具有高生物膜掛膜效率的微生物制劑及其制備方法
【專利摘要】本發明公開了一種具有高生物膜掛膜效率的微生物制劑及其制備方法，包括將枯草芽孢桿菌、沼澤紅假單胞菌、硝化刺菌、反硝化短枝單胞菌分別與培養基混合后進行好氧或發酵得到菌劑，將上述的菌劑按比例混合得到所需的生物制劑；所述的微生物制劑中包括枯草芽孢桿菌菌劑5-30%、沼澤紅假單胞菌菌劑10-40%、硝化刺菌菌劑10-60%、反硝化短枝單胞菌菌劑10-40%。本發明所述的制備方法可規模化生產，效率高且成本低，多種菌劑可同時發酵制備，縮短時間。采用所述的制劑制得的膜細胞密度高、傳質性好、穩定、有效期長、可重復使用，所述的制劑還可提高生物膜生長速度，縮短生物膜的掛膜時間，提高生物膜中優勢微生物的數量。
【專利說明】具有高生物膜掛膜效率的微生物制劑及其制備方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種微生物制劑，尤其涉及一種具有高生物膜掛膜效率的微生物制劑及其制備方法。
【背景技術】
[0002]生物膜的使用方法是使廢水流過生長在固定支承物表面上的生物膜，利用生物氧化作用和各相間的物質交換，降解廢水中有機污染物的方法，是廢水需氧生物處理法的一種。用生物膜法處理廢水的構筑物有生物濾池、生物轉盤和生物接觸氧化池等。生物膜是由高度密集的好氧菌、厭氧菌、兼性菌、真菌、原生動物以及藻類等組成的生態系統，其附著的固體介質稱為濾料或載體。
[0003]生物膜自濾料向外可分為厭氣層、好氣層、附著水層、運動水層。生物膜法的作用原理是，生物膜首先吸附附著水層有機物，由好氣層的好氣菌將其分解，再進入厭氣層進行厭氣分解，流動水層則將老化的生物膜沖掉以生長新的生物膜，如此往復以達到凈化污水的目的。
[0004]專利CN1928081B公開了一種人造生物膜及制備方法。采用有益微生物菌株發酵后濃縮。以聚乙烯醇、海藻酸鈉、羧甲基纖維素鈉等成膜原材料溶于水中制成膠液后，再將煤基活性炭粉末、硅藻土粉末、醋酸鈉與單株或多株微生物細胞混合后加入膠液中，然后放在噴霧裝置中加壓噴霧滴入粉末床上固定，形成人造生物膜。
[0005]生物膜的制備 生長還可以為掛膜，掛膜是指在污水中的微生物附著后，慢慢生長的過程。生長的時間一般需要15天-20天才能掛膜完成。生物膜上的微生物種類很多，有細菌、真菌、藻類、原生動物和后生動物，以及肉眼可見的微型動物。生物濾池中上層、中層、下層構成生物膜的微生物，種類也有區別，因此其掛膜的時間也不盡相同。掛膜的時間過長，不利于生物膜的廣泛應用和長期循環使用。
[0006]為了解決掛膜時間長、工序較多的問題，專利CN202829708U公開了一種懸浮填料微生物快速掛膜的方法。其特征是首先將污泥取回后曝氣48h，用曝氣后的污泥做接種菌，接種于裝有懸浮填料的序批式SBR反應器中，曝氣6h，靜置沉淀6h ;然后投加營養基質，曝氣10h，靜置沉淀2h作為一個運行周期，每天運行2個周期，期間進行排泥保持污泥懸浮固體濃度保持在2-20g/L范圍內的某一濃度值不變；運行7-10d掛膜完成。
[0007]上述的專利主要是在操作方法、流程上進行改進，雖然提高了掛膜的速度，但是卻使原有的掛膜的工序更為復雜，不利于推廣使用。

【發明內容】

[0008]本發明目的是一種有效提高生物膜掛膜效率的生物制劑及其制作方法。
[0009]為實現上述目的，本發明的第一個方面提供了一種具有高生物膜掛膜效率的生物制劑的制備方法，具體步驟包括:
[0010]步驟1，枯草芽孢桿菌、硝化刺菌、反硝化短枝單胞菌分別單獨進行好氧通氣發酵培養得菌劑，沼澤紅假單胞菌進行厭氧光照發酵培養得菌劑；
