一種二化螟細胞的原代培養方法
【專利摘要】本發明公開了一種二化螟細胞的原代培養方法。包括如下步驟：（1）將二化螟幼蟲浸沒在乙醇溶液中，表面消毒，清洗吹干蟲體；（2）將蟲體置于解剖蠟盤中，解剖二化螟，取出需要建立細胞系的組織或器官，清洗；（3）置于預先盛有細胞培養液的細胞培養瓶中，放入細胞培養箱中培養，過夜后，待組織或器官貼壁后，再加入細胞培養液；（4）每隔幾天吸出和換入細胞培養液，直至擴展并增殖的細胞充滿培養瓶；（5）把含有新增殖出的單個細胞，連同全部的細胞培養液吸出放入新培養瓶中，將兩個培養瓶放入培養箱中培養至細胞系建立初步成功。本發明有助于在離體條件下研究二化螟，為其防治途徑的研究和開發提供幫助。
【專利說明】一種二化螟細胞的原代培養方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及屬于昆蟲細胞培養【技術領域】，尤其涉及一種二化螟細胞的原代培養方法。
【背景技術】
[0002]隨著生命科學的迅猛發展，在生物工程【技術領域】中，細胞工程已愈來愈受到重視。培養昆蟲細胞作為研究材料，一直是細胞生物學、分子生物學和生物化學以及昆蟲毒理學等科學研究的重要方面。
[0003]自從Grace在1962年首次建立天蠶蛾細胞系以來，昆蟲細胞培養技術得到了迅速發展，目前已建立了 800多株昆蟲細胞系，主要集中于鱗翅目、雙翅目(潘李珍等，1980，1989 ;曾慶韜等，1998)、鞘翅目(Lynn et al., 1995; Iwabuchi, 1999; Stiles,1992)、直翅目(Heinandez-Crespo et al., 2000)、膜翅目、同翅目和半翅目等,其中大部分來自鱗翅目和雙翅目，來源于其他目的昆蟲細胞系僅占1/10左右(張寰等，2007 )。昆蟲細胞系的建立，不但促進了昆蟲生物學方面的基礎研究，也大大促進了基于昆蟲細胞的應用性研究。其中，昆蟲細胞-桿狀病毒表達系統(BEVS)是當今最具高效的真核表達系統，已廣泛應用于干擾素等外源基因的表達。
[0004]在所建立的昆蟲細胞系中，研究和應用最多的是黑腹果蠅iDrosophila
S2 細胞系、粉紋夜蛾/?i)的 BT1-Tn-5B1_4 (High Five)細胞系和草地貪夜蛾/r^§7>6?r￡/a)Sf21細胞系及其克隆株Sf9等。相對于已知的上百萬種昆蟲以及昆蟲細胞系的廣泛用途來`說，已經建立的細胞系還遠遠不夠，仍需要建立更多的昆蟲細胞系以滿足實際需要。
[0005]二化螟suppressalis (Walker)屬鱗翅目，螟蛾科,是我國水稻上危害最為嚴重的常發性害蟲之一，在分蘗期受害造成枯鞘、枯心苗，在穗期受害造成蟲傷株和白穗，一般年份減產3%~5%，嚴重時減產在3成以上。除危害水稻外，二化螟還危害玉米、甘蔗、粟、蠶豆、茭白、高粱、油菜、小麥、紫云英等作物。二化螟有很強的適應能力，能快速適應不利環境(如抗性品種和殺蟲劑)，其致害性能快速變異。在二化螟的防治過程中，新型生物農藥的篩選和鑒定日益成為研究重點。生物農藥的活動生物測定需要大量發育一致的二化螟試蟲，對飼養場地要嚴格的要求，工作量大，而若有離體培養的二化螟細胞，則可以在離體條件下研究生物農藥對二化螟的作用，從而有助于在細胞水平研究殺蟲劑對二化螟的作用機制，有助于當前殺蟲劑的改進和新殺蟲劑的發明。目前，關于二化螟細胞的體外培養技術及二化螟細胞系，還未見報道。因此，通過本發明，建立二化螟細胞系，不僅能增加我國新昆蟲細胞系的數量及種類，還能為日后該類昆蟲細胞系的建立提供借鑒經驗。

