣關系及分類等方面得到應用，并發揮著越來越重要的作用；在棉花的品種鑒定、種子純度檢測方面也進行了一定的研究(匡猛，楊偉華，許紅霞，王延琴，周大云，馮新愛， 王俊芳.分子標記技術在棉花品種鑒定上的研究進展.棉花學報2009，21 (4) :330-334 ； 武耀廷，張天真，郭旺珍，等.陸地棉品種SSR標記的多態性及用于雜交種純度檢測的研究[J].棉花學報，2001，13 (3) :131-133;殷劍美，陳旭升，狄佳春，等.雜交棉蘇雜 118的SSR指紋圖譜構建[J].江蘇農業科學，2007(4) :29-31 ;劉勤紅，王芙蓉，張軍， 等.利用SSR標記鑒定魯棉研15號雜交種純度的研究[J].山東農業科學，2003 (2) :7-16 ; 朱美霞，李英芝，王建書，等.利用SSR方法鑒定棉花品種純度[J].安徽農業科學，2005，33(11) :2010-2016;秦利，李冰，范玲，等.新疆陸地棉SSR標記指紋圖譜構建和雜種純度鑒定研究雜種純度鑒定研究[J].新疆農業科學，2005，42 (6):399-401)， 研究結果表明，利用分子標記進行棉花品種純度鑒定是可行的。“中棉所70”是以雙價轉基因(Bt + CpTI)抗蟲棉新品系sGK中156為母本，陸地棉常規優質系901-001為父本配制成的F1代雜交種(袁有祿，石玉真，李俊文， 劉愛英，翟學軍，李悅有，桑文東.轉基因抗蟲優質雜交棉-中棉所70 (見中國棉花， 2009,36(2) : 17)。2007年獲農業部轉基因生物安全證書，2008年經第二屆國家農作物品種審定委員會第二次會議審定通過，是國內首批通過國家審定的優質抗蟲雜交棉。試驗示范結果表明，該品種具有優質、高產、穩產、抗蟲性強、適應性廣、耐枯黃萎病等特點，特別是在黃河流域及長江流域纖維品質均表現突出，HVICC纖維上半部平均長度32. 5mm,斷裂比強度33. 5cN/teX，馬克隆值4. 3，適紡60支以上的高支紗，是生產優質棉及種植業結構調整的理想品種。為保證該優良品種生產最大的經濟效益、產業化的快速發展，需要一種權威、準確、快速穩定的檢測方法對其商品種子的真偽及遺傳純度進行鑒定。

發明內容
本發明的目的是提出一種鑒定棉花雜交種中棉所70種子真實性和/或品種純度的SSR標記方法，以克服現有品種純度檢測工作存在的不足，本發明方法重復性好、多態性高、遺傳穩定、不受環境條件影響，而且檢測結果穩定可靠、快速準確、操作簡單方便、成本低廉，有利于大規模的快速檢測。本發明提供的技術方案是一種鑒定優質抗蟲雜交棉“中棉所70”種子真實性和/或品種純度的SSR標記方法，該方法包括以下步驟
(1)提取棉花雜交種“中棉所70”及其親本種子或幼苗葉片基因組DNA;
(2)以第(I)步提取的基因組DNA為模板，用SSR引物CGR5390、BNL1552、CGR5111和 CIR246中的一個或多個引物，進行PCR擴增，其中，4個SSR特征引物堿基序列為
CGR5390引物其正向序列如SEQ ID No. I所示，反向序列如SEQ ID No. 2所示；BNL1552 引物其正向序列如SEQ ID No.所示，反向序列如SEQ ID No.4所示，CGR5111引物其正向序列如SEQ ID No. 5所示，反向序列如SEQ ID No. 6所示;CIR246引物序列如SEQ ID No. 7 所示，反向序列如SEQ ID No. 8所示
(3)對擴增產物進行凝膠電泳；
(4)對電泳結果進行分析，如果同時具有父母雙親本特異條帶的種子或單株鑒定為真正的雜交種，缺少其中的任意一個條帶均被視為假雜種，其中，4個SSR引物產生的特異標記帶大小為
SSR引物CGR5390產生的母本特異標記CGR53902(I5，條帶大小為205bp，產生的父本特異標記CGR539019Q，條帶大小為190bp ；
SSR引物BNL1552產生的母本特異標記BNL1552175，條帶大小為175bp，產生的父本特異標記BNL155218Q，條帶大小為180bp ；
