Nk細胞體外培養方法
【專利摘要】本發明公開了一種NK細胞體外培養方法，屬于人類細胞的培養。本發明用PBS稀釋的赫賽汀與用PBS稀釋人免疫球蛋白，合并后均勻鋪滿培養瓶底，過夜；另取外周血行密度梯度離心，吸取單個核細胞，加入無血清培養基，調整細胞濃度為1.0×106/ml-3.0×106/ml；然后加入細胞因子IL-2、IL-15，加入到用赫賽汀包被的培養瓶中，孵箱培養。這樣在保證了各個細胞亞群擴增倍數的基礎上，促進NK細胞的生長和增殖，增強了淋巴細胞的殺傷活性，無血清培養基替代含血清的完全培養基，所得培養產物的數目和細胞活性相當，實現對NK細胞體外大規模培養，用于NK細胞的臨床生物治療，可以增加其臨床應用的安全性。
【專利說明】NK細胞體外培養方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及人類細胞的培養，具體是一種NK細胞體外培養方法。
【背景技術】
[0002]自然殺傷細胞(natural killer cell, NK)是機體重要的免疫細胞,是機體抵抗腫瘤和病毒感染的第一道防線，不僅與抗腫瘤、抗病毒感染和免疫調節有關，而且在某些情況下參與超敏反應和自身免疫性疾病的發生。在殺傷靶細胞的過程中，NK細胞可以非特異性識別祀細胞，并且不受主要組織相容性復合體(major histocompatibility complex,MHC)的限制，對多種腫瘤細胞有迅速殺傷和溶解作用。但是正常人體外周血中的NK細胞數量較少，僅占外周血淋巴細胞的10%~20%。因此，獲得高質量高純度的NK細胞成為其臨床應用最為關鍵的問題之一。目前，隨著生物治療臨床應用的廣泛開展，NK細胞治療取得了一定的臨床療效。據報道，多種細胞因子組合被廣泛應用于NK細胞的體外培養。已知許多細胞因子如IL-2、IL-7、IL-15、IL-18等單獨或組合均能有效地誘導、刺激特定的NK細胞增殖和促進其分化成熟，其中IL-2和IL-15的作用尤為明顯。
[0003]研究發現，骨髓⑶34+造血干/祖細胞并無抗人白血病K562細胞增殖的能力，只有經過IL-2等細胞因子誘導刺激培養后，⑶34+細胞定向分化為⑶3-⑶56+的NK細胞群才可抑制K562細胞增殖。IL-2具有激活NK細胞、促進NK細胞增殖分化和細胞因子的產生，通過細胞接觸的方式來抑制K562細胞的增殖的特性。IL-15不僅可以上調NK細胞表面的活化性受體，如⑶16和NKG2D，產生大量的IFN- Y，還可以誘導骨髓⑶34+的淋巴細胞分化為NK細胞。IL-2和IL-15聯合應用還可以誘導產生白細胞功能相關抗原_1 (lymphocytefunction-associated anti gen-1, LFA-1),參與效祀細胞結合。
[0004]赫賽汀(Here印tin)是針對HER-2受體的人源化的單克隆抗體，可以與HER-2受體細胞外區域特異性結合，展現出顯著的抗腫瘤效應，因而目前被廣泛應用到HER-2過表達的乳腺癌患者的臨床治療。

【發明內容】

[0005]本發明就是為了解決現有技術中NK細胞體外大規模培養的問題，而提供一種NK細胞體外培養方法。
[0006]本發明系采用單克隆抗體聯合細胞因子的方法，在保證NK細胞體外擴增倍數、細胞比例的前提下，提高擴增產物的殺傷活性。
[0007]本發明是按照以下技術方案實現的。
[0008]一種NK細胞體外培養方法，該方法是按照以下步驟進行的:
a.用PBS稀釋Herceptin至濃度0.85-1.05mg/ml,取910 μ I ;用PBS稀釋人免疫球蛋白至濃度l_2mg/ml，取400μ 1，合并后再用PBS補齊至20ml，均勻鋪滿培養瓶瓶底，密封置于4°C冰箱中過夜，次日取出，將液體倒出，用PBS洗2遍；