【發明內容】

[0006]本發明的目的是克服現有技術的不足，提供一種二化螟細胞的原代培養方法。
[0007]二化螟細胞的原代培養方法的步驟如下:(1)在無菌條件下，將二化螟幼蟲浸沒在70%或75%乙醇溶液中，進行表面消毒10~20分鐘，用無菌蒸餾水清洗二化螟幼蟲3~5次，用無菌濾紙吸干蟲體或用吹風機吹干蟲體；
(2)將蟲體置于用70%或75%乙醇消毒過的解剖蠟盤中，用解剖針將頭尾固定，解剖二化螟，取出需要建立細胞系的組織或器官，將組織或器官放入盛有HBSS清洗液的培養皿中，清洗2~3次，然后再用細胞培養液清洗組織或器官；
(3)將清洗過的組織或器官置于預先盛有0.5mL~ImL細胞培養液的T-25cm2細胞培養瓶中，放入27°C無光照的細胞培養箱中培養，過夜后，待組織或器官貼壁后，再加入2mL細胞培養液，使組織塊完全或大部分浸沒在該培養液中；
(4)每隔7~10天吸出和換入50%~70%量的細胞培養液，直至擴展并增殖的細胞充滿培養瓶；
(5)把含有新增殖出的單個細胞，連同全部的細胞培養液吸出放入新培養瓶中，加入新的細胞細胞培養液，而原含有組織塊的培養瓶中再加入同吸出量同樣多的新的細胞細胞培養液，將兩個培養瓶放入培養箱中培養至細胞系建立初步成功。
[0008]所述的細胞培養液是昆蟲細胞培養液與青霉素、鏈霉素、兩性霉素B和動物血清的混合物，PH值為6.0-6.8。所述的昆蟲細胞培養液選自TNM-FH，所述的動物血清為胎牛血清。所述的青霉素含量為200U/ml,鏈霉素含量為0.2 μ g /ml,兩性霉素B含量為0.5 μ g/ml ο所述的動物血清體積比含量為10-20%。
[0009]本發明的有益效果是:采用上述方案，對二化螟多種組織進行了原代培養，取得了較好的培養效果。本發明快速、有效、重復性強，是對鱗翅目昆蟲細胞培養的重要補充。二化螟為水稻重要害蟲，本發明有 助于在離體條件下研究二化螟，為其防治途徑的研究和新型生物農藥的開發提供幫助。
[0010]【專利附圖】

【附圖說明】圖1是培養24小時后脂肪體細胞的培養形態圖；
圖2是培養15天后脂肪體細胞的培養形態圖；
圖3是培養30天后脂肪體細胞的培養形態圖；
圖4是培養2天后血淋巴細胞的培養形態圖；
圖5是培養16天后血淋巴細胞的培養形態圖；
圖6是培養30天后血淋巴細胞的培養形態圖。
【具體實施方式】
[0011]二化螟細胞的原代培養方法的步驟如下:
(1)在無菌條件下，將二化螟幼蟲浸沒在70%或75%乙醇溶液中，進行表面消毒10~20分鐘，用無菌蒸餾水清洗二化螟幼蟲3~5次，用無菌濾紙吸干蟲體或用吹風機吹干蟲體；
(2)將蟲體置于用70%或75%乙醇消毒過的解剖蠟盤中，用解剖針將頭尾固定，解剖二化螟，取出需要建立細胞系的組織或器官，將組織或器官放入盛有HBSS清洗液的培養皿中，清洗2~3次，然后再用細胞培養液清洗組織或器官；