SSR引物CGR5111產生的母本特異標記CGR5111135，條帶大小為135bp，產生的父本特異標記CGR5111128，條帶大小為128bp ；
SSR引物CIR246產生的母本特異標記CIR246·，條帶大小為200bp，產生的父本特異標記CIR24619(I，條帶大小為190bp。
所述鑒定優質抗蟲雜交棉“中棉所70”種子真實性和/或品種純度的SSR標記方法，其中，第(4)步還計算種子遺傳純度，具體計算方法如下種子遺傳純度=檢測到的與標準中棉所70匕帶型相同的個體數/檢測總數X 100%。所述鑒定優質抗蟲雜交棉“中棉所70”種子真實性和/或品種純度的SSR標記方法，其中，第(2)步中，以第(I)步提取的基因組DNA為模板，用SSR引物CGR5390、 BNL1552、CGR5111和CIR246中的一個引物，進行PCR擴增，即可進行鑒定。所述鑒定優質抗蟲雜交棉“中棉所70”種子真實性和/或品種純度的SSR標記方法，其中，第(2)步中，PCR擴增反應體系為反應體系為10 μ 1，其中超純水6.40 μ 1， IOXBuffer I. O μ I, IOmM dNTPs O. 50 μ 1，10 μ M 正向引物 O. 50 μ 1，10 μ M 反向引物
O.50 μ 1，30ng/ μ I 模板 DNAL O μ I，5U/ μ ITaq DNA 聚合酶 O. 10 μ I ;反應程序為94°C預變性45s，I個循環；94°C變性30s，57°C退火45s，72。。延伸Imin, 29個循環；94°C變性60s， 57°C退火45s，72°C延伸2min，一個循環；4°C保存待用。本發明具有如下有益效果本發明通過對雜交種“中棉所70”及其親本基因組DNA 特征SSR引物進行篩選研究，發明出一種適用于鑒定棉花雜交種中棉所70種子真實性和/ 或品種純度的SSR標記方法，它具有重復性好、多態性高、遺傳穩定、不受環境條件影響等優點，而且檢測結果穩定可靠、快速準確、操作簡單方便、成本低廉，有利于大規模的快速檢測。本發明通過對雜交種“中棉所70”及其親本基因組DNA特征SSR引物進行篩選研究，從所用的大量引物中篩選出能夠在雜種一代中同時產生具有父、母本特異標記條帶，而且帶型清晰、重復性好、可靠性強的引物，作為優質抗蟲雜交棉“中棉所70”種子真實性和/或品種純度鑒定的特征引物。本發明4個特征引物SSR引物對均能鑒定出具有父母本特異互補條帶。CGR5390引物產生母本特異標記CGR53902(I5，父本特異標記CGR5390·； BNL1552引物產生母本特異標記BNL15 5 2 325，父本特異標記BNL1552345 ；CGR5111引物產生母本特異標記CGR5111135，父本特異標記CGR5111128 ；CIR246引物產生母本特異標記 CIR2462QQ，父本特異標記CIR24619Q(見圖I)。這4個SSR標記引物在多次重復中表現穩定， 可有效用于鑒別棉花雜交種種子的真偽和純度，并且可以相互驗證，有利于棉花商品種子高效準確的質量控制，加快了棉花商品種子的質量檢測流程。本發明提供了一種鑒定雜交棉“中棉所70”種子真實性和/或品種純度的方法，該方法的應用，具有快速準確、經濟簡便、穩定可靠、不受環境條件及發育時期的影響，且操作簡單、統計方便等優點，可以快速、 準確地檢測棉花雜交種種子的遺傳純度。


圖I為本發明雜交種“中棉所70”種子檢測特征引物的SSR-PCR電泳圖譜。其中，P1: “中棉所70”母本(sGK中156) ；F1: “中棉所70” F1雜交種；P2: “中棉所70”父本(優質系901-001) ;M:501bp分子量標準,箭頭指向親本間的特異帶。圖2所示為特征引物對CGR5390對中棉所70商品種子樣品的純度檢測結果。其中，M為分子量標準，P1: “中棉所70”母本；F1: “中棉所70” F1雜交種；P2: “中棉所70”父本，1-20號為中棉所70商品樣品種子，箭頭指向親本間的特異帶。
具體實施例方式下面通過基于PCR技術的SSR標記分析實施例進一步說明本發明。實施例I