b.取外周富集血4-10ml，用Ficoll法進行密度梯度離心，離心速度為350X g，離心時間為15-20分鐘，吸取中間界面層的單個核細胞，用PBS洗滌3次，加入無血清培養基，調整細胞濃度為1.0 X 106/ml-3.0 X 106/ml ;然后加入細胞因子IL-2至終濃度10ng/ml，IL-15至終濃度50ng/ml，加入到已經用Herc印tin包被的培養瓶中，37°C，5% CO2孵箱中連續培養15天,每3天補加含20ng/ml的IL-2和100ng/ml的IL-15的無血清培養基一次,補液量與補液前液體量相同，即補液后體積為補液前的2倍。
[0009]這樣設計的本發明可以高效、安全的進行NK細胞體外大規模培養。由于加入Herceptin，在保證各個細胞亞群擴增倍數的基礎上，又增強了淋巴細胞的殺傷活性；無血清培養基可替代含血清的完全培養基，二者所得培養產物的數目和細胞活性相當，而且無血清培養基用于NK細胞的臨床生物治療，可以增加其臨床應用的安全性；細胞因子IL -2聯合IL 一 15可以促進NK細胞的生長和增殖，可提高活化免疫細胞的殺傷活性。并分別從細胞擴增倍數、細胞表型以及細胞表面活化受體的表達等方面來檢測擴增產物的殺瘤活性。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0010]圖1是擴增產物的擴增倍數的對比圖；
圖2是擴增產物的細胞表型的對比圖；
圖3是擴增產物的殺傷活性對比圖；
圖4是擴增產物NK細胞表面活化受體表達對比圖；
圖5是擴增產物NKT細胞表面活化受體表達對比圖；
圖6是擴增產物T細胞表面活化受體表達對比圖。
【具體實施方式】
[0011]下面結合附圖及實施例對本發明進行詳細的說明。
[0012]一種NK細胞體外培養方法，該方法是按照以下步驟進行的:
a.用PBS稀釋Herceptin至濃度0.85-1.05mg/ml,取910 μ I ;用PBS稀釋人免疫球蛋白至濃度l_2mg/ml，取400μ 1，合并后再用PBS補齊至20ml，均勻鋪滿培養瓶瓶底，密封置于4°C冰箱中過夜，次日取出，將液體倒出，用PBS洗2遍；
b.取外周富集血4-10ml，用Ficoll法進行密度梯度離心，離心速度為350X g，離心時間為15-20分鐘，吸取中間界面層的單個核細胞，用PBS洗滌3次，加入無血清培養基，調整細胞濃度為1.0 X 106/ml-3.0 X 106/ml ;然后加入細胞因子IL-2至終濃度10ng/ml，IL-15至終濃度50ng/ml，加入到已經用Herc印tin包被的培養瓶中，37°C，5% CO2孵箱中連續培養15天,每3天補加含20ng/ml的IL-2和100ng/ml的IL-15的無血清培養基一次,補液量與補液前液體量相同，即補液后體積為補液前的2倍。
[0013]一、材料
赫賽汀(Herceptin, Trastuzumab)配方為:曲妥珠單抗440mg,稀釋液為含1.1%苯甲醇的20ml滅菌注射用水,溶解后的曲妥珠單抗濃度為21mg/ml。購自Roche Pharma(瑞士)公司；
靜注人免疫球蛋白(Human Immunoglobulin for Intravenous Injection, 5%)配方為:人免疫球蛋白(Y球蛋白)含量不低于95%，其余主要為微量的白蛋白和痕跡量的IgA和IgM。購自中國成都蓉生藥業有限責任公司；
磷酸鹽緩沖液(PBS) pH=7.4的0.01mol/L，市售；
細胞因子IL-2和IL-15，購自美國PEPRO TECH公司；
培養瓶 175cm2，購自 CORNING INCORPORATED 公司；