(3)將清洗過的組織或器官置于預先盛有0.5mL~ImL細胞培養液的T-25cm2細胞培養瓶中，放入27°C無光照的細胞培養箱中培養，過夜后，待組織或器官貼壁后，再加入2mL細胞培養液，使組織塊完全或大部分浸沒在該培養液中；
(4)每隔7~10天吸出和換入50%~70%量的細胞培養液，直至擴展并增殖的細胞充滿培養瓶；
(5)把含有新增殖出的單個細胞，連同全部的細胞培養液吸出放入新培養瓶中，加入新的細胞細胞培養液，而原含有組織塊的培養瓶中再加入同吸出量同樣多的新的細胞細胞培養液，將兩個培養瓶放入培養箱中培養至細胞系建立初步成功。
[0012]所述的細胞培養液是昆蟲細胞培養液與青霉素、鏈霉素、兩性霉素B和動物血清的混合物，PH值為6.0-6.8。所述的昆蟲細胞培養液選自TNM-FH，所述的動物血清為胎牛血清。所述的青霉素含量為200U/ml,鏈霉素含量為0.2 μ g /ml,兩性霉素B含量為0.5 μ g/ml ο所述的動物血清體積比含量為10-20%。
[0013]以下結合實例對本發明作進一步的詳細說明:
實施例1
二化螟幼蟲脂肪體細胞的原代培養 經過下列步驟:
(1)在無菌操作臺內(以下操作都在無菌條件下，所使用器具都要經過滅菌或消毒處理)將二化螟老熟幼蟲I頭浸沒在70%的乙醇溶液中10分鐘，進行表面消毒，用無菌蒸餾水清洗二化螟老熟幼蟲3次，用無菌濾紙吸干二化螟老熟幼蟲體或用吹風機吹干二化螟老熟幼蟲體；
(2)將吹干二化螟老熟幼蟲體置于用70%消毒過的解剖蠟盤中，用解剖針將頭尾固定，用消毒解剖剪從背部剪開二化螟，再用解剖針將蟲體固定住，用彎頭鑷子取出脂肪體組織，操作時盡量保持其完整，注意不能觸破昆蟲的消化道等同體外直接相連的部分；` (3)將脂肪體放入盛有HBSS清洗液(含200U/ml的青霉素，0.2 μ g /ml的鏈霉素，
0.5 μ g /ml的兩性霉素B)的培養皿中，用HBSS清洗液清洗脂肪體2次，然后再用細胞培養液清洗脂肪體I次；
(4)將清洗過的脂肪體置于預先盛有0.5mL細胞培養液的T-25cm2細胞培養瓶中，放入27°C無光照的細胞培養箱中培養，過夜后，待脂肪體貼壁后，再加入2mL細胞培養液，使脂肪體大部分浸沒在該培養液中，注意在加液的時候勿使脂肪體懸浮在細胞培養液中；
(5)每隔7天吸出50%量的細胞培養液，并同時換入吸出量的新的培養液，在上述操作后24小時后可觀察到組織塊在離體并在上述培養條件下，很快從其周圍游離出大量單個的細胞(見圖1);第15天后見到細胞不斷增值并逐漸充滿整個培養瓶(見圖2);第30天后，增殖細胞充滿整個培養瓶(見圖3)，把含有新增值的細胞，連同全部的細胞培養液吸出放入新培養瓶中，并加入2mL新的細胞培養液，而原含有組織塊的培養瓶中再加入同吸出量同樣多的新的細胞培養液。兩個培養瓶放入培養箱中培養，標志著原代培養成功，細胞開始傳代。二化螟幼蟲脂肪體細胞系初步建立成功。
[0014]實施例2
二化螟幼蟲血淋巴細胞的原代培養
(1)在無菌操作臺內(以下操作都在無菌條件下，所使用器具都要經過滅菌或消毒處理)將二化螟老熟幼蟲I頭浸沒在75%的乙醇溶液中20分鐘，進行表面，用無菌蒸餾水清洗二化螟老熟幼蟲5次，用無菌濾紙吸干二化螟老熟幼蟲體或用吹風機吹干二化螟老熟幼蟲體；