方法提取種子DNA，采用SSR分子標記進行PCR擴增，將擴增產物進行凝膠電泳，統計結果并篩選特征性引物。I. 提取棉花基因組DNA。本實施例的實驗材料為優質抗蟲雜交棉“中棉所70”商品種子(湖南隆平高科亞華棉油種業有限公司提供)。(I))將單粒棉花種子去掉外邊的硬殼，充分粉碎后轉入2 mL的離心管中，加入 800 μ L SDS 提取液(組成成分1% SDS, O. OImoI/L EDTA, O. 7 mol/L NaCl, O. 05 mol/ L Tris, O. 5%山梨醇，1%PVP，1%β —巰基乙醇)，充分混勻后。(2)65°C水浴30min，間隔10 min左右輕搖一次。(3))加入等體積SOOyL酚氯仿異戊醇(25:24:1)，上下顛倒混勻至不分層， 10000 r/min離心10 min，取上清液轉移到另一 2mL的離心管種。(4)重復上述步驟(3) —次。(5)加入0.7倍體積異丙醇，緩慢顛倒幾次，室溫靜置30 min，絮狀DNA成團析出，用剪口 tip頭吸取DNA轉移到另外離心管里。(6)用70%乙醇洗滌2次，無水乙醇洗滌I次，倒掉乙醇，自然通風干燥DNA。(7)加入200 μ L TE (ΡΗ8. O)或ddH20充分溶解DNA，瓊脂糖凝膠檢測質量后，保存于4°C或-20°C備用。2.分子標記分析
PCR 反應體系為 10μ 1，其中超純水 6. 40μ l，10XBuffer I. 0μ I (含 Mg2+/20mM)， IOmM dNTPs O. 50 μ 1，10 μ M 正向引物 O. 50 μ 1，10 μ M 反向引物 O. 50 μ 1，30ng/μ I 模板 DNAI. O μ I，5U/ μ ITaq DNA 聚合酶 O. 10 μ I。PCR 反應程序為94°C預變性 45s ;94°C變性 30s, 57°C退火 45s, 72°C延伸 lmin, 29 個循環；94°C變性 60s, 57°C退火 45s, 72°C延伸 2min, PCR反應在TGRADIENT、TC-512及PTC-200上進行。電泳儀器采用DYY-6C型穩壓穩流電泳儀和DYC2-30型電泳槽，由北京六一儀器公司生產。擴增產物在8%的非變性聚丙烯凝膠中進行電泳，180V恒壓電泳40-50分鐘。電泳結束后，進行固定-銀染-顯色-終止，在可見燈箱下觀察拍照，記錄結果。3.篩選純度鑒定的特征引物
利用2015對SSR引物(來自布魯克海文國家實驗室(美國)開發的BNL引物379對，來自國際農業研究發展中心(法國)開發的CIR引物392對，孟山都公司開發的CGR引物1244 對)對中棉所70及其父、母本的DNA進行多態性篩選，進行PCR擴增，篩選出能夠在一代雜種中同時產生父、母本特異標記條帶，且帶型清晰、重復性好、可靠性強的共顯性SSR引物 4個CGR5390引物產生母本特異標記CGR53902(I5，父本特異標記CGR539019(I ；BNL1552引物產生母本特異標記BNL15 5 2 325，父本特異標記BNL1552345 ；CGR5111引物產生母本特異標記 CGR5111135，父本特異標記CGR5111128 ；CIR246弓I物產生母本特異標記CIR246·，父本特異標記CIR246·(見圖1)，作為優質抗蟲雜交棉中棉所70種子真實性和/或品種純度鑒定的特征引物。
這4個SSR引物堿基序列為
CGR5390F: GCGAGATCTTAGCCGGTTT,
CGR5390R: ATCCATTGCATTGAGCTTCC ；
BNL1552F: GTGCCCAGCAATATCGTTTT,
BNL1552R: CTCTCGCCTTGGATTGAAAG ；
CGR5111F: GGAATTCGTGAACTCCTCTGA,
CGR5IIIR: GTGAGGGTGTCCTTTGGAGA;
CIR246F: TTAGGGTTTAGTTGAATGG,
CIR246R: ATGAACACACGCACG;
SSR引物CGR5390產生的母本特異標記CGR53902(I5，條帶大小為205bp，產生的父本特異標記CGR539019Q，條帶大小為190bp ；