無血清培養基，免疫細胞療法研究用無血清培養液ALyS505N-0，日本細胞科學研究所株式會社。
[0014]二、方法
1.用Herceptin和人免疫球蛋白包被板子
用PBS稀釋Herc印tin (2lmg/ml)和人免疫球蛋白(5%)至濃度分別為0.95mg/ml和lmg/ml ,混勻后,用稀釋好的Herceptin和人丙球蛋白進行包被板子,均勻的鋪滿瓶底,置于4 °C冰箱中過夜，次日取出，將液體倒出，用PBS洗2遍。
[0015]2.外周血的制備
取外周血4-10ml，用Ficoll法進行密度梯度離心，離心速度為350 X g，15-20分鐘，吸取中界面層的單個核細胞用PBS洗滌3次。加入無血清培養基，調整細胞濃度為2.0X IO6/ml，然后加入細胞因子IL-2至終濃度10ng/ml，IL-15至終濃度50ng/ml，分別加入新的培養瓶(方案I)和已經用Herc印tin包被的培養瓶中(方案2)。37°C，5%C02孵箱中連續培養15天，每3天補加含細胞因子IL-2 (20ng/ml)+IL-15 (100ng/ml)的無血清培養基一次，補液量為目前液體量的2倍，補充所需的刺激因子以保持細胞因子的濃度不變。
[0016]提前一天用Herceptin和人免疫球蛋白進行包被板子,Herceptin可以提高NK細胞擴增產物的殺傷活性、粘附能力和細胞因子的分泌，這樣，在保證擴增數目的基礎上，提高擴增產物的殺瘤活性。
[0017]由于加入細胞因子IL 一 2聯合IL 一 15，促進NK細胞的增殖分化，提高活化免疫細胞的殺傷活性。
[0018]無血清培養基與含血清培養基相比，二者所得培養產物的數目和細胞活性相當，無血清培養基用于NK細胞的臨床生物治療，增加其臨床應用的安全性。
[0019]3.細胞表型的檢測
分別收集0d，5d，10d, 15d的細胞，調整細胞濃度為lX105/ml,分別標記PerCP_CD3，PE-CD4，FITC-CD8，FITC_CD45Ro，FITC_CD45Ra，PerCP_CD45, PE-CCR7 (標記 T 細胞亞群)，PerCP-CD4，PE-CD25，APC-CD127 (標記 Treg 細胞);FITC_CD3，PE-CD16CD 56 (標記 NK, NKT細胞)；FITC-CD158a/h, FITC_CD158b, FITC- Mouse IgG2 α，PE- Mouse IgG2 α (標記 KIR表型)；APC-NKp30, APC-NKp44, APC-NKG2D, APC-CD16，647_NKp46，647-DNAM-l (標記細胞表面活化受體);同時標記APC-1gGl, 647-1gGl對照進行免疫分型檢測。
[0020]4.NK細胞殺傷活性的檢測
采用LDH釋放法檢測其殺傷活性。調整效應細胞密度至4X106/ml，靶細胞密度至
IX 105/ml。取96孔圓底培養板，每個樣本做3個復孔，按效靶比40:1加入效應細胞與靶細胞，并設效應細胞自然釋放對照孔(每孔100 ul效應細胞+100 ul培養液)，靶細胞對照孔設最大和最小孔(每孔100 ul靶細胞+100 ul培養液)，并設本底和體積糾正孔(每孔200 ul培養液)，將培養板放置37°C，5%C02孵箱4 h，在最大孔和體積糾正孔內加入20 ul的裂解緩沖液，放置30 min。以800Xg的轉速離心10 min后，每孔吸取50 ul上清到相應平底培養板，再在避光的條件下加50 ul反應底物，室溫避光2(T30 min，待各孔液體顏色轉深，加終止液50 ul/孔。將96孔板置于酶標儀檢測492nm波長處的吸光度(D)值。按下列公式計算殺傷率:殺傷率(％)=(實驗孔D值-效應細胞自然釋放孔D值-靶細胞自然釋放孔D值+本底糾正孔D值)/ (靶細胞最大釋放孔D值-靶細胞自然釋放孔D值-體積糾正孔D值+本底糾正孔D值)X 100%，參見圖3。