(2)將吹干二化螟老熟幼蟲體置于用75%消毒過的解剖蠟盤中，用解剖針將頭尾固定，用消毒解剖剪從背部剪開二化螟，用20 μ L移液器吸取血淋巴放入裝有HBSS清洗液(含200U/ml的青霉素，0.2 μ g /ml的鏈霉素，0.5 μ g /ml的兩性霉素B)的培養瓶中，擰緊蓋子，靜止放置15分鐘。注意不能觸破昆蟲的消化道等同體外直接相連的部分；
(3)待血淋巴細胞貼壁后，用移液器吸除HBSS清洗液，加入新鮮的HBSS清洗液，重復3次，以防止黑化現象的發生，在第3次吸除HBSS清洗液后，加入2mL細胞培養液，擰緊瓶蓋，將培養瓶放入27°C無光照的細胞培養箱中培養；
(4)每隔10天吸出70%量的細胞培養液，并同時換入吸出量的新的培養液。
[0015](5)在上述操作后2天后可觀察到大量增殖的單個細胞(見圖4)并逐漸向外圍擴展；第16天后見到細胞不斷拉絲生長，增值并充滿整個培養瓶(見圖5);第30天后見到增殖細胞充滿整個培養瓶(見圖6);把含有新增值的細胞，連同全部的細胞培養液吸出放入新培養瓶中，按照1:5 (細胞體積:最后培養液體積)進行傳代培養。二化螟幼蟲血淋巴細胞系初步建 立成功。
【權利要求】
1.一種二化螟細胞的原代培養方法，其特征在于，包括如下步驟: (1)在無菌條件下，將二化螟幼蟲浸沒在70%或75%乙醇溶液中，進行表面消毒10~20分鐘，用無菌蒸餾水清洗二化螟幼蟲3~5次，用無菌濾紙吸干蟲體或用吹風機吹干蟲體； (2)將蟲體置于用70%或75%乙醇消毒過的解剖蠟盤中，用解剖針將頭尾固定，解剖二化螟，取出需要建立細胞系的組織或器官，將組織或器官放入盛有HBSS清洗液的培養皿中，清洗2~3次，然后再用細胞培養液清洗組織或器官； (3)將清洗過的組織或器官置于預先盛有0.5mL~ImL細胞培養液的T-25cm2細胞培養瓶中，放入27°C無光照的細胞培養箱中培養，過夜后，待組織或器官貼壁后，再加入2mL細胞培養液，使組織塊完全或大部分浸沒在該培養液中； (4)每隔7~10天吸出和換入50%~70%量的細胞培養液，直至擴展并增殖的細胞充滿培養瓶； (5)把含有新增殖出的單個細胞，連同全部的細胞培養液吸出放入新培養瓶中，加入新的細胞細胞培養液，而原含有組織塊的培養瓶中再加入同吸出量同樣多的新的細胞細胞培養液，將兩個培養瓶放入培養箱中培養至細胞系建立初步成功。
2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的細胞培養液是昆蟲細胞培養液與青霉素、鏈霉素、兩性霉素B和動物血清的混合物，pH值為6.0-6.8。
3.根據權利要求2所述的方法，其特征在于，所述的昆蟲細胞培養液選自TNM-FH，所述的動物血清為胎牛血清。
4.根據權利要求2所述的方法，其特征在于，所述的青霉素含量為200U/ml，鏈霉素含量為0.2 μ g /ml,兩性霉素B含量為0.5 μ g /ml。
5.根據權利要求2所述的方法``，其特征在于，所述的動物血清體積比含量為10-20%。
【文檔編號】C12N5/07GK103820381SQ201410030210
【公開日】2014年5月28日 申請日期:2014年1月23日 優先權日:2014年1月23日
【發明者】俞曉平, 劉光富, 許益鵬 申請人:中國計量學院