SSR引物BNL1552產生的母本特異標記BNL1552325，條帶大小為325bp，產生的父本特異標記BNL1552345，條帶大小為345bp ；
SSR引物CGR5111產生的母本特異標記CGR5111135，條帶大小為135bp，產生的父本特異標記CGR5111128，條帶大小為128bp ；
SSR引物CIR246產生的母本特異標記CIR246·，條帶大小為200bp，產生的父本特異標記CIR24619(I，條帶大小為190bp。實施例2
用實施例I篩選出來的4個特征引物進行種子遺傳純度鑒定。本實施例的實驗材料為優質抗蟲雜交棉“中棉所70”商品種子(湖南隆平高科亞華棉油種業有限公司提供)。一般提取100粒種子進行檢測，計算遺傳純度。I.提取棉花基因組DNA，提取方法同實施例I。2.用CGR5390、BNL1552、CGR5111和CIR24引物，以上述第I步提取的基因組DNA 為模板，進行PCR擴增。PCR擴增反應體系為10 μ 1，其中超純水6. 40 μ 1，IOXBuffer I. O μ I (含 Mg2+/20mM), IOmM dNTPs O. 50 μ 1，10μΜ 正向引物 O. 50 μ 1，10μΜ 反向引物 O. 50 μ l，30ng/ μ I 模板 DNAL O μ I，5U/ μ ITaq DNA 聚合酶 O. 10 μ I。PCR 反應程序為94°C預變性 45s ； 94°C變性 30s, 57°C退火 45s，72°C延伸 lmin, 29 個循環；94°C變性 60s, 57°C退火 45s，72°C 延伸 2min，PCR 反應在 TGRADIENT、TC-512 及 PTC-200 等 PCR 儀上進行。3.對擴增產物進行凝膠電泳。電泳儀器米用DYY-6C型穩壓穩流電泳儀和DYC2-30型電泳槽，由北京六一儀器公司生產。擴增產物在8%的非變性聚丙烯凝膠中進行電泳，180V恒壓電泳40-50分鐘。電泳結束后，進行固定-銀染-顯色-終止，在可見燈箱下觀察拍照，記錄結果。4.對電泳結果進行分析，只有同時具有父母雙親本特異條帶的種子或單株才為真正的雜交種，缺少其中的任意一個條帶均被視為假雜種，計算其種子遺傳純度。4個引物均能鑒定出具有父母本特異互補條帶，CGR5390引物產生母本特異標記CGR53902Q5及父本特異標記CGR539019Q ；BNL1552引物產生母本特異標記BNL15 5 2 325及父本特異標記BNL1552345 ；CGR5111引物產生母本特異標記CGR5111135及父本特異標記 CGR5111128 ；CIR246引物產生母本特異標記CIR246200及父本特異標記CIR246190 (見圖I)。
使用選自CGR5390、BNL1552、CGR5111和CIR246中的一個或多個特征引物對雜交種種子的標記基因型進行分析，統計代表各種基因型的數，即可計算出待測商品中棉所70 種子純度百分率及雜株率(種子遺傳純度=檢測到的與標準中棉所70匕帶型相同的個體數 /檢測總數X 100%，雜株率=I-種子遺傳純度)。多個特征引物同時使用，取平均值即為待測商品種純度。4個標記在多次重復中表現穩定，4個標記分析結果可以相互驗證。對電泳結果進行分析，參照中棉所70父本、母本及F1標準電泳圖譜(見圖1)，確定代表父本帶型、母本帶型、其他雜株帶型及F1帶型的各種基因型，
圖2所示為特征引物對CGR5390對中棉所70種子商品樣品種子的純度檢測的結果。 圖中M為分子量標準，P1: “中棉所70”母本；F1: “中棉所70” F1雜交種；P2: “中棉所70” 父本，1-20號為中棉所70商品種子。對照圖中所示的“中棉所70”母本、父本及其F1的標準電泳譜帶可知1-20號中棉所70商品種子中，19號為母本帶型，1-18號和20號是真實雜交種帶型，因此，這份中棉所70商品種子樣品的遺傳純度為95% (遺傳純度= 19/20X100%=95%)。
權利要求