[0011]步驟2，將步驟1得到的各菌劑混合，得所需的生物制劑，其中，各菌劑混合的重量比例為枯草芽孢桿菌菌劑5-30%、沼澤紅假單胞菌菌劑10-40%、硝化刺菌菌劑10-60%、反硝化短枝單胞菌菌劑10-40%。
[0012]上述的步驟1中好氧發酵前枯草芽孢桿菌與培養基的混合重量比例優選為1-10:90-99，更優選為 1-3:97-99。
[0013]上述的步驟1中好氧通氣發酵的溫度優選為30_39°C，更優選為35_38°C，最優選為37°C，發酵時間優選為1-5天，更優選為1-3天，最優選為2天。
[0014]上述的步驟1中所述的枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)優選為保藏編號為N0.ACCC10619 的菌種。
[0015]上述的步驟1中所述的培養基為豆柏粉、蛋白胨、玉米粉、蔗糖、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉、硫酸銨、尿素或無菌水中的至少兩種混合物。
[0016]上述的步驟1中所述枯草芽孢桿菌好氧通氣發酵培養過程中的培養基，按照重量百分配比，包括:豆柏粉2.0-3.5%、蛋白胨0-1.0%、玉米粉3-4%、葡萄糖0_4%、磷酸氫二鈉0-1%、磷酸二氫鉀0-1%、硫酸銨0-2%、尿素0-1%、水82.5-95%。
[0017]上述的步驟1中所述的厭氧光照發酵前沼澤紅假單胞菌與培養基混合重量比例優選為1-15:85-99，更優選為2-13:90_99，更優選為5-10:90_95。
[0018]上述的步驟1中厭氧光照發酵的溫度優選為30_38°C，更優選為30_35°C，更優選為32°C，厭氧光照發酵的時間優選為2-10天，更優選為3-8天，最優選為5天。
[0019]上述的步驟1中所述的沼澤紅假單胞菌(Rhodopseudomonas palustris)優選為保藏編號為N0.ACCC10649的菌種。
[0020]上述的步驟1中所述的培養基為酵母粉、乙酸鈉、硫酸銨、磷酸二氫鉀、硫酸鎂、氯化鈉或無菌水中的至少兩種混合物。
[0021]上述的步驟1中所述的沼澤紅假單胞菌厭氧光照發酵培養過程中的培養基，按照重量百分配比，包括:酵母粉1-2%、乙酸鈉1-5%、硫酸銨1-3%、磷酸二氫鉀0-1%、硫酸鎂0-1%、氯化鈉 0.5-1%、水 87-99.2%。
[0022]上述的步驟1中硝化刺菌和培養基的混合重量比例優選為1-15:85-99,更優選為3-12:90-99，更優選為 5-10:90_95。
[0023]上述的步驟1中所述的硝化刺菌進行發酵的溫度優選為25_35°C，更優選為25-300C，最優選為28°C，發酵的時間優選為2-7天，更優選為2_5天，最優選為3天。
[0024]上述的步驟1中所述的硝化刺菌(Nitrospina sp)優選為保藏編號為N0.MCCC1A00556 的菌種。
[0025]上述的步驟1中所述的培養基為碳酸氫鈉、亞硝酸鈉、碳酸鈉、磷酸二氫鉀、硫酸鎂、氯化鈉、無菌水的至少兩種混合物。
[0026]上述的步驟1中所述的硝化刺菌厭氧光照發酵培養過程中的培養基，按照重量百分配比，包括:碳酸氫鈉0.1-0.5%、亞硝酸鈉0.1-0.5%、碳酸鈉0.1-0.5%、磷酸二氫鉀0-1%、硫酸鎂 0-1%、氯化鈉 0.5-1%、水 95.5-96.5%。
[0027]上述的步驟1中反硝化短枝單胞菌與培養基的混合重量比例優選為1-8:92-99,更優選為1-5:95-99，更優選為1-2:98_99。[0028]上述的步驟I中所述的發酵的溫度優選為25_35°C，更優選為25_30°C，最優選為28°C，所述的發酵的時間優選為1-8天，更優選為1-5天，更優選為2-4天，最優選為3天。