[0021]二、結果
1.培養產物的擴增倍數和細胞表型的影響
方案I (未加Herc印tin)、2 (WTvHeraptin)的總擴增倍數分別為37.6±26.31，44.82±6.84 ;NK細胞的擴增倍數分別為89.60±57.17，102.81 ±94.06 ；NKT的擴增倍數257.01 ±149.73，362.74±208.86; T 的擴增倍數 37.18±16.84，43.20±14.75 ;兩種方案都可以在擴增NK細胞的基礎上，同時擴增NKT細胞和T細胞。方案2中Herceptin的加入對于總擴增倍數以及各個細胞亞群擴增倍數無明顯影響。但是，Herc印tin的加入可以降低⑶158b的表達，并具有統計學意義Gd < 0.05)參見圖1、圖2。
[0022]2.細胞表面活化受體表達
分別收集方案I (不加Herceptin)和方案2 (加Herceptin)培養0d, 5d, 10d, 15d的細胞，調整細胞濃度為IX 105/ml，用流式細胞儀檢測并分別比較2種培養方案培養產物各個細胞表型以及各個細胞亞群表面活化受體的表達；Herc印tin的加入，提高NK細胞表面活化受體NKp44的表達Gd < 0.05)余無統計學意義，參見圖4_6。
[0023]3.擴增產物殺傷活性
分別收集方案I (不加Herc印tin)和方案2 (加Herc印tin)培養15d后的細胞，以多種癌細胞系作為靶細胞測定擴`增產物的殺傷活性。調整效應細胞和靶細胞的濃度，使其校靶比為40:1，用LDH釋放法檢測2種方案擴增產物對于各種靶細胞系的殺傷。Herc印tin加入之后可以顯著提高擴增產物對于各種靶細胞系的殺傷作用(P < 0.05)，參見圖3。
【權利要求】
1.一種NK細胞體外培養方法，該方法是按照以下步驟進行的: a.用PBS稀釋Herceptin至濃度0.85-1.05mg/ml,取910 μ I ;用PBS稀釋人免疫球蛋白至濃度l_2mg/ml，取400μ 1，合并后再用PBS補齊至20ml，均勻鋪滿培養瓶瓶底，密封置于4°C冰箱中過夜，次日取出，將液體倒出，用PBS洗2遍； b.取外周富集血4-10ml，用Ficoll法進行密度梯度離心，離心速度為350X g，離心時間為15-20分鐘，吸取中間界面層的單個核細胞，用PBS洗滌3次，加入無血清培養基，調整細胞濃度為1.0 X 106/ml-3.0 X 106/ml ;然后加入細胞因子IL-2至終濃度10ng/ml，IL-15至終濃度50ng/ml，加入到已經用Herc印tin包被的培養瓶中，37°C，5% CO2孵箱中連續培養15天,每3天補加含20ng/ml的IL-2和100ng/ml的IL-15的無血清培養基一次,補液量與補液前液體量相同，即補液后體積為補液前的2倍。
2.根據權利要求1所述NK細胞體外大規模培養方法，其特征在于:PBS稀釋的Herceptin 至濃度 0.95mg/ml。
3.根據權利要求1所述NK細胞體外大規模培養方法，其特征在于:PBS稀釋5%的人免疫球蛋白至濃度lmg/ml。
4.根據權利要求1所述NK細胞體外大規模培養方法，其特征在于:吸取中間界面層的單個核細胞，用PBS洗滌 3次，加入無血清培養基，調整細胞濃度為2.0X 106/ml。
【文檔編號】C12N5/0783GK103627672SQ201310691566
【公開日】2014年3月12日 申請日期:2013年12月17日 優先權日:2013年12月17日
【發明者】任秀寶, 于津浦 申請人:天津醫科大學附屬腫瘤醫院