1.一種鑒定優質抗蟲雜交棉“中棉所70”種子真實性和/或品種純度的SSR標記方法，其特征在于包括以下步驟(1)提取棉花雜交種“中棉所70”及其親本種子或幼苗葉片基因組DNA;(2)以第(I)步提取的基因組DNA為模板，用SSR引物CGR5390、BNL1552、CGR5111和 CIR246中的一個或多個引物，進行PCR擴增，其中，4個SSR特征引物堿基序列為CGR5390引物其正向序列如SEQ ID No. I所示，反向序列如SEQ ID No. 2所示；BNL1552 引物其正向序列如SEQ ID No.所示，反向序列如SEQ ID No.4所示，CGR5111引物其正向序列如SEQ ID No. 5所示，反向序列如SEQ ID No. 6所示；CIR246引物序列如SEQ ID No. 7 所示，反向序列如SEQ ID No. 8所示；(3)對擴增產物進行凝膠電泳；(4)對電泳結果進行分析，如果同時具有父母雙親本特異條帶的種子或單株鑒定為真正的雜交種，缺少其中的任意一個條帶均被視為假雜種，其中，4個SSR引物產生的特異標記帶大小為SSR引物CGR5390產生的母本特異標記CGR53902(I5，條帶大小為205bp，產生的父本特異標記CGR539019Q，條帶大小為190bp ；SSR引物BNL1552產生的母本特異標記BNL1552175，條帶大小為175bp，產生的父本特異標記BNL155218Q，條帶大小為180bp ；SSR引物CGR5111產生的母本特異標記CGR5111135，條帶大小為135bp，產生的父本特異標記CGR5111128，條帶大小為128bp ；SSR引物CIR246產生的母本特異標記CIR246·，條帶大小為200bp，產生的父本特異標記CIR24619(I，條帶大小為190bp。
2.根據權利要求I所述鑒定優質抗蟲雜交棉“中棉所70”種子真實性和/或品種純度的SSR標記方法，其特征在于，第(4)步還計算種子遺傳純度，具體計算方法如下種子遺傳純度=檢測到的與標準中棉所70匕帶型相同的個體數/檢測總數X 100%。
3.據權利要求I所述鑒定優質抗蟲雜交棉“中棉所70”種子真實性和/或品種純度的SSR標記方法，其特征在于第(2)步中，以第(I)步提取的基因組DNA為模板，用SSR引物 CGR5390、BNL1552、CGR5111 和 CIR246 中的一個引物，進行 PCR 擴增。
4.根據權利要求I所述鑒定優質抗蟲雜交棉“中棉所70”種子真實性和/或品種純度的SSR標記方法，其特征在于第(2)步中，PCR擴增反應體系為反應體系為10μ 1，其中超純水 6. 40 μ 1，IOXBuffer I. O μ I, IOmM dNTPs O. 50 μ 1，10 μ M 正向引物 O. 50 μ 1， ΙΟμΜ 反向引物 O. 50μ l,30ng/y I 模板 DNAl.Oy I ,5U/y ITaq DNA 聚合酶 0· 10 μ I ;反應程序為941預變性458，1個循環;94°C變性30s，57°C退火45s，72°C延伸lmin，29個循環； 94°C變性60s，57°C退火45s，72°C延伸2min，一個循環；4°C保存待用。
全文摘要
本發明公開了一種鑒定優質抗蟲雜交棉“中棉所70”種子真實性和／或品種純度的SSR標記方法，其包括以下步驟(1)提取棉花雜交種“中棉所70”及其親本種子或幼苗葉片基因組DNA；(2)以第(1)步提取的基因組DNA為模板，用SSR引物進行PCR擴增；(3)對擴增產物進行凝膠電泳；(4)對電泳結果進行分析，如果同時具有父母雙親本特異條帶的種子或單株鑒定為真正的雜交種，缺少其中的任意一個條帶均被視為假雜種。本發明方法重復性好、多態性高、遺傳穩定、不受環境條件影響，而且檢測結果穩定可靠、快速準確、操作簡單方便、成本低廉，有利于大規模的快速檢測。
文檔編號C12Q1/68GK102586426SQ20121000920
公開日2012年7月18日 申請日期2012年1月12日 優先權日2012年1月12日
發明者劉愛英, 商海紅, 張金鳳, 李俊文, 王濤, 石玉真, 葛瑞華, 袁友祿, 龔萬奎, 龔舉武 申請人:中國農業科學院棉花研究所