[0029]上述的步驟I中所述的反硝化短枝單胞菌(Brachymonas denitrificans)優選為保藏編號為N0.CGMCC1.7100的菌種。
[0030]上述的步驟I中所述的培養基為醋酸鈉、硝酸鉀、磷酸二氫鉀、氯化鎂、氯化鈣或無菌水中的至少兩種混合物。
[0031]上述的步驟I中所述的反硝化短枝單胞菌好氧通氣發酵培養過程中的培養基按照重量百分配比，包括:醋酸鈉0.01-0.05%、硝酸鉀0.01-0.05%、磷酸二氫鉀
0.001-0.002%、氯化鎂 0.001-0.002%、氯化鈣 0.001-0.002%、水 99.894-99.97%。
[0032]本發明的第二方面是提供一種采用上述的方法制備得到的微生物制劑，包括微生物組分，以微生物組分總量為基準，包括以下重量百分比的菌種:
[0033]枯草芽孢桿菌菌劑優選為5-30%，更優選為10-25%，更優選為10_20% ；
[0034]沼澤紅假單胞菌菌劑優選為10-40%，更優選為10-30%，更優選為20_30% ；
[0035]硝化刺菌菌劑優選為10-60%，更優選為20-50%，更優選為30-40% ；
[0036]反硝化短枝單胞菌菌劑10-40%，更優選為20-40%，更優選為20_30%。
[0037]本發明所述的具有高生物膜掛膜效率的微生物制劑的制備方法可以實現規模化生產，過程簡單、效率高且成本低，多種菌劑的發酵制備可同時進行，從而大大縮短微生物制劑的制備時間，提聞生廣的效率。
`[0038]采用本發明所述的微生物制劑得到的膜中細胞密度高、傳質性好、穩定、有效期長、可重復使用，還具有可提高生物膜的生長速度，縮短生物膜的掛膜時間，提高生物膜中的必要的好氧無氧的優勢微生物的數量的優點。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0039]圖1為本發明實施例3中對照0%接種量好氧培養期間COD去除情況隨時間變化圖；
[0040]圖2為本發明實施例3中對照0.05%接種量好氧培養期間COD去除情況隨時間變化圖；
[0041]圖3為本發明實施例3中對照0.075%接種量好氧培養期間COD去除情況隨時間變化圖；
[0042]圖4為本發明實施例3中對照0.1%接種量好氧培養期間COD去除情況隨時間變化圖；
[0043]圖5為本發明實施例3中對照0%接種量厭氧培養期間COD去除情況隨時間變化圖；
[0044]圖6為本發明實施例3中對照0.05%接種量厭氧培養期間COD去除情況隨時間變化圖；
[0045]圖7為本發明實施例3中對照0.075%接種量厭氧培養期間COD去除情況隨時間變化圖。
具體實施例[0046]生物膜法因其具有產生污泥少，運行管理方便，處理費用低等優點，在污水處理，尤其是養殖廢水處理方面具有獨特的優勢。通過添加同屬或類似的微生物，對生物膜的生長效率會有一定的提高促進作用，同時也可以縮短其掛膜的時間。因此，利用合適的微生物菌劑可以有效的提高生物膜的生長速度，提高生物膜中的必要的好氧無氧的優勢微生物的數量，從而提高生物膜的質量和較少掛膜的時間。
[0047]下面結合附圖和具體實施例對本發明做進一步說明，但不作為本發明的限定。
[0048]實施例1
[0049]本實施例中所述的枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)為保藏編號為N0.ACCC10619 的菌種。
[0050]所述的沼澤紅假單胞菌(Rhodopseudomonas palustris)為保藏編號為N0.ACCC10649 的菌種。
[0051]所述的硝化刺菌(Nitrospina sp)為保藏編號為N0.MCCC1A00556的菌種。
[0052]所述的反硝化短枝單胞菌(Brachymonas denitrificans)為保藏編號為N0.CGMCC1.7100 的菌種。
[0053]制備可具有高生物膜掛膜效率的微生物制劑的方法，其具體步驟如下:
[0054]步驟1，枯草芽孢桿菌菌劑的制備。
[0055]在好氧發酵前由下述重量百分比的原料配制:枯草芽孢桿菌1，％、培養基99%，進行37°C好氧通氣發酵2天。發酵后發酵液備用。
`[0056]所述的步驟I中培養基的重量百分配比為:豆柏粉2.0%、蛋白胨1.0%、玉米粉
3.0%、磷酸氫二鈉0.75%、磷酸二氫鉀0.2%、水93.05%。
[0057]步驟2，沼澤紅假單胞菌菌劑的制備。
[0058]在厭氧光照發酵前由下述重量百分比的原料配制:沼澤紅假單胞菌5%、培養基95%，進行32°C厭氧光照發酵5天。發酵后發酵液備用。
[0059]所述的步驟2中培養基的重量百分配比為:酵母粉1.0%、乙酸鈉5.0%、硫酸銨
3.0%、氯化鈉 0.5%、水 90.5%ο
[0060]步驟3，硝化刺菌菌劑的制備。
[0061]在好氧發酵前由下述重量百分比的原料配制:硝化刺菌10%、培養基90%，進行28°C好氧通氣發酵3天。發酵后發酵液備用。
[0062]所述的步驟3中培養基的重量百分配比為:碳酸氫鈉0.5%、亞硝酸鈉0.1%、碳酸鈉
0.5%、硫酸鎂0.5%、氯化鈉0.5%、水97.9%ο
[0063]步驟4，反硝化短枝單胞菌菌劑的制備。
[0064]在好氧發酵前由下述重量百分比的原料配制:反硝化短枝單胞菌1%、培養基99%，進行28°C好氧通氣發酵3天。發酵后發酵液備用。
[0065]所述的步驟4中培養基的重量百分配比為:醋酸鈉0.05%、硝酸鉀0.05%、磷酸二氫鉀 0.002%、氯化鎂 0.001%、氯化鈣 0.001%、水 99.896%。
[0066]步驟5，生物制劑的制備。將枯草芽孢桿菌菌劑、沼澤紅假單胞菌菌劑、硝化刺菌菌劑和反硝化短枝單胞菌菌劑進行混合，其重量百分比為:枯草芽孢桿菌菌劑20%、沼澤紅假單胞菌菌劑30%、硝化刺菌菌劑30%、反硝化短枝單胞菌菌劑20%。
[0067]混合后得到所需的微生物制劑。[0068]實施例2
[0069]本實施例中所述的枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)為保藏編號為N0.ACCC10619 的菌種。
[0070]所述的沼澤紅假單胞菌(Rhodopseudomonas palustris)為保藏編號為N0.ACCC10649 的菌種。
[0071]所述的硝化刺菌(Nitrospina sp)為保藏編號為N0.MCCC1A00556的菌種。
[0072]所述的反硝化短枝單胞菌(Brachymonas denitrificans)為保藏編號為N0.CGMCC1.7100 的菌種。
[0073]制備具有高生物膜掛膜效率的微生物制劑的方法，其具體步驟如下:
[0074]步驟1，枯草芽孢桿菌菌劑的制備。
[0075]在好氧發酵前由下述重量百分比的原料配制:枯草芽孢桿菌3%、培養基97%，進行37°C好氧通氣發酵2天。發酵后發酵液備用。
[0076]所述的步驟I中培養基的重量百分配比為:豆柏粉3.0%、玉米粉4.0%、磷酸氫二鈉
0.75%、磷酸二氫鉀0.2% 、硫酸銨0.5%、水91.55%。
[0077]步驟2，沼澤紅假單胞菌菌劑的制備。
[0078]在厭氧光照發酵前由下述重量百分比的原料配制:沼澤紅假單胞菌10%、培養基90%，進行32°C厭氧光照發酵5天。發酵后發酵液備用。
[0079]所述的步驟2中培養基的重量百分配比為:酵母粉2.0%、乙酸鈉5.0%、磷酸二氫鉀
0.05%、硫酸鎂 0.05%、氯化鈉 0.5%、水 92.4%。
[0080]步驟3，硝化刺菌菌劑的制備。
[0081]在好氧發酵前由下述重量百分比的原料配制:硝化刺菌10%、培養基90%，進行28°C好氧通氣發酵3天。發酵后發酵液備用。
[0082]所述的步驟3中培養基的重量百分配比為:碳酸氫鈉0.5%、亞硝酸鈉0.5%、磷酸二氫鉀0.5%、硫酸鎂0.5%、氯化鈉0.5%、水97.5%。
[0083]步驟4，反硝化短枝單胞菌菌劑的制備。
[0084]在好氧發酵前由下述重量百分比的原料配制:反硝化短枝單胞菌2%、培養基98%，進行28°C好氧通氣發酵3天。發酵后發酵液備用。
[0085]所述的步驟4中培養基的重量百分配比為:醋酸鈉0.05%、硝酸鉀0.03%、磷酸二氫鉀 0.002%、氯化鈣 0.002%、水 99.916%。
[0086]步驟5，生物制劑的制備。
[0087]將枯草芽孢桿菌菌劑、沼澤紅假單胞菌菌劑、硝化刺菌菌劑和反硝化短枝單胞菌菌劑進行混合，其重量百分比為:枯草芽孢桿菌菌劑10%、沼澤紅假單胞菌菌劑30%、硝化刺菌菌劑30%、反硝化短枝單胞菌菌劑30%。
[0088]實施例3
[0089]本發明所述的微生物制劑影響厭氧、好氧環境下的生物膜掛膜效率的實驗。
[0090]實驗目的:將復合菌接種到厭氧好氧組合的反應器中，并加入經過沉降或混凝預處理養豬場養殖廢水，通過接種復合菌種，進行掛膜試驗。根據添加前后的不同進行試驗，考察其對于縮短掛膜時間作用及提高去除污染物的效果。
[0091]實驗污水:本實驗所用的畜禽養殖廢水，其主要性狀為水質渾濁并含有一定的雜質，顏色呈黑棕色并帶有一定的臭味。本實驗測試污水主要水質指標COD，其范圍在3000mg/L 左右。
[0092]實驗裝置:本實驗所用的實驗裝置是用有機玻璃制成的長方體，其規格為255mmX 65mmX 225mm,反應器內包括三個獨立的格室，每個格室都是一個小的反應器，在每個格室中裝有填料，用于培養微生物。在反應器內裝有廢水，對微生物進行培養馴化，注入模擬養豬場廢水，利用微生物對廢水中的COD進行去除。各個格室根據試驗要求(好氧或厭氧)進行曝氣或密封。
[0093]實驗方法:本實驗中對生物膜的培養和馴化是在填料上進行的，所以首先將填料固定在反應器的每個小單元內，通過拴綁使其均勻的垂直懸掛在每個小格內。然后在每個小格內加入曝氣裝置，以供微生物生長所需的氧氣。本實驗對微生物的培養分別進行厭氧和好氧條件兩個組別的測試。
[0094]第一階段是在好氧條件下培養微生物，分別向兩個小格內加入人工模擬養殖廢水(人工養殖廢水由蔗糖、氯化銨和磷酸二氫鉀加自來水配制，使其C:N:P為100:5:1，再向其中加入IOOmL的養殖廢水，使其COD保持在1000mg/L左右)采用間歇法培養微生物(計量泵不進水，但連續曝氣)，按照0.05%,0.075%和0.1%三個接種比例接入菌種，大約培養好氧掛膜一周結束。具體為加入模擬養殖廢水，連續曝氣接種到填料上，進水COD保持在1000mg/L左右，進行間歇法培養微生物，隔天測試進出水COD數值，一周以后以COD去除率為判斷依據來確定好氧掛膜階段結束及時間點。
[0095]第二階段是在厭氧條件下培養生物膜。反應器第一格停止曝氣，滿足厭氧條件，第二格曝氣。采用間歇法培養厭氧微生物(計量泵不進水)，加入人工養殖廢水(濃度同上不變1000mg/L左右)，按照0.05%、0.075%和0.1%三個接種比例接入菌種，大約培養厭氧掛膜IOd結束。具體為當好氧微生物培養成熟，在好氧微生物的基礎上培養厭氧微生物，撤下曝氣設備，停止曝氣，配水濃度增大到大于1000mg/L，測試進出水C0D，10天以后厭氧細菌培養結束。
[0096]實驗所使用的復合菌種的混合重量比、接種量的數值如表1-2所示。
[0097]本發明所述的微生物制劑的好氧、厭氧掛膜天數如表3所示。
[0098]表1，實驗用多菌種接種重量比例列表
[0099]
【權利要求】
1.一種具有高生物膜掛膜效率的微生物制劑的制備方法，其特征在于，具體步驟包括: 步驟1，枯草芽孢桿菌、硝化刺菌、反硝化短枝單胞菌分別單獨進行好氧通氣發酵培養得菌劑，沼澤紅假單胞菌進行厭氧光照發酵培養得菌劑； 步驟2，將步驟I得到的各菌劑混合，得所需的生物制劑，其中，各菌劑混合的重量比例為枯草芽孢桿菌菌劑5-30%、沼澤紅假單胞菌菌劑10-40%、硝化刺菌菌劑10-60%、反硝化短枝單胞菌菌劑10-40%。
2.根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟I中所述枯草芽孢桿菌好氧通氣發酵培養過程中的培養基，按照重量百分配比，包括:豆柏粉2.0-3.5%、蛋白胨0-1.0%、玉米粉3-4%、葡萄糖0-4%、磷酸氫二鈉0-1%、磷酸二氫鉀0_1%、硫酸銨0_2%、尿素0_1%、水82.5-95%。
3.根據權利要求2所述的制備方法，其特征在于，步驟I中所述的枯草芽孢桿菌與培養基混合的重量比為1-10:90-99，好氧通氣發酵的溫度為30-39°C，時間為1_3天。
4.根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟I中所述的沼澤紅假單胞菌厭氧光照發酵培養過程中的培養基，按照重量百分配比，包括:酵母粉1_2%、乙酸鈉1-5%、硫酸銨1_3%、磷酸二氫鉀0-1%、硫酸鎂0-1%、氯化鈉0.5-1%、水87-99.2%。
5.根據權利要求4所述的制備方法，其特征在于，步驟I中所述的沼澤紅假單胞菌與培養基混合的重量比為1-15:85-99，厭氧光照發酵的溫度為30-38°C，時間為2_10天。
6.根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟I中所述的硝化刺菌厭氧光照發酵培養過程中的培養基，按照重量百分配比，包括:碳酸氫鈉0.1-0.5%、亞硝酸鈉`0.1-0.5%、碳酸鈉 0.1-0.5%、磷酸二氫鉀 0-1%、硫酸鎂 0-1%、氯化鈉 0.5_1%、水 95.5-96.5%。
7.根據權利要求6所述的制備方法，其特征在于，步驟I中所述的硝化刺菌與培養基混合的重量比為3-12:90-99，好氧通氣發酵的溫度為25-35°C，時間為2_7天。
8.根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟I中所述的反硝化短枝單胞菌好氧通氣發酵培養過程中的培養基按照重量百分配比，包括:醋酸鈉0.01-0.05%、硝酸鉀0.01-0.05%、磷酸二氫鉀 0.001-0.002%、氯化鎂 0.001-0.002%、氯化鈣 0.001-0.002%、水99.894-99.97%。
9.根據權利要求8所述的制備方法，其特征在于，步驟I中所述的反硝化短枝單胞菌與培養基混合的重量比為1-8:92-99，好氧通氣發酵的溫度為25-35°C，時間為1_8天。
10.一種采用權利要求1所述的方法制備得到的微生物制劑，其特征在于，包括微生物組分，以微生物組分總量為基準，包括以下重量百分比的菌種: 枯草芽孢桿菌菌劑5-30%、沼澤紅假單胞菌菌劑10-40%、硝化刺菌菌劑10-60%、反硝化短枝單胞菌菌劑10-40%。
【文檔編號】C12N1/20GK103773713SQ201310671373
【公開日】2014年5月7日 申請日期:2013年12月10日 優先權日:2013年12月10日
【發明者】江瀚, 王戌晉 申請人:上海亙卓生物工程有限公司